幽门螺旋杆菌感染对胃上皮细胞RECK基因的影响

幽门螺旋杆菌感染对胃上皮细胞RECK基因的影响 幽门螺旋杆菌感染对胃上皮细胞RECK基 因的影响 实用癌症杂志2010年11月第25卷笠塑!!塑』婴,!!垄. 幽门螺旋杆菌感染对胃上皮细胞RECK基因的影响 张雪梅蒋洁梁晓秋 ? 579? 【摘要】目的研究幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori,Hp)感染对胃上皮细胞(GES一1)RECK基因启动子区域的甲 基化以及mRNA达水平的影响,并探讨其可能的致癌机制.方法用培养的Hp感染GES一1细胞0,144h.采用甲 基化特异性聚合酶链式反应法检测RECK基因启动子区域的甲基化情况;逆转录PCR检测RECK基因mRNA水平; Westernblot检测核转录因子(NF.KB)的激活情况,并观察用NF—KB特异性抑制剂PDTC处理后的RECK的mRNA水平. 结果Hp感染GES一1细胞0,72h不能诱导RECK基因甲基化,感染96h后GES一1细胞内出现了明显的RECK基因甲 基化,同时能降低RECK基因mRNA水平.Hp感染24h后能激活其NF—KB,24,72hNF—KB活性水平无明显改变.感 染96h后NF—KB的活性有所增强,NF—KB特异性抑制剂PDTC能上调RECK基因的表达.结论Hp感染通过诱导 RECK基因启动子区域的甲基化,促进NF—KB激活,降低RECK基因的表达,这可能是Hp致胃癌的可能机制之一. 【关键词】幽门螺旋杆菌;RECK基因;核转录因子KB;胃上皮细胞 中图分类号:R735.2文献标识码:A文章编号:1001—5930(2010)06-0579-04 EffectsofHelicobacterPyloriInfectiononGastricEpithelialCellsExpressionof RECKGene ZHANGXue—mei,JIANGJie,LIANGXiao— qiu.DepartmentofBasicalMedicine,HuaihuaMedicalCollege,Huaihua,418000 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatethemethylationandmRNAlevelofRECKgeneinducedbyHelicobacterpyloriin gastricepithelialcell,andtostudyitspossiblemechanismofgastriccancer.MethodsCulturedGES一1cellswereinfectedbyH. pylorifor0, 144h,methylationofRECKgenepromoterregionwasacessessedbymethylation— specificPCR(MSP).ThemRNA levelofRECKgenewasdetectedbyRT— PCR.Westernblotwasusedtoassessactivationofnuclearfactor—KB(NF—KB). PDTC,aspecificinhibitorofNF— KB,wasusedtoassesstheRECKgenemRNAexpression.ResultsNospecificMSPbandhad beendetectedwhenGES一 1hadbeeninfectedbyH.pylorifor72h.96hafterinfection,amethylationbandappeared,andmRNA levelofRECKdecreasedatthistime.NF—KBwasactivatedwhenGES一 1cellshadbeeninfectedfor24h,after96h,theactivityof NF—KBincreased.NF— KBspecificinhibitorsPDTCcouldincreasetheexpressionofRECKgene.ConclusionH.pyloricouldin— duceRECKpromoterregionmethylation,activateNF— KB,anddecreasethemRNAlevelofRECKgeneinGES一1cells,whichmay beoneofthepathogenesisinH.pylori—inducedgastriccancer. 【Keywords】Helicobacterpylori(Hp);Reversioninducingcysteine— richproteinwithkazalmotifsgene(RECKgene); Nuclearfactor—KB(NF—KB);Gastricepithelialcell (ThePracticalJournalofCancer,2010,25:579,582) 幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori,Hp)与胃癌的 发生密切相关,但其机制尚未完全阐明.研究表 明J,在胃癌的发生过程中,肿瘤细胞侵袭转移能力 的强弱与基质金属蛋白酶(matrixmetallopr0Ieinases, MMP)的活性密切相关.RECK(reversioninducingcys— teine—richproteinwithkazalmotifs)基因是近年来发现 的新型MMP抑制剂,可以从多个方面抑制MMPs的活 性,从而起到抑制肿瘤生长的作用.RECK基因在大 部分正常细胞株及正常组织中均有表达,但在多种肿 作者单位:418000湖南省怀化医学高等专科学校基础医学部(张雪 梅,蒋洁);421001南华大学肿瘤研究所(梁晓秋) 瘤组织及细胞株中不表达或低表达;RECK基因表达 量高的肿瘤组织中,肿瘤侵袭性少见,患者的生存率要 高于低表达者.本研究拟从体外培养Hp,并模拟 其感染胃上皮细胞GES.1,观察其对NF—KB的作用和 对RECK基因表达的影响,从而探讨Hp可能的致癌 机制. 1材料与方法 1.1试剂 胞浆一核蛋白抽提试剂盒,BCA蛋白定量试剂盒购 自江苏碧云天公司.基因甲基化特异性PCR扩增 (MSP)试剂盒购自Chemicon.WizardDNA纯化试剂 ? 580?塞疸垂杂志2010年11月第25卷第6期ThePracticalJoumalofCancer, November2010.V0125.No.6 盒,RT?PCR试剂盒(RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0)分 别为Promege及大连宝生物公司产品. 1.2细胞及细胞培养 人胃上皮细胞GES.1由中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所提供,于无抗生素的含10%FBS的 DMEM培养基,37~C,5%CO的培养箱中培养.取处 于对数生长期的细胞,用新鲜培养液吹打细胞使之成 均匀单细胞悬液,按所需数量接种于细胞培养瓶或培 养板中继续培养以进行相关实验. 1.3Hp感染实验 Hp接种于哥伦比亚琼脂平板培养平皿中于 37?,85%N2,10%CO2和5%O2的饱和湿度环境中 培养.待Hp接种后2,3天后用于实验或传代培养. 刮取接种2,3天后生长状态良好的Hp,稀释于 不含血清和抗生素的GES.1的培养基中,根据OD值 调整Hp的浓度,使感染复数(multiplicityofinfection, MOI)与细胞的比例为0.5:1,于37?,5%CO,,饱和 湿度及无血清的环境中继续培养.24,36h后PBS 洗涤3遍,消化换液,再次调整MOI,使之恒定维持在 0.5:1,连续感染72,144h. 1.4甲基化特异PCR检测RECK启动子区域甲基化 采用甲基化和非甲基化引物对化学修饰后的 DNA进行扩增,扩增条件为:95?预变性10min; 95?变性30S,56%复性30S,72?延伸30S.共计40 jI{!盼t间(h) 200b一 100b+ 500b+ 400b+ 甲基化 眦K 次,末次循环后72?7min. 1.5RT-PCR检测RECKmRNA表达 提取细胞RNA后,逆转录成cDNA,以GAPDH为 内参,按以下条件进行PCR扩增:95?10min,随后进 入35个循环:95?30S,60oC30S,72oC30S.最终 72?5min. 1.6Westernblot检测NF—KB的活化 处理结束后,采用核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白. BCA定量后取20l核蛋白进行SDS.PAGE.电泳结 束后转膜,孵育anti—p65多克隆抗体(SantaCruz),洗 膜,孵育二抗(武汉博士德),ECL显影(Pierce).同时 采用组蛋白H3抗体作为内参(Upstate). 2结果 2.1Hp诱导胃上皮细胞GES一1RECK基因甲基化 MSP结果显示,当Hp感染GES一1细胞0—72h, 尚未检测出RECK基因甲基化条带,而在该时问段内, 能检测出明显的非甲基化条带.当Hp感染96h后, MSP能检测出微量的RECK甲基化条带(图1A),而 此时非甲基化条带与对照组相比有所减弱(图1B). 感染144h后,GES一1细胞内出现了明显的甲基化 RECK条带,此时非甲基化条带明显减弱.在所有组 别中,内参GAPDH保持恒定. 200bp 100bp ~t,PDI-I500 4o0 刺激时间(}1) 阴性对照—— 247296144 AB 图1Hp感染对GES一1细胞RECK基因启动子甲基化的影响 A为甲基化RECK基因;B为非甲基化RECK基因 2.2Hp感染胃上皮细胞GES-1后对RECK基因表达 的影响 Hp感染GES-1细胞96h后,RT—PCR结果显示, 与对照组相比,RECK基因mRNA水平明显降低(图 2).内参在所有时间段保持恒定(图2). 500bp 400bp 500 400 甲基化 RE(=l( 刺激时间m) f嚣性对照—— 图2Hp感染对GES一1细胞中RECK基因mRNA的表达情况 实用癌症杂志2010年1月第2鲞箜塑!翌』里I1f!竺!,!!堑: 2.3Hp感染GES.1细胞能激活NF—KB Westernblot结果显示,与对照组相比,Hp感染24 h后即可检测出NF.KBp65蛋白转移至核内,24,72h 时间段,NF—KB激活水平无明显改变(图3).但当感 染至96h后,NF.KB的活性有所增强.而内参组蛋白 则在所有时间段无变化(图3). 阴性对照247296144 —一簟——蛋白 图3Hp感染对GES一1细胞中NF—KBp65蛋白 核转位的影响 2.4NF—KB特异性抑制剂PDTC能部分逆转Hp诱导 的RECK基因的低表达 GES一1细胞在感染Hp的同时,加入25MPDTC 共孵育,RT—PCR显示,PDTC能在144h后明显增强 RECK基因mRNA的表达(图4),而内参照GAPDH无 明显改变. 500 4o0 50o 40O Hp感染}lp揎染+PDTc P1)H 图4PDTC对Hp诱导RECKmRNA低表达的影响 3讨论 Hp确切的致癌机制至今仍不清楚.国内外大多 数研究采用胃癌细胞株如AGS,KATO?及MKN45等 作为研究对象.事实上,这些已发生恶性转化的细胞 并不能真实地反映正常胃黏膜上皮细胞的病变过程. Hp的致病物质包括CagA,VacA等,用这些单一的致 病物质研究其与细胞的相互作用显然也无法反映正常 的致病机制.即使部分研究采用GES一1等细胞株作为 研究对象,由于Hp浓度,感染时间的不同,最终结果 不尽一致.在本研究当中,我们用低浓度的Hp感 ? 58l? 染正常的胃上皮细胞株,相对而言,更加有利于真实地 反应Hp感染后可能带来的病变效应. 本研究采用MSP法研究了RECK基因的甲基化 情况,其原理是DNA经亚硫酸盐处理后,非甲基化的 胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变. 在进行PCR反应时,通过设计两套不同的引物达到扩 增甲基化DNA:其一引物序列来自经处理后的甲基化 DNA链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位 点发生了甲基化;另一引物对来自经处理后的非甲基 化DNA链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测 位点没有甲基化J. 本研究显示,Hp感染GES.1细胞后发现,0,72h 内,RECK基因启动子区域无明显的甲基化,但当感染 时间达96h后,RECK基因有轻度的甲基化,而144h 后则可明显观察到甲基化的RECK基因.相应的,非 甲基化RECK基因在72h内无明显改变,144h后非 甲基化RECK基因明显减少.RECK作为新的抑癌基 因,启动子区域往往呈甲基化状态而失去抑制MMP的 活性.这表明,Hp感染,能在一定程度上使RECK基 因启动子区域甲基化,从而使RECK基因表达异常,胃 上皮细胞可能获得增殖生长优势和丧失抑制生长功 能. 肿瘤的形成通常伴有抑癌基因表达的降低.本研 究显示,Hp对RECK基因的表达具有时间依赖性,即, 0,72h内,RECK基因的表达几乎无影响,但当Hp感 染时问达96h及144h后,RECK基因mRNA水平明 显下降.因此,Hp感染无疑使病变的胃上皮细胞获得 了增殖的可能性,随着RECK表达量的降低,MMP的 灭活减弱,MMP的过表达可导致ECM过度降解,血管 及周围组织完整性降低,促进新生血管形成. NF—KB是介导细胞内信号传递最重要的核转录因 子,NF—stB最常见的形式是由p50和p65组成的异源 二聚体.静息状态下,NF—KB以非活性形式存在于细 胞质中.NF—s:B受到胞外因素激活后,p65进入核内 后,与许多蛋白质基因启动子或增强子部位的-(B序列 结合,从而参与机体的炎症反应,免疫反应,细胞分化 与凋亡.本研究发现,Hp感染至96h后,NF—KB的 活性明显增强.这提示NF.KB活化和表达上调在Hp 诱导胃上皮细胞增殖和抗凋亡过程中可能起到关键作 用.因为抗凋亡蛋白Bcl一2,Bc1.XL基因的上游均有 NF.KB的位点,NF—KB的激活,可能导致Bcl-2家族中 抗细胞凋亡的基因表达增加,尤其是Bcl一2,Bc1.XL,进 而发挥此类因子降低线粒体膜的通透性,抑制线粒体 ? 582?实用癌症杂志2010年11月第25卷第6期 ThePracticalJournalofCancer,November2010,Vol25,No.6 去极化及细胞色素C释放的抗凋亡作用.除了Bcl一2 家族外,NF—KB的持久激活可能对RECK的表达造成 一 定影响.为了证实该结论,本研究采用了NF— KB的特异性抑制剂PDTC,在Hp感染的同时适当给予 PDTC共同孵育.当孵育144h后,RT—PCR结果显示, PDTC能在一定程度上逆转Hp诱导的RECK低表达 状况.这表明,Hp所诱导的RECK基因低表达,很可 能是通过激活NF—KB而实现的. 随着对肿瘤细胞生物学研究的深入,目前一致的 看法是,细胞的生物学行为从根本上来讲是由特定的 基『六I表达产物所决定的,而基因表达的变化是与细胞 外信号密切相关.细胞外信号通过一系列信号传导环 节,胞外信号最终引起一类特殊的蛋白因子即转录因 子的活化,这些因子能够识别并结合于细胞核内某些 靶基因的启动子,增强子等顺式作用元件巾的特异靶 序列,从而激发启动相应基因的转录.本研究表明,在 Hp诱导GES—l低表达RECK的过程巾,RECK基因很 可能受到核转录因子NF—KB的调节.Hp—NF—KB— RECK--MMP这一传导通路的活化,在胃上皮细胞的 增殖抗凋亡及恶性转化中很可能具有重要作用. [2] [3] [4] 参考文献 WalTenJR.MarshallBJ.Unidentitiedcurvel1bacilliongas— tricepitheliuminactivechronicgastritis(J].Lancet,1983, I(8336):l273. Meyc,rJM,SillimanNP,DixonCA,cta1.Helieobactmpylori all(1earlvduodenalulcel-statuspost—treatment:areview [J].Helicobacter,2001,6(2):84. MengN,LiY,ZhangH,eta1.RECK,anovelmatrixmetal— loproteinaseregulator[J].HistolHistopathol,2008,23 (8):1003. TakahashiC,ShengZ,HoranTP,eta1.Regulationofmatrix metalloproteinase一9andinhibitionoftumoririvasionbythe [5] [6] [7] [8] [9] [10] [12] membrane—anchoredglycoproteinRECK[J].ProcNatl AcadSciUSA,l998,95(22):13221. ClarkJC,ThomasDM,ChoongPF,eta1.RECK—anewlydis— coveredinhibitorofmetastasiswithprognosticsignificance inmuhipleformsofcancer(j].CancerMetastasisRev, 2007,26(3-4):675. HoqueMO,PrencipeM,PoetaMI,eta1.ChangesinCpG islandspromotermethylationpatternsduringductalbreast ccilLomaprogressioncJ].CancerEpidemiolBiomarkers Prey,2009,18(10):2694. 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(收稿日期20l0—06—18修回日期2010—08—24) {编辑:甘艳)