03胎儿疾病的产前诊断

03胎儿疾病的产前诊断 胎儿疾病的产前诊断 产前诊断又称为宫内诊断，是指胎儿先天性疾病在妊娠期就获得诊断的方法，是细胞遗传性、分子遗传性、生物化学以及影像学等技术的综合的一门新兴学科。50年代中期，羊膜腔穿刺技术首次用于胎儿性别鉴定和Rh溶血的诊断。60年代放射影像技术用于临床诊断胎儿骨骼发育畸形和某些特殊的软组织疾病(如胎儿水肿)。70年代超声影像技术问世，可以诊断更复杂的胎儿结构畸形，并可引导不同途径的胎儿组织活检，而且避免了放射线的损伤作用。80年代以来，早期妊娠绒毛活检及胎儿宫内取血的广泛应用及分子生物学的日益发展，使产前诊断得到了突破性的飞跃。进入90年代，随着医学伦理学和医学生物技术的不断完善，更早期、更安全、更准确、更成熟的产前诊断方法不断应用于临床，已进入不断推广的临床应用阶段，并已展现出广阔的前景。 胎儿先天性疾病是指胎儿出生前就存在的疾病，可分为先天性结构异常(畸形)和功能异常两大类。根据先天性疾病的病因可分为遗传和变异两大类。下面介绍与先天性疾病有关的几个概念:?异常:不同于正常的结构和功能特点。?综合征:可辨别的结构缺陷系列，并且在某些患者存在类似的病史，因此可以诊断和分类。?序列:由于妊娠早期某一事件引起的缺陷系列。?相关:许多缺陷往往同时存在，但不是真正的综合征。?畸形:异常发育造成的形态缺陷。?发育中断:由于外因阻断或干预正常发育引起的形态缺陷。?缺陷:由机械性的外力造成的结构、形态和位置的异常。 一、产前诊断的范畴和指征 (一)产前诊断的范畴 目前能进行产前诊断的疾病有以下几类: 1.染色体病 染色体病是导致新生儿出生缺陷最多的一类遗传学疾病。目前发现的染色体病有600多种，其中最常见的有60多种，绝大多数染色体病在妊娠早期即死胎流产而被淘汰，总的自然淘汰率为94,，仅6,的染色体异常胎儿可维持宫内生存到胎儿成熟。在新生儿中约有0.5,患有染色体病，目前对先天性染色体疾病尚无有效的治疗方法，因此，目前主要的处理原则是争取早期诊断，及时终止妊娠，达到优生优育的目的。染色体异常包括染色体数目异常和结构异常两类。染色体数目异常包括整倍体(如多出一倍体、二倍体、或三倍体等)和非整倍体(如21三体、18三体、13三体等、47，XXX综合征、45X综合征等);结构异常包括染色体部分缺失、易位、倒位、环形染色体等。 2.单基因遗传病 许多遗传病的染色体外观正常，但染色体上的基因发生突变，由单个基因突变引起的疾病叫单基因病。其遗传方式遵循孟德尔法则，遗传方式可分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性连锁显性或隐性遗传等。 3.多基因遗传 很多常见的先天性畸形如无脑儿、脊柱裂、唇腭裂、先天性心脏病、髋关节脱臼等都是多基因遗传病，是许多基因和环境因素的相互作用的结果。其遗传特点有:?畸形显示从轻到重的连续过程，病情越重，说明有越多的基因缺陷。?常有性别差异，如足内翻多见于男性，腭裂多见于女性。?与单基因不一致，多基因遗传有累加效应。 4.各种环境致畸因素所致的畸形 ?生物致畸因子:主要为TORCH感染。最为著名的为风疹病毒，其他的有弓形体、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒、以及其他病原体(如人类乳头状病毒、细小病毒、乙肝病毒等)一组不同来源的病原体，是引起胎儿宫内感染和新生儿出生缺陷的重要原因，我们称之为TORCH。 TORCH病原体主要通过胎盘循环引起母儿之间的垂直传播，此外也可经孕妇的生殖道上行扩散。孕妇感染TORCH后往往无明显的临床症状，但胎儿感染后导致严重的后遗症。多表现为一组胎儿中枢神经系统受损为主，多系统、多脏器受累的临床症侯群，包括小头畸形、脑积水、迟发性神经系统障碍、耳聋、白内障、视网膜络膜炎、先天性心脏病、肝脾肿大、骨髓抑制和胎儿发育迟缓等，该症候群称为TORCH 综合征。?非生物致畸因子:在胚胎发育时期，某些理化因素亦可导致胎儿畸形。如高温可致神经外胚层细胞发育障碍甚至死亡而形成无脑儿。另外，细胞毒、化学物质、致畸药物、噪音、射线、吸烟、酗酒等均可导致胎儿先天性畸形的发生。 (二)产前诊断指征 产前诊断适应的对象主要有以下几种情况: 1.高龄孕妇 随着孕妇年龄增加，染色体畸形的发病率呈指数升高。其中2l三体的发病率升高尤为突出。35岁以下时2l三体的发病率为0.15,，35岁以上的孕妇为l,,,，40岁以上者为3,,4,。因此年龄在35岁以上的孕妇称之为高龄产妇，是胎儿先天性疾病的高危人群。 2.曾经生育过染色体异常患儿史 凡生育过染色体异常患儿的母亲，再次妊娠发生染色体异常的概率为1/60，比正常孕妇大10倍以上。 3.夫妇之一是染色体平衡易位携带者或倒位者 2,,3,先天性愚型为平衡易位者，该患者出生先天性愚型的概率为33,，但实际上父亲为平衡易位出生患儿的风险为2,,3,，母亲为平衡易位者的后代患病的风险为10,。实际数字比理论数字低的可能原因是某些异常配子不能存活。 4.曾经生育过神经管缺损儿的孕妇 神经管缺损是最常见的先天性疾病之一，可分为无脑儿和脊柱裂两大类。生育过无脑儿的孕妇，再次妊娠发生无脑儿的风险可增加到2,,5,，生育过2胎无脑儿的孕妇，再次生育无脑儿的概率为10,,20,。 5.有脆X综合征家系的孕妇 脆X综合征是X连锁的智力低下综合征中发病率最高的一种。它与X染色体上的脆点有连锁关系。 6.夫妇中有一方有单基因遗传病的家族史，或夫妇之一为单基因遗传病患者，或者生育过单基因病患儿的孕妇，根据孟德尔法则可以评估生育患儿的风险。 7.曾有不明原因的自然流产史、胎儿畸形史、死胎、死产和新生儿死亡史的孕妇。 8.孕妇有致畸因素的接触史 如TORCH感染史，射线、超声、致畸的化学物质、药物等接触史等，均能使胎儿畸形的发生率升高。 二、产前诊断的方法 根据产前诊断的原理其方法可分为遗传学诊断和先天性疾病的结构和功能诊断两大类。遗传学的产前诊断是通过各种手段获取胎儿细胞，从染色体、基因等方面了解其遗传特性，从而诊断其疾病，如何获取胎儿染色体和如何对染色体进行检查是产前遗传学诊断的两个关键步骤。先天性疾病的结构和功能诊断是根据先天性疾病临床特点(结构或功能异常)，通过影像学和血生化检查获得诊断的目的。 (一)获取胎儿细胞的方法 胎儿在完全封闭的羊膜腔内生存，人类要在安全的前提下方便地获得胎儿遗传物质有一定的困难。随着技术的进步，目前形成了许多在胎儿发育的不同时期获取胎儿遗传物质的方法。 1.胚胎植入前诊断 目前多采用宫腔灌洗或体外受精的方法获取胚胎。前者在受精后90,120小时灌洗宫腔来获取胚胎，该方法虽然方便，但成功率低。后者常在腹腔镜或超声引导下行卵泡穿刺取卵。在体外受精过程中，我们可以通过机体活检、卵裂球活检和胚泡活检等微活检技术进行产前诊断。 (1)卵细胞第一次有丝分裂 出生初级卵母细胞和第一极体，胎儿的形成不需要极体，而极体有与卵细胞相同的遗传物质。可以应用PCR的方法分析极体的基因来推断卵细胞的基因型。其缺点是不能分析父源性的等位基因。 (2)卵裂球活检 在受精卵分裂成4,8个细胞的卵裂球时期，先用酸性溶液在透明带上钻孔，然后用微穿刺针吸取单个细胞，进行染色体和基因分析。 (3)胚泡活检 该方法采用显微机械和化学的方法在胚泡期于内细胞团的对侧的胚透明带上开口，在24小时内使卵裂球从切口膨出。用这种方法可以从100个左右的胚泡中获 取仅10个的细胞团。该方法虽然可获取较多的细胞，但胚胎的成活率和种植的成功率受到影响。 2.绒毛活检技术(CVS) 由于绒毛组织位于胚囊之外，且有胚胎相同的遗传物质，故早孕期绒毛活检是产前诊断重要的组织来源。绒毛活检可采用经宫颈、经腹部和经阴道窟窿三种途径。活检时间可在妊娠9,12周。小于妊娠9周的胎盘太薄，超声很难把胎盘中的绒毛和蜕膜区分开来，不易获得绒毛组织;大于妊娠12周后胚胎发育迅速，经宫颈途径穿刺较困难，且随着孕龄的增大，羊水量增多，可以用羊水穿刺的方法取代绒毛活检。关于绒毛活检的安全性问题一直有争论。一般认为绒毛穿刺有诱导流产的可能，但不会超过l,;有人报道早期绒毛穿刺可导致胎儿肢体畸形，但亦有人认为绒毛穿刺不会导致胎儿肢体发育障碍。通过绒毛活检获得的细胞可以根据产前诊断的需要行染色体、基因或酶代谢的检查。绒毛细胞制备染色体可采用直接法和绒毛培养法。直接法是利用具有分裂活性并可产生原位分裂相的细胞滋养层细胞制备染色体。制备后无需细胞培养或仅经过几小时短期培养后即行染色体制片分析。该方法具有快速、避免母体细胞污染的特点，但分裂指数低、染色体形态差，并可出现滋养细胞层细胞核型与胎儿细胞核型不符的现象，亦称为胎盘局限性嵌合体(CPM)现象。发生率约为2,,3,，从而使临床应用受到一定限制。培养法通过酶解法将绒毛胚外中胚层的间质细胞分解，使滋养细胞为单细胞悬液之后，在培养瓶内建立单层细胞培养，一般经6,10天培养后即可获得足够数量的有效细胞。培养法获得的细胞的染色体形态优于直接法，并且培养法所得的细胞均为绒毛内胚层胚外中胚层组织，其出现胎盘局限性嵌合体现象明显少于直接法。该法的缺点是易被母体细胞污染。 3.羊膜腔穿刺技术 羊水穿刺术是最常见的产前诊断技术。早在50年代首先应用临床诊断Rh溶血性疾病和胎儿性别的鉴定。60年代开始，羊水穿刺术作为产前诊断的重要手段广泛应用于临床。羊水内含有不同类型的组织细胞，其中主要有胎儿肾细胞和胎儿上皮细胞。羊水细胞培养中成活的细胞以细胞群落自然生长，细胞呈上皮样或成纤维样。羊水量随孕周而增加，妊娠36周时羊水量最多，约1000ml，随后稍有减少。在妊娠15,16周时子宫出盆腔，羊水量约180,200ml，且羊水中存活细胞比例高，是羊水穿刺最佳时期，羊水穿刺量可达20ml。近年来，有人提出于妊娠9,13周就可行羊水穿刺术，穿刺抽取的羊水量可根据孕周确定，一般认为妊娠10周之前安全的吸取量为5ml，妊娠10周以后为10ml。在羊水穿刺前进行认真仔细的超声检查，确定胎盘位置、羊水量，全面了解胎儿胎盘的情况，穿刺针避开胎盘和胎儿。羊水穿刺术是一种十分安全的产前诊断方法，相关的流产率约为0.5,。 4.经皮脐血穿刺技术 其主要用途有:?快速核型分析:胎儿血细胞培养48小时后即可进行染色体核型分析。?胎儿宫内感染的诊断:通过胎儿血清特异性抗体IgM抗体测定可对TORCH病原体感染进行宫内诊断，由于胎儿的免疫系统在妊娠20周后完善，因此胎儿抗体检测在妊娠22周后才有效。另外可以通过PCR等方法诊断，该方法不受孕周限制。?胎儿血液系统疾病的产前诊断:如溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、血友病、地中海贫血等。?可以对胎儿各种贫血进行宫内输血治疗。首先在B超定位胎盘、胎儿及脐带的位置，确定穿刺点，最常见的穿刺点为脐带入胎盘根部2cm处，此处位置相对固定，易于穿刺。在B超引导下，在消毒无菌的环境下用22号穿刺针经母体腹壁及子宫壁后刺入脐血管后，抽取胎儿血约6,8ml，对胎儿循环无明显影响，可重复进行，且安全性较好。 5.胎儿镜 胎儿镜是一种双套管光纤内镜，局麻下经腹壁插入羊膜腔内直接观察胎儿外形及体表结构。最早用于诊断胎儿神经管畸形，目前亦可以进行脐血采样及胎儿组织活检(皮肤、肝脏等)来诊断胎儿染色体疾病、溶血性疾病、血红蛋白病以及先天性代谢性疾病等。同时也可以应用该技术对胎儿溶血性疾病进行宫内输血治疗以及简单的胎儿外科处理。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠17,20周。随着胎儿镜技术的不断改进，与之相关的流产率从10, 降到3,，但这一副作用仍限制了该技术广泛应用于临床。 6.孕妇外周血中胎儿细胞的分离纯化 近年来随着单克隆抗体技术、流式细胞仪技术以及PCR技术的发展，使从孕妇外周血中分离采集胎儿细胞的技术日趋成熟，从而建立了一种简便并为孕妇容易接受的非创伤性的产前诊断方法。 通过胎盘进入母体循环的胎儿细胞主要有滋养细胞、胎儿有核红细胞和淋巴细胞。滋养细胞数量较多，但诊断准确性较差，淋巴细胞数量相对较少，有核红细胞数量较多，且遗传学诊断的准确性较高，因此是目前最常用的细胞类型。流式细胞技术以极快的速度测定流动细胞悬液中单个细胞所发生的散射光或荧光来进行细胞分类，利用该技术可以定量分析母血中的胎儿细胞数、判别其形态与细胞表明的理化特性，并将胎儿细胞分离出来。分离出来的胎儿细胞可以通过超微量DNA提取、PCR或者荧光原位杂交等技术完成遗传特性诊断。母血中能检测到胎儿细胞最早在妊娠35天，最理想的时机是妊娠10,18周，产后6个月后，绝大部分胎儿细胞在母体循环中消失。 (二)遗传学诊断的方法 遗传学诊断方法包括染色体异常的诊断和基因诊断。以下是常见的诊断方法。 1.染色体核型分析 染色体核型分析应用于临床已有近40年的历史了。染色体经染色后，出现明暗相间的条带，不同的条带反映了不同的分子成分。在分析细胞的核型时，根据染色体的形态、条带、以及着丝点的位置，可以区分人类的24种染色体。最常见的染色体异常为非整倍体的染色体数目异常和染色体的结构异常，如缺失、倒置、插入和易位。 2.Southern杂交 这是最经典的基因分析方法，应用Southem印迹杂交方法可进行染色体缺损/插入检测和限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)连锁分析。 3.PCR及相关技术 聚合酶链式反应(PCR)是一项快速，准确地从微量、复杂的混合的DNA样品中扩增特异DNA片段的方法，其原理是在DNA聚合酶的作用下引物延伸反应。其相关技术有:多重PCR、突变等位基因特异 PCR、扩增片段长度多态性、RT-PCR、PCR/ASO探针斑点杂交可分别检测点突变，某一基因的多处点突变，扩增产物的长度多态性，前体mRNA加工过程中的异常，区分个碱基的差别及鉴定个体基因型。 4.多态性连锁分析 不同类型的突变有不同的诊断途径。突变未知或突变已知但突变类型较多时用多态性连锁分析，突变已知时用直接检测法。 多态性位点在基因连锁分析中的应用价值，除了它与致病突变之间连锁的紧密程度有关以外，还与它的杂合频率有关。连锁越紧密所得的结果越可靠，杂合频率越高应用价值越高。有时单单分析一个多态性位点，还不能将某一家系中的致病基因所在的染色体与正常染色体区分开来，必须分析多个位点的状态，综合后才能获得足够的信息。如果致病基因与多态性位点虽然紧密连锁但有相当的距离时，减数分裂过程中可能发生染色体交换，将破坏这种连锁关系，在作产前基因诊断结论时必须考虑到因交换所导致的误诊的风险率。在应用连锁分析方法进行基因诊断时一定要注意临床诊断的准确性，以免误入歧途。 5.荧光原位杂交技术(FISH) 荧光原位杂交技术是以荧光素标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。它利用已知碱基序列的非同位素标记的核苷酸探针，依据碱基配对原理，通过免疫细胞化学检测体系在组织切片、细胞间期核或染色体等标本上进行DNA定性、定位及定量分析。FISH具有快速、安全、灵敏度高、特异性强等特点。既能显示染色体中期分裂象，又能显示于间期核细胞。 染色体异常的产前诊断主要依靠细胞分裂中期染色体的分析，但该常规细胞遗传学方法需要2,3周完成。而应用FISH对未经培养的绒毛细胞或羊水细胞进行原位杂交即可快速诊断常见的染色体数目和结构异常。使用该方法诊断染色体数目异常的产前诊断只需1天时间，可省去复杂的细胞培养及染色体分析的过程。另外，FISH在染色体结构异常的产前诊断中，不仅对那些易位性重排，而且对重复、缺失或插入性重排都能确定重排的类型、来源 和断裂点提供可靠依据。在对标记染色体、环状染色体来源的研究中，FISH也具有高度的敏感性和可靠性。 (三)超声影像诊断 超声诊断技术是胎儿形态学异常产前诊断重要的方法。常用的超声仪有B超、多普勒超声诊断仪(包括脉冲多普勒和彩色多普勒)、M型超声诊断仪。根据超声探头的不同可分为腹部超声和阴道超声。与腹部超声比较，阴道超声的分辨率高但显象范围较窄。高分辨率的阴道探头在着床后数天即能观察到胚胎，妊娠5,6周即可见胎心搏动。妊娠早期超声可观测胚芽、腹部、颅脑及心脏结构。某些明显的结构畸形如无脑儿在妊娠10周之后就能诊断。虽然妊娠早期的超声检查的特异性较高，但是敏感性较低。故妊娠早期超声检查无明显畸形，仍不能排除胎儿畸形的可能。 随着胎儿生长发育的不断完善，妊娠中期超声影像检查对胎儿结构异常的诊断越来越准确，最佳的检查孕周为妊娠20周，但染色体21-三体综合征的超声检查在妊娠13周左右，也有人报道可提前到11周。在这一时期胎儿结构异常的超声表现主要有以下几种类别: 1.染色体21-三体综合征 染色体21-三体综合征的超声特点是颈部透明带增厚，最早可在妊娠11周发现。一般检查孕周为妊娠11,14周。所谓颈部透明带(NT)系指胎儿颈部后方皮下积水的空隙，在超音扫描时会呈现透明带状，再测量介于皮肤和组织之间的空隙厚度。绝大部份正常胎儿，都可看到此透明带;但染色体异常胎儿(特别是唐氏症儿)，其颈部透明带会明显增厚。超声检查胎儿的颈蹼筛查2l-三体综合征的方法简便、易行，但准确性较低，且与检查医生的临床经验有很大的关系。因此，目前的超声检查仅作为染色体21-三体综合征筛查的方法之一。 2.正常结构缺如 以无脑儿最多见，超声诊断的准确性达100,。此外有肾缺如、脊柱裂等也能通过超声诊断。 3.赘生物的形成 畸胎瘤是胎儿最常见的赘生物，常发生在骶尾部，多为囊性，以女性多见，很少合并有其他先天性畸形或染色体异常。胎儿颈部水囊瘤是由淋巴系统发育异常导致的胎儿颈部水囊突出，超声检查较易诊断，常有染色体异常。 4.阻塞性脏器扩张 正常体液或分泌物流动受阻即可导致相应器官的扩张。脑积水是最常见的一种类型，以脑室系统扩张为特点，往往是脑脊液循环受阻引起。消化道梗阻导致近端肠道扩张，其中十二指肠梗阻致胃和十二指肠扩张最为常见，超声检查可见到“双泡症”，这一征象的发现有重要的临床意义，因为这类患儿中1/3合并唐氏综合征。1/5合并有心脏畸形;先天性无肛使结肠扩张，表现为先天性巨结肠。不同部位的泌尿系统梗阻可相应导致膀胱扩张、输尿管扩张、肾盂扩张和肾积水，肾皮质萎缩，导致肾功能损伤;早期超声诊断后，可选择宫内引流术，避免或减轻对肾功能的损害。 5.疝的形成 正常胎儿结构的不完全融合可导致脏器的膨出而形成疝。常见的有脑膨出、脐疝及膈疝。超声显像都有典型的特征。 6.胎儿结构大小异常 胎儿不同部位的组织结构可以根据其孕龄来估计其正常的大小。有些胎儿的先天性畸形超声显像时并不出现明显的形态异常，仅表现为组织器官的大小比例失调。如小头畸形、骨骼发育不良等即可以通过超声测量各径线来判断。 7.胎儿脏器运动异常 胎儿心脏是最易观察的运动器官，心脏结构的缺陷可以结合实时超声和M超声心动图进行诊断，胎心节律性异常和传导紊乱可通过测量心脏瓣膜的运动节律作出判断。 8.其他 羊水过多或羊水过少是最常见的病理现象。羊水过少，无胎膜早破时，排除过期妊娠和慢性胎儿窘迫的情况下，常常提示胎儿肾脏的病变，如先天性无肾等，需进一步检查泌尿系统的情况。羊水过多中有20,合并胎儿畸形，如无脑儿、脊柱裂、胃肠道梗阻或膈疝等。胎儿胸腹水及胎儿水肿虽然不常见，但一经诊断，胎儿预后往往不良，常见于母儿血型不合、血红蛋白病、先天性心脏病、先天性肺发育不良及染色体异常等。 (四)孕妇血清生化指标筛选的应用 当胎儿患有开放性神经管畸形时，孕妇血液中的 AFP浓度异常升高，利用这一血清学指标可以筛选神经管畸形。AFP是胎儿肝脏合成的一种糖蛋白，其胎儿血浓度高。正常情况下，AFP可以通过胎儿尿液及胎儿上皮组织进入羊水循环及母体循环，当发生开放性神经管缺损时，胎儿某些部位缺乏正常组织覆盖，导致大量AFP渗漏至羊水及母体循环中，使羊水及母体循环中的AFP浓度极度升高。孕妇血清AFP浓度筛选的时间一般在妊娠15,23周之间进行，在此期间母血的AFP浓度随孕周增加而增加。当孕妇血清AFP异常升高时，应进一步详细的超声检查或羊水穿刺检查。 临床研究表明:单一的AFP指标来筛选染色体异常，其敏感性和特异性均不理想，大规模的临床应用受到限制。孕早期应用AFP、雌三醇(E)和绒毛膜促性腺激素(hCG)三项筛选试验联3 合应用，在很大程度上提高了非整倍体染色体异常胎儿诊断的准确性。目前越来越多的产前诊断中心采用联合血清学的方法筛查21-三体综合征。当分界点为人群的5,的阳性率时，在35岁以下的人群中21-三体综合征的检出率为60,，35岁以上人群的检出率为75,。一般情况下，在妊娠16,18周进行血清学筛查，阳性孕妇进行染色体检查，确诊后一般在妊娠18,20周之间终止妊娠。、近年来，许多学者提出于妊娠11,14周进行血清学检查，检查的项目除了以往的三项指标，还有妊娠相关蛋白A(PAPP-A)、β-hCG等。该方法可以在不降低检出率的前提下，提前染色体21-三体综合征筛查。在妊娠早期联合应用PAPP-A和β-hCG，染色体2l-三体综合征的检出率为69,，若联合应用超声检查，检出率可提高到89,。但是该方法的广泛应用尚需进一步多中心、大样本的综合研究方能作出结论。