脊髓性肌萎缩症患者神经元样细胞SMN2基因mRNA的表达

脊髓性肌萎缩症患者神经元样细胞SMN2基因mRNA的达 脊髓性肌萎缩症患者神经元样细胞SMN2 基因mRNA的表达 2006年10月第45卷第10期ChinJInternMed,October2006,Vl45,No.10 脊髓性肌萎缩症患者神经元样细胞SMN2 基因mRNA的表达 罗新明杨晓苏肖波 【摘要】目的检测脊髓性肌萎缩症(SMA)患者神经元样细胞SMN2基因mRNA的表达. 方法用PCR-RFLP的方法对SMA患者进行基因诊断,诱导其骨髓间充质干细胞分化为神经 元样细 胞,RT-PCR和测序检测该细胞SMN2基因mRNA的表达,所有过程与对照组进行对比研究. 结果 SMN2基因的扩增产物为全长转录产物n-SMNmRNA(266bp)和转录时跳过外显子7的产物 SMNA7 mRNA(212bp,经测序证实缺少的54bp为外显子7的序列);SMA患者n-SMNmRNA的表达 占总表 达量的23.2%,远低于对照者(占总表达量的82.0%);而sMN?7mRNA表达占总表达量的 76.8%, 高于对照者的18.0%.结论SMA患者神经元样细胞的SMN2基因转录时存在选择性剪接, 即剪接 时跳过外显子7,是导致其全长SMN蛋白不足的原因之一. 【关键词】脊髓性肌萎缩症;基因;运动神经元, TheexpressionofSMN2genemRNAinneuron-likecellsderivedfrompatientswithspinalmnscular atrophyXin-ming,们Xiao-?,XIAOBo.DepartmentofNeurology,XiangyaHospital,Central SouthUniversity.Changsha41DoD8.ina Correspondingauthor:,vGXiao.?.Email:yanxia@public.CS.hn.cn 【Abstract】ObjectiveTodetectthedireneeofSMN2mRNAexpressionbetweentheneuron.1ike cells(NLCs)derivedfrompatientswitIlspinalmuscularatrophy(SMA).MethodsPolymerasechain reaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)wasperformedtodiagnosethepatientswith SMAandthecontrols.MesenchymalstemcellsfMSCs)wereinducedintoneuron.1ikecellswhichbecome tIlemodelsofneurons.ThetranscriptsofSMN2weretestifiedwithRT.PCRcombinedwithsequencing. ResultsTwobands(266bpand212bp)werefoundinthegelpictureofRT.PCRandthebandof266bp wastheful1lengthtranscript(n.SMNmRNA).Thebandof212bpwastestifiedbysequencingtobedeletion oftheexon7,whichWastheproductionofalternativesplicing(skippingexon7,SMNA7mRNA).The expressionofn-SMNmRNAaccountedfor23.2%oftIletota1SMNmRNAintheSMApatients.beingmuch lowerthantherateinthecontrols(82.0%).Incontrast,76.8%ofSMNgenetranscriptswasSMNA7 mRNAintIleSMApatients.beingmuchhigherthantherateof18%intIlecontrols.Conclusions AlternativesplicingexistsinSMN2genetranscription,thatis,exon7isskippedduringtheprocessingof SMN2mRNAintheNLCsofSMApatients.whichisoneofthereasonsoftheful1.1engthSMNprotein lacking. 【Keywords】Muscularatrophy,spinal;Gene;Motorneurons,alpha 脊髓性肌萎缩症(SMA)是一组常染色体隐性 遗传的神经系统变性疾病,其特征是脊髓前角的Ot 运动神经元变性,临床表现为肌无力和肌萎缩. SMA的致病基因已克隆,是位于5q13的运动神经 元生存(SMN)基因.人类的SMN有2个结构基 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170330);湖南省自 然科学基金资助项目(02JJY3016) 作者单位:410008长沙,中南大学湘雅医院神经内科(第一作者 现在南昌大学第二附属医院神经内科,330006) 通信作者:杨晓苏,Email:yanxia@public.CS.hn.cn 831 . 论着. 本相同的拷贝SMN1和SMN2,SMA是由于SMN1 缺失所致,SMN2拷贝保留…,但保留的SMN2并不 能阻止此病的发生,说明SMN2和SMN1结构上的 细微差异导致了其功能的巨大差别.我们采用临床 及基因确诊的SMA患者的骨髓间充质干细胞 (MSCs)定向分化为神经元样细胞作为细胞模型,检 测其SMN2mRNA表达,并与对照者进行比较,以探 讨产生上述差异的原因. 资料与方法 1.对象:选择符合1992年国际脊髓性肌萎缩症 中华内科杂志2006年lO月第45卷第lO期ChinJInternMed,October2006,Vol45,No.10 会议诊断标准的SMA患者共3例,其中2例为姐 弟,年龄分别为12岁和11岁,另1例为男性16岁. 在签署知情同意书后骨穿抽取骨髓.对照者为本院 胸外科无肿瘤及血液系统疾病的非SMA患者,从其 手术切除的肋骨获取骨髓.患者及对照者均行 SMN基因检测确诊. 2.主要试剂:L.DMEM(美国GIBCO公司),新 生牛血清(美国Hyclone公司),Trizol(美国 Invitrogen公司),二步法RT.PCR试剂盒(深圳晶美 公司分装),Taq酶(5U/ix1)和dNTPs(10mmo~L) (北京鼎国生物技术公司),DraI限制性内切酶(上 海Promega公司),黄芩甙单体(湘雅医院药剂科). PCR-RFLP引物参考文献设计J,RT.PCR引物用 Premier5.0软件自行设计,引物由上海博亚生物技 术公司合成(表1). 表1引物序列 3.PCR-RFLP法基因诊断:酚-氯仿法提取 DNA,ddH2O溶解备用.PCR扩增体系(25Ix1): gDNA100ng,Taq酶2U,10mmo~LdNTPs1ixl, 10×PCRbuffer(含Mg?)2.5Ixl,正反向引物各5P mmol,加ddH2O至25Ixl.PCR反应条件:95oC预 变性5min,95oC45s,55oC退火45s,72oC延伸50s, 循环35次后以72~C维持10rain.取PCR产物15 l,加入限制性内切酶DraI1Ou以及相应的缓冲 液,ddH2O至3Ol,37?孵育6h.酶切后用2%琼 脂糖凝胶电泳(电压110V,40min),图像仪照 相,观察结果.结果判读:PCR扩增SMN1和SMN2 的产物均为188bp,酶切后SMN2切成164bp和24 bp(后者电泳出凝胶外),而SMN1不能被酶切,见 到188bp和164bp两条带者为正常,只有164bp 一 条带提示SMN1缺失. 4.MSCs诱导分化为神经元样细胞及其鉴定:密 度梯度离心法和换液传代法分离和培养MSCs.参 照文献[4],用黄芩甙单体对第3代的MSCs细胞进 行诱导分化.诱导后细胞用免疫荧光法进行鉴定: 4%多聚甲醛固定30min,3%过氧化氢孵育30min 消除内源性过氧化物酶活性,正常山羊血清室温封 闭30min,分别加入小鼠抗人NSE(1:100),小鼠抗 人NF(1:100)单抗,4~C过夜,加入荧光二抗山羊抗 小鼠IgG-Cy3(1:150),37%孵育30min,上述步骤 之间均用PBS洗涤,荧光显微镜下观察,照相. 5.RT.PCR检测SMN转录产物及其表达:每组 各取6瓶细胞进行,取其平均值.Trizol法提取总 RNA,二步法RT-PCR参照试剂盒操作手册.逆转 录反应(2OIx1):RNA2Ixl,0.05Ixloligo-dT181 l,加DEPC水补足至12l,7O?变性5min,冰上 骤冷,稍离心,加5×M.MLVBuffer4,40U/ RNA酶抑制剂1Ixl,10mmo~LdNTP2Ixl,200U/ M-MLV1Ixl,混匀,稍离心.42?,60min,70oC10 rain,破坏逆转录酶;PCR扩增(目的基因和内参照 同管扩增)体系:10×TaqBuffer5ill(含MgC1),10 mmol/LdNTP1Ixl,5U/ixlTaqDNA聚合酶0.4Ixl, B-actin(50pmol/lx1)上,下游引物各1Ixl,SMN(5O pmol/l~1)上,下游引物各2Ixl,加双蒸水至5Ol. PCR反应条件:94?预变性5min,94?30s,56?退 火40s,72~C延伸60s,循环35次后72~C维持1O rain.PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,产物全长 条带为266bp,异常片段在紫外灯下切下回收,凝胶 纯化后测序.用凝胶成像系统软件测定各电泳带光 密度值,并进行半定量分析将表达量化:表达丰度值= 目的基因光密度值/内参B.actin光密度值. 6.统计学分析:测定数值用?s表示,两组间 均数比较用t检验.检验水准=0.05.图表用 Excel2003绘制.统计学分析用SPSS10.0统计软件 包处理. 结果 一 ,SMN基因检测结果 DraI酶切后,仅见164bp条带者,说明SMN1 缺失,作为患者纳入;而有188bp和164bp两条带 者,无SMN1缺失,作为对照者纳入(图1). 二,MSCs定向分化为神经元样细胞及其鉴定 两组细胞用黄芩甙诱导6d后,大多数转变为 类似于神经元的形态,有长的突起,相互之间连接呈 网状,细胞周围有光晕,部分细胞脱落,死亡(图2). 两组分化后神经元表面标志醇化酶(NSE),NF均为 坐塑内利杂志堕主旦基?— 一一 ?… 【2吼嚣.jA,s.患者 目1sMNm黯泳目 ?____________________________________________—— ? 围2M虻诱导.幢收缩.形 成女起井空铋此xl? 圈3满导后N细c 染邑1oo圉4诱导后 NF性制胜一染色x1? 阳性(圈,4) 三,神经元样细胞sMNmRNA的检测 lRT-PCR扩增及测序:RT?PCR增出2条 带.条为266hp的条带(N-SMNmRNA1H一茉 为212bp(图5).圳212bp的条带测序.并与人 类基罔组巾SMN基因cDA序列L转.结果发现缺 少的54bp为外显了7的者和对JfIi者SMNmRNA全K表选 非全长表造比较(i?.%) fl6MNmRNAsMmlL~A bMA患首02??00啦’(232)0677?u022{768 对隔者0695tuu(820’Ol53?00zs’I8O 址:’和对照蛆相.,14Z,,(0?I:’对蛆 = 4093.’0—0.l 自从确SMNI基因缺失与脊髓性肌萎缩症的 相兰性以来不同研究中心先后检渊丁SMA患者 SMNI基因缺失情况.国外研究不缺率为 9l%一loo%.平均为94%,国内为%kSaJ其中 北院的研究显不I.?型SMA患者SMNI基因缺失 毕为fcm%.?型缺戈率低于T,?趔,为76% 因此,对丁I,?型SMA患者.uJ用SMN1基因缺失 检测代替肌电罔和肌衍检等有剖检查作为确诊于 段.m对m型SMA患者来说.由于SMNI基因缺失 的检出率相对低些.当未检5MN1缺失时.应结舍 临床考虑.本实验中所选用的患者.脒了有典型的 脊髓性肌黄辅症的临床特征外,也检出SMNI缺失. 所以患者sMA的诊断成, 乖试验为了蓖好地反映SMA患者神经元中 SMNmRNA的转录.用神经样细胞作为神经兀的 细胞模型.已有的研究_袤明.MSCs能档存体内外一 定的诱导条件下分化为神经元样细胞”.而且由 2006年1O月第45卷第1O期ChinJInternMed,October2006,Vol45,No.10 MSCs诱导分化而来的神经元样细胞不但能表达 NSE和神经丝蛋白等,还能高水平表达SMN蛋 白10].而SMN蛋白在各组织中表达水平不尽相 同,在运动神经系统中高水平表达,在成纤维细 胞,淋巴细胞和骨髓间质细胞中表达水平较低.神 经元样细胞除了能表达神经元的表面标志物,还能 高水平表达SMN蛋白,说明其作为神经元的细胞模 型有理论依据. 对人类基因组的大规模测序发现,人类基因的 数目远少于细胞中蛋白质的数目,说明基因表达的 复杂性,其机制包括DNA重组,RNA编辑和选择性 剪接等,其中mRNA选择性剪接是蛋白质多样性的 主要机制’].Modrek等通过大规模的EST分 析发现在人类基因组中有35%,59%的基因存在 选择性剪接,揭示了选择性剪接是基因转录过程中 一 种较常见的现象. 研究表明,mRNA的剪接是基于对剪接位点识 别的基础上,不同结构基因的剪接位点的识别机制 不同.对于小内含子基因,剪接因子识别内含子两 侧的剪接位点形成剪接复合体,称为内含子限定;对 于大内含子基因,剪接因子寻找外显子两侧相匹配 的3和5剪接位点形成剪接复合体,称为外显子限 定.这预示着当剪接位点的突变或者其他因素 影响剪接体的形成时,就会影响外显子拼接的进行, 从而产生外显子被跳过的(exonskipping)现象. SMN基因有9个外显子,它的2个拷贝SMN1 和SMN2之间仅有5bp的差异,即In6-45G/A, Ex7+6C/T,In7+100A/G,In7+214A/G和Ex8+ 245G/A.第2个差异(Ex7+6C/T)正好是外显子7 的剪接位点,这样就直接影响了外显子剪接增强子 的活性,而且外显子7两侧的内含子较大,容易引起 选择性剪接的产生,因而2个拷贝在转录时有着两 种不同的后果,即SMN1(Ex7+6C)进行全长转录, 产生fl—SMNmRNA,而SMN2(Ex7+6T)只有少量的 全长转录,出现大量的外显子7被跳过的现象,产生 SMNA7mRNA.本研究经测序证实存在选择性剪 接,即外显子7被跳过. 本研究发现,缺失SMN1的SMA患者,其SMN2 转录时以跳过外显子7的选择性剪接为主,而对照 者以全长转录为主,前者的全长SMNmRNA远低于 后者.对照者经检测SMN1和SMN2正常,其高于 患者的fl—SMNmRNA应该主要是SMN1的产物. 因此,对于SMA患者来说,SMN2的选择性剪接,即 剪接时跳过外显子7,是导致其全长SMN蛋白远低 于正常的原因之一. 参考文献 1LefebvreS.BurglenL.ReboulletS.eta1.Identificationand characterizationofaspinalmuscularatrophy—determininggene.Cell, 1995.80:155—165. 2vanderSteegeG,GrootschohenPM,vanderVliesP,eta1.PCR— basedDNAtesttoconfirmclinicaldiagnosisofautosomalrecessive spinalmuscularatrophy.Lancet,1995,345:985-986. 3MunsatTL.DariesKE.InternationalSMAconsortiammeeting. 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