犬冠状病毒感染

犬冠状病毒感染 ,,/ 吹3 解放军农牧大学军事兽医研究所犬病研究中心重生.塑丝芏 犬冠状病毒(CCV)感染是本世纪后期 新发现的犬的一种新的病毒性传染病该病 主要呈现呕吐,腹泻等肠炎综合症.7O年首 先发现于德国.现已几乎传遍世界所有养犬 国家与地区经过2O多年的研究,人们对其 有了一定的认识,但还有不少问题没有搞清. 现有的资料表明CCV只有一个血清型,但 在临床众多的带毒犬中,只有部分犬呈现临 床症状,病理学研究也发现该病毒不但存在 于感染犬的肠道.而且也常见于心,肝,脾, 肺,肾等实质脏器,而且与中和抗体并存,使 现有的研究资料难以解释.从事该病防治研 究的工作者首先想到的是该病毒是否会象其 他人畜冠状病毒那样存在不同的血清型或 株,在机体的微生态环境中该病毒担任何种 角色,起何种作用,及在研究其防治时,应 注意些什么问题? 为便于分析参考,这里先简单介绍一下 冠状病毒的抗原分组及致病情况: 冠状病毒抗原关系分组表 组别病毒名称(英文缩写) 1猪传染性胃脑炎病毒(TCEV) 1猪呼吸道冠状病毒(PRcV) 3猪流扦性腹泻病毒(PEDV) 2猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV) 1猫传染性腹膜点病毒(FIPV) 1猫肠炎冠状病毒(FEcV) 1托冠状病毒(CCV) 2小鼠肝炎病毒(MHV) 3鸡传染性支气管炎病毒(IBV) 4火鸡蓝冠病病毒(TcDV) 1人冠状病毒229E株(HEV229E) 2肠道冠状病毒(HBCV) 2人呼吸道冠状病毒(HcVc3) , ,病原 CCV原先由Binn等于1971年从腹泻 的藩国军犬中分离获得,研究证明该病毒为 冠状病毒属的一个新成员.具有该属病毒共 有的一切特征.外观呈圆形(直径8O一 100cm),或椭圆形(长180一~200cm.宽75— 80cm),表面覆盖双层脂质囊膜.囊膜上嵌有 主要致病特点 2周龄内仔猪H,泻 5l起猪肺炎或无症状 各种年龄猪腹茸 仔猪呕,消瘦,抽疯 猫干,湿性腹膜炎 猫呕吐,腹泻 犬呕,腹泻 小鼠肝炎,脑炎常与附RBc悼有美 鸡支气管炎 又鸡蓝冠病 胃肠疾患 呼吸道疾惠 长约1820rim的花瓣样纤突.尤如皇冠状, 故得名.纤突蛋白(S)为糖蛋白(180 200KDa).具有与宿主细胞相应受体结合,引 起细胞融合和诱导机体产生中和抗体与细胞 介导免疫的功能冻融和长时间存放,此种纤 突极易脱落.使其失去感染性和免疫原性.脂 质成分来源于宿主细胞.可与抗宿主细胞免 ?3? , 一 S 《中国养太杂志~1996年(7卷)第4期 疫血清发生反应.CCV基因组为不分段的正 股单链RNA,除多聚酶区外,基因组长9. 6kb分子量约为5.5X10Da,由l0个开放 性阅读框架(ORF)构成,具有感染性,5末端 有帽状结构,3末端有共价结合的Po|y(A). 其中的s,MM与N基因分别编码病毒的 纤突蛋白(s),膜蛋白(M),小摸蛋白(sM)与 核蛋白(N)四种结构蛋白.血清学与基因序 列分析证明.CCV与TGEV,PRCV,FECV 和FIpv抗原关系密切,为同一抗原群,与人 冠状病毒229E株亦有相关抗原. CCV在CsC1中的浮密度为1.24—1. 26g/m1.对乙醚,氯仿和去氧胆酸盐敏感,不 耐热,对酸与胰酶有较强的抵抗力,易被福尔 马林,紫外线和BEI等灭活.CCV体外培养 营养要求比较复杂,初次分离不易成功.对犬 源的原代肾细胞,肠细胞;传代MDCK,A?2 细咆;猫源的CRFK,FCWF等细胞较为敏 感,但适应前培养既不稳定也不产生细胞 病变,一旦适应某种细胞后则可在其他细胞 中增殖,并产生相同的细胞融合病变.形成多 棱巨细胞. CCV通过细胞胞饮方式侵入细胞.于感 染细胞的咆浆内复制增殖.通过空泡与细胞 膜融合或细胞崩懈而释放.到目前为止尚未 发现CCV具有血凝与血吸附特性.卤化脱 氧尿核苷不能抑制本病毒的增殖,但以棱糖 核酸酶处理,能破坏其感染性. 二,流行病学 血清学调查证明.CCV的感染率很高, 犬场中的犬感染率可达87.各种年龄,品 种和性别的犬均易感.幼犬易感性更高.一年 四季均可发生.但冬季多发.貉,孤等其他犬 科动物也可感染,但尚未见有人感染CCV 的报道.人工感染兔猪,小鼠和豚鼠均未成 功.但猪的’FGEV可使犬发生感染. CCV的发病率较低,约30.该病的发 生与严重程度常与断乳,运输,气温骤变,饲 ?d’ 养管理条件恶化以及与年龄,应激或其他病 原混合感染等因素有关.ccV感染虽然主要 表现为传染性胃肠炎症状,但其为一种泛嗜 性病毒,除了主要存在于肠上皮细胞与肠系 .膜淋巴结外,在犬的心,肝,脾,肺和肾等脏器 中也常可以看到.病犬和带毒犬随口涎,鼻液 和粪便等排毒.污染的饲料,饮水,笼具和周 围环境直接或间接地传染给易感动物.最近 有人报告.电检负染检查一新生仔犬的肠内 窑物,发现有CCV样粒子,提示CCV存在 垂直感染的可能性. CCV感染可引起体液免疫与细胞介导 免疫.人工经口感染第3天即可检出CCV IgM抗体,第4—7天即可检出CCVlgC抗 悻.眄内窑牺中也可到少量特异IgA, IgM和lgG抗体.血清中和抗体则一般于感 染10天后出现,经非口感染比经口感染的效 价为高.CCV的免疫作用主要靠肠道的局部 免疫,含有特异IgA的乳汁具较好的被动免 疫作用.但获得性免疫似乎不强,临床康复后 可再次发生.CCV为何能够长期存在于肠道 与实质脏器,而隐性感染叉为何如此之高,以 及是否墙实存在垂直感染,都有待于研究. 三,临床症状 CCV感染的潜伏期较短.人工感染1— 2天.自然感染】一3天即可出现临床症状, 并可在数日内迅速传遍全身.病犬最初表现 轻度的沉郁,嗜眠,接着很快出现频繁的呕吐 与腹泻开始粪便呈米糊状,最后部分带有胶 冻佯粘液.灰白色,并夹带有少量鲜红色血 液;而后变为全部带牯液的水佯,橙色或灰 色,带有数量不等的血液,极度腥臭.有时呈 喷射状排出水样或血佯的稀粪,病犬迅速脱 水衰竭.体温一般不高,白细胞有时略有减 少,呈急性胃肠炎症状.对于幼犬,此时虽采 取消炎补液等对症治疗,仍往往在发病后的 2436小时内死亡.病犬有时可见有流泪和 排水样鼻渣.多数病犬可在7一l0天康复,但 《中国养犬杂志》1996年(7卷)第4期 也有些病犬持续腹泻长达3—4周,不易治 愈.有些病犬粪便恢复正常一段时间以后,可 再次发生腹泻加强护理,保持温暖和安静可 促进恢复.如混合或继发犬细小病毒,轮状病 毒,球虫和空肠弯杆菌等其他病原感染,则可 使病情加重,死亡率增加 四,病理变化 主要呈现不同程度的胃肠炎变化尸体 严重脱水,局部肠管扩张,肠壁菲薄,肠 物稀薄水样,呈黄至黄绿色,常混有血液和气 体.肠粘膜充,出血,肠系膜淋巴结肿大胃 粘膜水肿出血,有时脱落.胆囊肿大.肝,肾 变性,有时见有支气管炎变化.病理组织学检 查与新生犊牛BCV感染相似:小肠绒毛萎 缩,融合,变短,隐窝加深,粘膜固有层细胞成 份增多,上皮细胞变短呈柱状,杯状细胞排 空.应用荧光抗体染色,可在小肠上皮细胞的 顶部发现特异荧光其他非特异性病变表现 为:小肠上皮细胞的微绒毛破坏,胞浆密度消 失,线粒体变形,胞浆室扩张并出现脂质包涵 体,回肠部分最为严重.特异性细胞病变为: 密丝体结构和膜结合小体形成.病毒在小肠 绒毛上皮细胞浆的小泡中复制,通过破损的 上皮细胞腔膜释放排入肠腔.宴质脏器中虽 已发现有CCV.但尚未发现其复制的确切部 位和所引起的特征性病变. 五,诊断 CCV感染倪靠I临床症状和病理变化难 以确诊,必须通过诊断当前CCV实 验室诊断方法主要为: 1.电镜与免疫电镜检查:鉴于CCV在 感染犬的肠内容物和实质脏器中的数量较 多,且有特殊的形成结构,所以通过电镜直接 负染,有经验的电镜工作者常可迅速确断为 与CCV有类似形成结构的CDV相区别,可 先于待检样品中加入CCV特异血清感怍, 怍免疫电镜检查,通过能否被CCV特异血 清凝集而进行区别. 2.免疫荧光与间接免疫荣光技术应用 CCV抗体制各的特异荧光抗体直接染色,或 先用特异抗体(第一抗体)作用后,再用荧光 抗体标记的第二抗体作间接荧光抗体检查. 可通过荧光细胞的有无而确诊. 3细胞培养与中和试验在CCV免疫 研究中,为检查用于制备疫苗的细胞培养物 中的病毒含量,可应用敏感细胞以细胞病变 (CPE)为指标,通过半数感染量(TCID.)的 测定来进行;检查免疫后的中和抗体产生情 况,则可在上述TCID.测定的基础上.采用 固定病毒(通常100×TCID.)稀释被俭血清 或固定血清(通常血清作1:10—20稀释),稀 释病毒的方法,应用敏感细胞进行微量中和 试验,此技术虽比较费时,但结果准确,重复 性好,至今仍公认为CCV诊断研究的参照. 4免疫酶技术Tuchiga等应用纯化的 CCV抗原或抗体IgG包破聚雨乙烯酶标反 应板,进行CCVBIISA和DASELISA试 验,所检测出的CCV抗体与抗原效价与微 量中和技术所测得结果相同国内成都军区 医研昕范泉水报道了CCVDASELISA. 农牧大学犬病研究中心范志强等根据犬Ig’G 与SPA具有较强亲和性的特点,应用CCV 特异犬IgG和酶标sIA,建立了病毒酶联细 胞试验(VEICIA),应用此技术检测细胞中 的t2CV和血清CCV抗体均已获得成功 j.RTPCR与拣酸璩针技术应用 RTPCR与核酸搽针技术,通过cDNA检 测而确定RNA病毒感染已有很多成功的报 道.农牧大学病究中心胡挂学荨根据 Wesseling发表的【.(VK378栋纤突蛋白 (S)基因序列设计台茈了4条寡聚核苷酸引 物,以美国CCVNLl8株反转录产物为棋 板,建立了CCVRTPCR技术.同时将昕 扩增的产物进行纯化,t示记a一I.制备成丁 CCV特异核酸探针.采用该两种方法对 CCV特异核酸进行了幢测,结果证明其具有 ?5’ 《中国养是杂志》l996年(7卷)第4期 较高的敏感性和特异性,可用于CCV分予 流行病学调查与基因工程研究. 六.防治 CCV感染目前尚无特异的有敏疗法,可 供参考的方法是:尽早采取对症治疗,根据不 弼的临床症状,采取止吐,止泻,补充水分,电 解质和抗菌消炎防止继发感染等.同时 加强护理,保持温暖和安静,则有助于病犬的 康复.农牧大学犬病研究中心应用CCV高 免血清结合中药”犬痢康”实验治疗CCV肠 炎效果较为满意. 在CCV感染预防方面,国外已研制出 商品性的CCV灭活和弱毒疫苗.Edwards等 报道,当犬血清的CCV间接荧光抗体效份 达1;8,中和抗体效价达1:4时就能获得临 床保护.Fulker等将CCV灭活苗与犬瘟热, 副流感,传染性肝炎和细小病毒性肠炎等弱 毒疫苗一起使用,证明不会产生任何不良影 响.国内夏成柱等应用所研制的CCV灭活 苗与先前研制的犬五联弱毒疫苗联合制成六 联疫苗,试验结果与Fhlker等报告的结果一 致,没有发现互相干扰现象.采取与原犬五联 相同的免疫程序,即仔犬从6—8周龄起.以 23周的时间间隔,免疫3次,每次肌肉注 射1个免疫剂量,对包括CCV感染的犬瘟热 等6种犬病毒性传染病,可提供1年的免疫 力. 七,讨论 当前在CCV感染的防治研究中,作者 认为存在的问题主要有如下三方面: I.在病原可面从王允海,刘海涛等所 报道的情况来看,国内的CCV感染远比国 外报道的严重;从胡崔学等的CCV病原学 初步研究情况来看,国内犬CCV感染率也 远比国外为高,病毒舟离的结果也与国外报 道的差距较大,即使用国际上公认的对CCV 最感的细胞来分离,有的毒株容易成功,有的 毒株则很困难;用C?EV特异引物来对不同 ? 6? 毒株进行RT—PCR扩增,则有些毒株能扩 增出与参考毒株相阿的核酸电泳条带,有些 毒株则不能,这是否提示国内所流行的CCV 存在不同的型或株?因为这关系到我国犬 CCV感染的诊断与防治研究,故作者认为有 必要给予重视并研究. 2.在诊断方面众所周知,及时确诊,发 现疫情是进行正确治疗与防治的前提.上连 CCV感染诊断方法,国内虽已建立,但均多 较为复杂,难以推广应用,故有必要组织人 力,物力加以研究,研制出适于临床应用的特 异诊断方法及其试剂.农牧大学犬病研究中 心具备这方面的条件:已从国内犬肠道和实 质脏器分离到4株CCV并从国外引进CCV NL一18参考株,并初步研究建立丁CCV中 和试验,VELCIA技术RT—Pc硅及核酸探 针技术这就为进一步开展CCV感染诊断 研究提供了有力的保证.不利的条件是尚未 查明国内CCV流行毒株间的抗原关系,也 缺少研究病毒抗原关系所需要的多种单克隆 抗体,在此诚恳邀请国内外同行与我们携手 合作+共同探索研究. 3.免疫方面为预防C.CV感染,虽然 国外已研制出商品疫苗,国内也正在开展这 方面的工作,但在这方面存在的同题还比较 多.且不说国内是否存在不同的CCV型或 株,也不说如何建立简便适用的免疫力测定 方法和,仅就免疫机理而言.该病毒为何 在犬体内如此长期存在,不少还存在于犬的 心脏中,它们在犬体内的生物学作用或者说 微生态意义是什么?与当前临床上发生的一 些犬的摔死症有无联系再就是有些CCV 感染犬临床康复后还可再次出现CCV感染 症,是复发还是再感染?如为后者则其获得性 免疫力又为何如此之短?这些都关系到CCV 感染的有效免疫研究,本人认为这也值得探 讨