仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响

仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响 仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋 白表达的影响 第29卷第1期第三军医大学Vol-29,No?1 2007年1月ACTAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAEJan?200715 文章编号:1000-5404(2007)01—0015—03 仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响 埝警 易发平,张平波,郭风劲,马永平.,宋方洲(重庆医科大学:基础医学院生物化学与分子生物学教研室, z重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆4@16;13本九州大学遗传资源 中心,福冈812-8581) 提要:目的研究仙台病毒载体复制序列对未成熟树突状细胞(dendriticcells,DC)蛋白质表达的影响,为联合运 用二者进行基因治疗提供依据.方法提取去除仙台病毒复制序列载体(Sev/?F),完全序列载体(SeV)转染未成熟DC 的总蛋白,定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像后选取差异点,胶内酶解后MAL— DI—TOFMS进行肽指纹图谱鉴定.结果图像分析结果显示,Sev/AF感染后的Dc明显比SeV感染后的Dc表达蛋白点 多,其中有不少蛋白表达量也明显上调.结论仙台病毒载体感染未成熟DC后引起蛋白表达的减少,这与SeV的复制序 列有关. 关键词:仙台病毒载体;复制序列;树突状细胞;蛋白质组 中图法分类号:R338.12;R373;R394.3文献标识码:A Effectofsendaivirusreplicationsequenceonproteinchangesinimmaturedendriticcells YIFa.ping'',ZHANGPing.bo,GUOFeng-jin',MAYong.ping',SONGFang— zhou?'(DepartmentofBiochemistry andMolecularBiology,BiochemistryandMolecularPharmacologyofChongqingCity,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnostics, MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;InstituteofGeneticResources,KyushuUniversity, Fukuoka812-8581,Japan) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheproteinchangeinimmaturedendriticcells(DC)exposedtosen— daivirusreplicationsequence,MethodsThetotalcellularproteinsexpressedinDCinfectedwithSev/AFor SeVwerecollectedandquantitated,thenseparatedbytwo— dimensionalgelelectrophoresisandvisualizedbysil— verstaining.DigitalimageswereanalyzedbyPDQuestsoftware.Thedifferentiallyexpressedproteinspotswere picked,digestedingelandsubjectedtopeptidemassfingerprintingusingMALDI— TOFMS.ResultsProtein spotsin2一 DEgelforDCtreatedbySev/AFweremorethanthatbySeV.amongwhichalotofproteinsin— creased.ConclusionItwasrelevanttothereplicationsequencethatproteinsdecreasedindendriticcellsin— fectedwithsendaivirusvector. Keywords:sendaivirusvector;replicationsequence;dendriticcells;proteomic 树突状细胞(dendriticcells,DC)是至今发现最强 的抗原递呈细胞,是启动,调控和维持免疫应答的中心 环节J,利用DC来增强机体特异性抗肿瘤免疫能力 的研究,已成为肿瘤生物治疗的重要课题.如果将抗 原引入未成熟DC,使之变为成熟DC,则在临床应用上 更为理想.仙台病毒属于副粘病毒科,副粘病毒属,经 过多次改良成为可以投入人体使用的基因治疗用病毒 载体.仙台病毒载体是细胞质型RNA载体,对各种动 基金项目:国家自然科学基金(3?71479),重庆市骨干教师资助计戈~J(200415) SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina30371479) andtheFundsfortheTalentTeachersofChongqing(200415) 作者简介:易发平(1974一),男,重庆市人,博士研究生,讲师,主要从事分子 生物学及蛋白质组学方面的研究.E—mail:yfpxy@163.eom 通讯作者:宋方洲,电话:(023)6848595g,E—mail:fzsongcq@163.cm 收稿日期:2006—01—23;修回日期:2006—05—24 物细胞有较高的感染效率;它本身不进人细胞核内,在 细胞质中进行基因表达;在理论上不存在改变细胞核 内染色体的危险性,具有更高的安全性J,在眼部疾 患,癌症,艾滋病,SARS等多种疾病进行研究和临床 开发.蛋白质组研究技术已被应用到生命科学的 各个领域.我们通过蛋白质组学方法来研究仙台病毒 复制序列对未成熟DC蛋白表达的影响,为联合运用 DC和仙台病毒载体进行基因治疗方案的提供实 验依据. 1材料与方法 1.1材料 IPG胶条购于amershamPharmaciaBiotech(Uppsa/a,Swe— den),trypsin(测序级)购于Promega(Madison,WI,USA),双向 6第i军医大学第19訾 电泳试刺购于BIO—IL~tD.TF^购于Siglr,其余斌剂采用国分 {=l于纯 C57BL'6小鼠.6,8同龄.体质茸l80g,2只.雌性,由日 本SIC株』?培育一 1.2方法 I2I求成熟DC的培养小鼠骨髓纲胞.片;圳^rII 25U/ml,GM—CSFOL./rll?10%RPMI1640培养摹于37:. CO:培养箱培养,第4天更换一培养摹,第7天回收Jr细胞 122l台病毒载悻转染禾成熟DC母1×l0细胞加 】00IO%RPMI1640培养基感染仙台病毒去除病毒复制 序列载『奉(sv,?F)完全序列载体(SeV)t感染重数,moi= 40),37Ih』J【1人10l?1不含【0【清的I川】640,混收集 细胞再培养Id l23样品制备胰翦处理收集到的2组细胞,醋酸镁缓 冲液洗涤数次,加^适最的裂解竣(7ml/I脲襄.2%CFIAPS. 65TTIII30L/Ll;Yl,O.5%IPG缓冲壤,蛋[J酶抑剂-.提取蛋白 并删定其浓度.于一70'C阵存备崩 I24议i凝胶电淋l坝向电泳参照Arnel'sharrl公技术 手册.18?"r,H3一lO段条,上样体积350】,J:{荦量100, 向等电聚焦设置50VI2h;500VIh;1000VIh;4【V 1h;6O0I)YIh;800O/0h胶条经平衡后进{SDS—PACE 电泳.银染溘检删蛋白,重复3次一 I.25差异蚩白的MAIJDI-TOF质谱分析技鉴定凝胶 照枰1后用I~1)()uest软件抒折确定蛋白点的分子量等电点和 斑点匹配哪取重复眭较好的差异蛋白点.般过脱色胰酶酶 解浓编,MAtDI—T(MS分析所得肮指纹惜进行数姑席 榆索.检索二[具MS— 2结果 2.1Se~,/?F,SeV感染DC双向电泳图谱差异 se,?F,感染DC后双向电昧罔谱差辟见图1通过 PDQuest软件分析显示.v/?F感染后的I)C明显比SeV感染 后的DC表选蛋白多其有不少蛋白表达垦也明I.渊. 蛋白质分于量主要处于40×1D一70×10.pl值土要分布于 48—80对其巾明湿表达匕爵的9个蛋白点作MAtDl_『】】} MS舒析 】9:明显连上调时9蛋白董;A:立f感淮采茬I)C诅 白电溶圉n:'感襄耒曳熟I]c最向乜译圆 图Istv,F和SeV转染的DC双向电泳图 2.2差异蛋白的肽指纹质谱分析和数据库搜索 Sev/?}'感染I)C后此时照明丧述l硐相91蚩自点作 肽指技图漕分析通过数据库搜索.笫台2-DE图醋f捆盹蛋 白质的分子量,值,鉴定出了其一1I8个盖置白点这8个 蛋白分别为小鼠钙牧蚩白篮磷酸孵1抑子I4A幢 基,吗苷酸结合蛋白,.2基蛋白氨簸徽酶,锌指蛋I 相关因子】抑K蛋6前体,70×l0热休克蛋l 3讨论 差异蛋白点l实验分子量为I2×10.pl为6t. 经多次雨复实验,仍未出现理想的肽指纹谱,仪有 2456和2788两个砸黹峰.这日】能是泼蛋在氢基酸 组成E比较特殊 仙台病毒结构蛋白P和L掏成复台体,与结美 白P和模板RNA共同作用.完成转录和复制过程 钙粒蛋白B参与翻译后嗣控,目时有关其功能的研究 报道甚少,蛋白磷酸酶_j蛋激晦州对应存在.共同 构成了磷酸化与去磷酸化这一重要的蛋白质性的阡 关系统仙台病毒结构蛋白中,l_监自除了在转录和 复制的起始,延伸,终止以受,nl{AA的甲牲化,戴帽, 多A化发挥酶的作用外,还具有2个蛋白激酶所拥有 的ATP结合点,负责NP祠『P蛋白的特殊磷酸化NP 蛋白的羧基末端(负扳)区还包钎许多磷酸化氨基酸 去除复制序列后,游离的NIP和I蛋自会增加,导致 蛋白磷酸酶浓度增加.从『面使其抑制于表达增『. 鸟苷酸结台蚩~-I(G蛋白)是由,13,单位组 成的异构三聚体:n皿单位有很高的j吗苻酸结合的 亲和力和特异性,并ri.自内瓣性(TP酶的活'去除 复制序列的仙台病毒,转录活性增强,结构蛋白分子增 多锌指蛋白238具有转录抑制功能'JHN蛋 白具有血凝和神经氯酸酶活性,这口能会影响细胞 信号通道传递.从而引起G蛋白我达的E渊 蛋白酪氨酸激酶是一类健化AFP卜.y-磷酸转移 到蛋白酪氨酸残基上的激酶,能催化多种底物蛋白质 酪氨酸残基磷酸化.庄细胞生长,增,分化中蕈 要作用受仙台病毒的刺激,Dc的生}乏,增硝和分 化受到影响,酪氨酸蛋白激脯丧丛l凋.同时,抑蛋 白的表达也上调.抑长蛋白6前体逆是酪氯艘蛋白激 酶受体AXLTYRO3和MER的配体,Fas件为-种 普遍表达的受沭分予.口f出现于多种细胞表面.Fas }H关冈子】只能增强但不能启动细胞凋亡热休克 蛋白家旌能够在fai死受体途径,JNK./SAPK途径 等多个水平发挥调节作崩, 用不I司的细胞因子诱导DC,同?蛋白的表达可表 第1期易发平,等.仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响17 现为上调或下调.虽然Sev/AF对比SeV转染 DCmainsforrec.gniti0nofthe5'-CNN-3'iyDNAq"i )~jX9个蛋白点表达上调,但相对 .. c usein , th 00 eco , ns 80( truc 4 tion ): ofartific — ialtrans . Bi 白表达而言,却是下调的.这除了与仙台病毒复制序[6]sH , I:kAhilT,Fti.alanalyi0fi. 列有关外,是否还与其结构蛋白和载体上的外源基因 dividal.ligosaccharidhai.fSendiihemagglutii. 相关,有待于进一步研究,我们也将陆续报 告.minidasepmtein[J].BiosciBiotechnolBiochem,2003,67(3):592 (致谢:日本九州大学张玲博士对本实验细胞培养部分提一598? 供了大力帮助,特此致 谢!)[7]MahabeleshwarGH,Da,sR,K""d"Gc?TYi"kinase,056lk-i"' 参考文献:involveactivationofepidermalgrowthfactorreceptor/extracellularsig- [1]SchottM,ScherbaumWA.Immunotherapyandgenetherapyofthy'9733— 9742 m|dcancer[J]_MiaEnd.crin.l,2oo4,29(4):l75—187?S.ngEJ , YimSH,KimE,.z.HumanFas-associatedfact.r1,in. [2]KfdWashilaY,Fuji.kaH,OhlsunlA,以.z?Th侬y"dafeoft eractingwithubiquitinatedpmteinsandvalosin-c0ntaini"gpmtein,is genetransferint.theporcineliverin泐byHVJ(Sendaiinl)liP.'i nv.lvedintheubiquitin-proteas.mepathway[J].MolCellBi.1, some[J].Transplantati.n,2005,80(11):l623一l629.2005 .25(6):2511—2524. [3]GriesenbachU,In0ueM,HasgawaM,e ,?s"daiinlsforg"[9]PereiraSR,FacaVM,GomesGG,e,.,.chanEesinthepmte.mic heraPYandvaccinationEJ]?c"OPi"MolTher2O05,7(4).J46 proilleduringdifferentiationandmaturati0nofhumanm.nocyte.deved 一 352.d endfiticce11sstimulatedwithgranu1.ytemacmphagec.10nystimula. [4]zh"gP,Y删m..K,AsoY,a1.Pr0l.micst"dies.?sof0nnSofti "gfactor/interleukin-4andlipopolysaccharide[J].Proteomics, theP25P"ofB.byxmoribr.i"[J].BiosiBi0lhnolBi0_2005 .5(51:lL86—1198. r] '2005'69(1 . 1):.一.(编辑龙亮) 5DllreierB,FullerRP,SegalDJ,eta1.Developmentofzincfingerdo.,…..… 术后治疗:人工周期治疗3个月,即雌,孕激素序贯法.于 术后2d开始服用雌激素1mg,每晚1次,连服20d,于服雌激 素后10d加用甲羟孕酮,每日10mg,连用3个周期. 2结果 随访1年,21例月经全部恢复正常,其中13例患者已妊 娠,占61.9%.剩下8例中输卵管阻塞5例,男方精液常规检 查异常2例,1例恢复月经后未来院随访. 3讨论 官腔黏连通常发生在妊娠子宫损伤后,特别是分娩或流产 后1,4周内刮宫常常造成内膜基底损伤裸露,纤维瘢痕形成 使子宫腔缩窄,扭曲,变形.本组21例中来源于妊娠后刮宫18 例,占85.7%.近年来生殖器感染的发生率增高,由感染引起 官腔黏连的几率也增高,本组3例无宫腔操作史,这无疑与感 染有密切关系. 传统的宫腔黏连分离法是用扩宫棒扩张,扩张后放宫内节 育器.这种手术非但盲目而且不能完全恢复原来的宫腔形态. 再黏连的发生率高,而官腔镜将诊断与治疗融于一体.对于膜 性黏连,纤维性黏连于宫腔镜下分离或手术剪除,术毕于官腔 放置气体导尿管防止再黏连,使患者恢复月经来潮,以达到生 育的目的.术后用雌孕激素行人工周期序贯治疗,促进子宫内 膜生长. 上环防止官腔再黏连的弊端:对不孕症患者需取环增加宫 腔操作史.无尾丝的环容易发生再次宫颈黏连,而有尾丝的环 易导致上行性感染,引起急性或亚急性盆腔炎发作.环作为异 物刺激宫腔及子宫内膜,可引起慢性炎症反应及子宫内膜损 伤,产生的前列腺素能引起子宫内膜白细胞及巨噬细胞增多, 子宫腔液体成分发生改变,产生无菌性炎症反应J. 临床观察发现,气囊导尿管官腔镜在官腔黏连致不孕治疗 中具有以下优点:?官腔镜明确了解官腔内的情况,并在镜下 进行分离.?因子宫是有腔的肌性器管,容量约5mlL3].气囊 导尿管有气囊,注人生理盐水后有水囊形成可以扩张宫腔,且 持续2周,让子宫内膜修复,防止官腔再黏连.?导尿管为圆 形防止颈管黏连.?取出气囊导尿管时,只需抽出气囊内液 体,不需进入宫腔,容易操作. 综上所述,在因官腔黏连致不孕的治疗中,采用官腔镜下 分离官腔黏连后,气囊导尿管扩张官腔防治再黏连,术后配合 人工周期治疗3个月,方法简单,疗效好,值得临床推广. 关键词:气囊导尿管;官腔镜;官腔黏连 中图法分类号:R713.7文献标识码:B 参考文献: [1]冯缵冲,邵敬於.实用宫腔镜学[M].上海:上海医科大学出版社, 1999:68. [2]罗丽兰.不孕与不育[M].北京:人民卫生出版社,1998:192. [3]乐杰.妇产科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2004:334 — 388. (编辑汪勤俭)