红霉素

红霉素 第五章 大环内酯类抗生素 第一节 概述 大环内酯类抗生素是以一个大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和1~3个分子的糖相随着结的一类抗生物质。 大环内酯类抗生素能抑制许多革兰阳性菌和某些革兰阴性菌，不同类型的大环内酯类抗生素呈现的生物活性差异较大，一般说碱性大环内酯抗生素的抗菌活性较强，十六元大环内酯抗生素抗菌活性最强。许多大环内酯类抗生素对耐青霉素的葡萄球菌和支原体有效，某些大环内酯类抗生素对螺旋体、立克次体和巨大病毒有效，个别品种还有抗原早作用。它们之间易产生交叉耐药性，毒性低。红霉素最早被应用于临床，竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素(柱晶白霉素)、麦迪霉素、交涉霉素等也相继广泛应用于临床。 根据大环酯结构的不同，这类抗生素又分为三类:多氧大环内酯(polyoxo mactolide);金烯大环内酯(polyene macrolide);蒽沙大环内酯(ansamacrolide)。 1、多氧大环内酯抗生素 按大环内酯环的碳元素数，又分为12元环、14元环和16元环三类。它们都是多功能团的分子，大部分都联结有二甲胺基糖，因而显示碱性。有的不含二甲胺基糖，只含中性糖，因而显中性。作为医疗使用的多数是碱性大环内酯抗生素，重要的有14元环的红霉素(erythromycin)、竹桃霉素(oleandomycin)，16元环的吉他霉素(kitasamycin)、交沙霉素(josamycin)、螺旋霉素(spiramycin)等。近年来还发现麦迪霉素(midecamycin)、针棘霉素(espinomycin)和马立霉素(maridomycin)等抗生素。至于12元环抗生素，目前都没有用于临床。自1950年至今已经确定化学结构的约有100多种，在大环内酯抗生素中，与大环内酯相连接的氨基糖和糖的结构都是自然界不常见的结构(图5-1)。 各种大环内酯类抗生素的化学结构式，见图5-2、图5-3和表5-1。 此类抗生素的作用机理是与核糖蛋白体50S亚基的特殊部位结合，选择性抑制原核细胞蛋白质合成。对病原性细菌有选择性抑制效应，因而其毒副作用较低。 2、多烯大环内酯抗生素 自1950年发现制霉菌素以来，已报道100多种，其分子结构特征是具有26~28元大环内酯，在多元环内酯环中，含有4~7个共轭双链。按照所含共轭双键的数目，可分为四烯(tetraene)(两性霉素A)、五烯(pentaene)、六烯(hexaene)(如制霉菌素)、七烯(heptaene)(两性霉素B)等类。这几类抗生素因分子中双键数目的不同，会表现出不同特征的紫外吸收光谱，该类抗生素多数同氨基糖相结合，由于结构的不同，表现出不同的生物活性，见表5-2。 多烯大环内酯抗生素对许多致病性真菌有不同的抑制作用，其抗菌活力随共轭双键数目的增加而增加。此类抗生素可与真菌细胞膜的固醇类成分结合，改变细胞膜的通透性，真菌和哺乳动物细胞膜中都含有固醇，而细菌细胞膜中则不含固醇。故此族抗生素可引起真菌细胞膜透性改变，导致致病菌死亡，而对细菌无效。 3、蒽沙大环内酯抗生素 蒽沙大环内酯抗生素又叫环桥类抗生素(ansamycins)，严格说来，不应属于大环内酯类。它们有着一个共同的结构形态，都是一个脂及链桥经过酰胺键与平面的芳香基因的两个不相邻位置相联结的环桥状化合物，其结构模型示图5-4。由于其脂肪链的结构和立体化学与大环内酯类很相似，所以把这一类抗生素亦归在这一章中。此族抗生素的抗菌谱较广，还有抗癌活性。属于该族的抗生素有10种以上，这10种抗生素又分为两小类:一类是含有萘醌的抗生素，如利福霉素(rifamycins)、多利霉素(tolypomycin Y)、链伐立星(streptovarycin)等;另一类是含有苯醌的抗生素，如土块霉素(geldanamycin)。其中以含萘醌的数目较多，临床上最重要的是利福霉素。 利福霉素是地中海诺卡菌(Nocardia mdediterranei，以前误分类为链霉菌)产生的一类抗生素。该菌在普通培养基上至少产生五个组分，即利福霉素A、B、C、D和E，其中以B易于分离精制，又最有价值。它具有强大的抗菌作用，特别是对革兰阳性的金黄色葡萄球菌及阴性的结核杆菌的抗菌活性显著地高于青霉素G钾盐与苯唑西林。 由上可见，属于大环内酯类的抗生素品种很多。由于这类抗生素中研究得最多的、并且早已投入工业生产的是红霉素，故本章以红霉素为代表讨论其结构与理化特性、生产工艺和其影响因素。 第二节 红霉素的结构与理化性质 红霉素(erytrhromycin)是1952年从红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)的培养液中分离出来的一种碱性抗生素。后来从发酵液中又分离出红霉素B、C、D、E等组分。其中以红霉素(即红霉素A)为主要组分，而B及C在发酵液中也有一定数量。他们的抗菌谱相同，但抗菌活力不同，其中以A为最强，其他几种组分都比A小。红霉素B的体外抗菌活力只有红霉素A的75%~85%，红霉素C和D约为50%，红霉素E仅有10%~15%的活性，因此在临床上，所使用的是红霉素A及其各种盐类。 1、结构 红霉素是由红霉内酯(erytrhronolide)与去氧氨基已糖(desosamine)和红霉糖(cladinose)缩合而成的碱性苷。红霉内酯环含有13个碳原子，内酯环的C-3通过氧原子与红霉糖相联结，C-5通过氧原子与去氧氨基已糖相联接。红霉糖本身不含氮，是含有一个甲氧基的已糖，去氧氨基已糖是3-二甲胺基去氧已糖。红霉素各组成分的结构见表5-3。 2、物理性质 红霉素是一个碱性化合物，能和无机或有机酸类形成在水中溶解度较大的盐类，如临床上使用的乳糖酸红霉素等。 红霉素碱可以有三种不同的结晶形式，它们的结晶水含量和熔点都各不相同，其中有两个晶形的溶点为130~132?，另一个为190~192?。虽然晶形不同，但生物活性和其他性质都未改变。风干红霉素含水量为7%~10%。当晶体完全失水后,就变成无定形粉末,但仍不失去活性.红霉素各组分的一般理化性质见表5-4. 红霉素碱性溶于醇类、醚、丙酮、氯仿和醋酸乙酯、醋酸戊酯，不甚溶水，在水中的溶解度与一般化合物不同，如:60?，1.14mg/mL;40?，1.28mg/mL;19?，3.10mg/mL;7?，14.20mg/mL;1?，15.00mg/mL。红霉素在水中的溶解度是随温度升高而减小，以55?时为最小，因此工业上利用此性质加温至45~55?并保温，使红霉素碱从水中析出结晶。 3、稳定性 红霉素在干燥状态下是稳定的，结晶在室温下可保藏1年，效价并不降低。在pH=6~8的水溶液中也很稳定，在4?下放3星期，效价并不降低。如在室温下，1星期后略有损失，但再经7星期，其效价并不再继续降低。红霉素溶液在60?保持5min并不破坏，但在 pH=6~8范围以外的水溶液，经24h即失效。 4、化学性质 红霉素在碱性条件下，内酯环易破裂，加酸后，也不再成环。在酸性条件下，苷键易水解，经1mol/L盐酸甲醇溶液的温和水解，其中的一个苷键即破裂，得到一种碱性物红霉糖胺(erythralosamine)和红霉糖。红霉糖胺再经6mol/L盐酸水解，就得到去氧氨基已糖。 红霉素中的红霉内酯环有一个活泼的酮基，它能和红霉素分子的其他功能基团起反应，用各种不同试剂解离出红霉糖和去氧氨基已糖都必然会改变这个环的结构，因此，得不到游离的红霉内酯。如用硼氢化钠将红霉素的酮基还原，红霉素就失去原有的酮基，转变为二氢红霉素(没有抗菌活性)，再水解去掉其中的二糖，就能得到二氢红霉内酯(dihydroerythronolide)。 红霉素发酵液中，除了红霉素A外，还含有红霉素B及C。红霉素B在提炼过程中和红霉素一起结晶析出。红霉素在酸性溶液中不稳定，而红霉素B则比较稳定，因此可利用稳定性的差别来精制红霉素B。红霉素B与红霉素一样，受温和的酸性水解产生红霉糖，但受强烈酸性水解，就不像红霉素那样产生丙醛，而是产生巴豆醛(crotonaldehyde)的衍生物。这两个红霉素性质的区别在于此。 第三节 红霉素的生物合成 红霉素是红霉内酯、红霉糖和去氧氨基已糖三部分以苷键相连接而成的。应用同位素法和对阻断变株产物进行分析，弄清了生物合成的主要步骤，但对其中所涉及酶的性质，了解得还很少，尚待进一步深入研究。 1、红霉内酯的生物合成 红霉内酯是21个碳原子组成的14元内酯环。参照四环类抗生素生物合成的研究，分析红霉内酯的结构特点，认为它是由7个丙基单位构成的。使用碳标记的醋酸盐、丙酮酸盐、丙酸盐或琥珀酸盐等化合物进行红霉素发酵试验，发现它们中的标记碳原子都分别进入红霉内酯环中，完全没有进入红霉糖和去氧氨基已糖。证明红霉内酯的碳架来源于内酸盐。同时，试验结果表明，红霉内酯是由一分子的丙酰CoA和6分子的甲基丙二酰CoA通过丙酸盐头部(—COOH)至中部(C)的价键重复缩合构成的，其合成过程如图5-5所示。 2 产生菌无细胞抽提液的酶活性实验表明，丙酸激酶的活性与红霉素产量呈直线关系。 2、糖的生物合成 同位素法研究表明红霉素中的红霉糖和去氧氨基已糖的碳架来源于完整的葡萄糖或果糖。转化过程如图5-6所示，其中反应的中间体可能是胸腺苷二磷酸酯( TDP)结合的糖。至于糖上的C-CH、O-CH和N-CH都来源于蛋氨酸，而去氧基已糖上的N来源于谷氨酸。333 综上所述，红霉素的碳架来源如图5-7所示。 3、红霉素生物合成的最后步聚 经采用红霉菌生物合成阻断突变株的中间产物分析和转化试验，红霉素生物合成的最后步骤已经基本清楚。其合成步骤如图5-8所示。 过去一直认为红霉素A是红霉素链霉菌生物合成红霉素的最终产物，但是，最近在发酵液中又发现一种新的红霉素，叫红霉素E。他是由红霉素A缓慢代谢形成的，他的分子中含有一个在大环内酯类抗生素中未曾报道过的新型原酸酯(orthoester)基。由于红霉素E的抗菌活性很低，因此他不是所希望有的产物，如能选育出能封闭这步反应的变株，有可能提高红霉素A的产量。 第四节 红霉素的生产工艺 红霉素是1952年由麦夸尔(McQuire)等于菲律宾群岛找到的红霉素链霉菌(Streptomy-ceserythreus)所产生的代谢产物。目前仍然采用该菌的变株来生产红霉素游离碱，再由其制成各种盐类或酯类，如乳糖酸红霉素、红霉素硬脂酸酯、红霉素碳酸乙酯和无味红霉素等。 一、生产菌种 红霉素链霉菌在合成琼脂培养基上生长的菌落，是由淡黄色变为微带褐的红色，色素不渗透到培养基中，气生菌丝为白色，孢子丝呈不紧密的螺旋状，约3~5圈，孢子呈球状，常用砂土管或冷冻管保存，以冷冻保存的孢子质量好。 提高红霉素链霉菌生产红霉素的能力，仍以诱变育种为主要手段。常用的诱变因素有紫外线、X射线、快中子和乙烯亚胺、硫酸二乙酯、氮芥等。以快中子的效果最好。快中子的剂量为10~30krad(1krad=10Gy)，正变株的频率显著增加，产量提高的幅度最大。红霉素链霉菌的形态变异与产量之间有一定的相关性，常见的有产生孢子和不产孢子两烊，前者有产红霉素的能力，而后者产量很低或完全不分泌红霉素。红霉素链霉菌孢子颜色特征也与产 量之间有一定的相关性，一切颜色特征不同于亲本的突变株已完全丧失产生红霉素的能力，而颜色与亲本想似的菌株在不同水平上保持产生抗生素的能力。因此红霉素的生物合成似乎与亲本菌株的培养特征有关。 在红霉素的生产中，不少国家都出现过噬菌体污染问题。因此，在菌种选育上，侧重抗噬菌体菌株的研究。另外，研究发现提高丙酸激酶活性或基因拷贝数有利于红霉素产量的提高。 二、发酵工艺及控制要点 红霉素发酵一般采用孢子悬液接入种子罐，经二级种子扩大培养后移入发酵罐，利用分批补料的方式，进行发酵生产。 1、孢子培养一般采用淀粉、玉米浆、硫酸铵等琼脂斜而培养基，37?，培养7~8d，即生长成熟。 孢子培养基中的配比适当与斜面孢子的质量和菌种的发酵单位有重要的关系;琼脂本身的质量对孢子质量和数量也有重要的影响，而这一点常常为人们所忽视。为了减少因琼脂产地、加工方法不同而引起斜面质量的差异，可用水先琼脂，除去某些可溶性杂质，以提高和稳定孢子质量。光对斜面孢子生长有抑制作用，应该避光培养。 2、种子培养及控制要点 种子培养是采用淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵和碳酸钙等组成的培养基。直接用红霉菌孢子悬液亦可用摇瓶种子培养液作种子罐接种。各级种子于28~35?进行培养，经一定时间后，种子生长成熟，即可移入发酵罐。 种子培养的成分和质量对孢子发芽和种子质量都有重要影响，种子质量还与种子培养时消耗功率的大小有明显关系，在不损害菌丝的情况下，增加种子培养的输入功率，能使红霉素的发酵单位直线上升。 3、发酵生产及控制要点 红霉素发酵一般都使用复合培养基:淀粉、葡萄糖为碳源;黄豆饼粉、硫酸铵为氮源;以碳酸钙作缓冲剂;丙酸作为前体。接种量为10%，培养温度为28~35?，pH值为7.0。 (1)培养基 发酵培养基最适碳源是蔗糖，在蔗糖浓度为7.0%时，红霉素产量和菌丝干重为最大，各种碳源的效果大小的顺序为:蔗糖,葡萄糖,淀粉,糊精。从红霉素的生物合成途径来看，葡萄糖是直接进入分子中的，而蔗糖需经分解为葡萄糖和果糖后才能被利用，蔗糖之所以比葡萄糖适合，可能是蔗糖的分解速率正适合菌体对糖的利用速率，不会因单独使用葡萄糖而积累中间产物或使pH值下降。采用葡萄糖和淀粉的混合碳源，其效果与使用蔗糖是相似的。 由于糖类是用于构成红霉素分子的碳原子，当糖耗尽时，由于缺乏合成红霉素的原料，合成就会停止，因此在发酵过程中通过补料形式进行控制。 丙酸是红霉内酯的前体物质，但因丙酸对菌丝体生长有抑制作用，所以在基础培养基中的用量需要控制，一般认为0.2%的用量比较好。其余的量最好是采用连续或间隙添加的方法，以调节正丙醇在培养基中的量，保证生物合成达到最高水平。近期研究表明，正丙醇除了起前体作用外还是红霉素链霉菌合成乙酰CoA羧化酶的诱导物。这种诱导作用可能发生在转录水平。关于各种醇类对红霉素生物合成的影响，曾以红霉菌IBA-355进行试验，其结果如表5-5所示。 红霉素生产中一般多用有机氮源，其中以黄豆饼粉、玉米浆为最佳。通过单氮源实验表明，缬氨酸的影响最大。氮源的代谢对红霉素合成是一个重要因素，无论在合成培养基或复合培养基中，只有当适于菌体生长的氮源用尽时，菌体量停止增长时，才开始迅速合成红霉素。这就表明红霉素的生物合成和菌体生长本身无关，适合菌体生长的氮源，还可能是抑制红霉素合成的因素。在研究发酵培养基的碳氮化与红霉素生物合成关系时发现，不同菌株合 成红霉素所要求的碳氮比是不同的，有的在碳氮比为20时，发酵单位最高，有的在碳氮比为12时，发酵单位达最大值。因此依据产生菌的要求，在发酵过程中控制培养液的碳氮比是提高发酵水平的关键。 在无机盐中，铁盐可以降低红霉素的产量，如培养基含有400μg/mL的铁，培养液中的效价就会降到零，见表5-6。 (2)发酵条件控制 在稀薄培养基中，通气效率较好，能够满足菌的需氧量，所以红霉素的生物合成不受通气的影响。但在丰富培养基中，红霉素的产量则随通气速率的增加而提高。 菌体在代谢过程产生的二氧化碳对红霉素的生物合成是有影响的，据报道，二氧化碳的分压增加时，对红霉素的合成有明显的抑制作用。自发酵15h后开始导入二氧化碳(按进气量11%)，直到发酵结束，红霉素的合成量减少至40%，合成率从0.2U/(h?mL)降到0.07U/(h?mL)。但二氧化碳分压的增加并不影响红霉素链霉素菌的生长。二氧化碳对红霉素合成的抑制作用可能是由于二氧化碳与丙酸盐反应形成的甲基二酸所产生的反馈抑制，使红霉内酯的合成受到抑制而降低发酵单位。 红霉素链霉菌生长的最适pH值为6.7~7.0，而红霉素合成的最适pH值为6.7~6.9。pH值的改变对红霉素生物合成的影响很大。因此，高速好培养基中生理酸性和生理碱性物质的用量，以保证发酵过程中pH值在适当范围。、 三、提取和精制 红霉素是一个碱性化合物，碱性时可溶于有机溶剂中，而在酸性时则能溶于水中。因此，目前主要采用溶剂萃取法来提取，所用溶剂有醋酸丁(戊)酯、二氯甲烷、丙酮等。进行反萃取时酸的提取液，有醋酸缓冲液、磷酸冲缓液，也有用柠檬酸缓冲液。红霉素提取的步骤如下: 比较醋酸丁酯、醋酸戊酯、二氯乙烷、氯仿和二氯甲烷等不同萃取剂的提取效果，发现他们的分配系数几乎相同，但用于发酵滤液的分配系数(31~39)要比用于水溶液的(50~54)低，所得红霉素的质量没有明显差别(都在890~895μg/mg之间)。通过对从有机溶剂相转入水相所用的反萃取剂提取效果的比较(曾比较了0.25mol/L醋酸、0.67mol/L硼酸、0.05mol/L草酸、0.017mol/L柠檬酸以及2/15的磷酸二氢钾和用气态CO酸化过的水等)，发现醋酸缓2 冲液具有最大的反萃取能力，对成品质量无甚影响，硼酸缓冲液虽有较大的分配系数，但他能与红霉素形成稳定的硼酸盐配合物，所以不能作用反萃取剂。 溶液pH值对萃取物质量有一定的影响。试验结果表明，在pH=9.0~10.0，用醋酸丁酯进行萃取。在pH=4.0~5.0用磷酸缓冲液进行反萃取，这样的萃取选择性质最高，所得红霉素提取物最线性。萃取中所形成的乳浊液的稳定性随着pH值的升高而增加。为了克服乳化现象，国外报道，用不含胰酶的蛋白酶(pacreatin freeprotease)(如无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶一类)及酯酶进行保温消化处理发酵液，就可减轻或避免提炼过程中的乳化现象，并能提高原发酵液的单位。 为了进一步纯化红霉素，将红霉素制品溶于丙酮中，再加入两倍体积的水，即得红霉素纯品，干燥后其纯度可达970U/mg。符合药典要求。 在萃取溶剂中用直接成盐的方法可制备红霉素盐化合物，其中包括丙烯基红霉素十二烷基硫酸盐(propinyl erythromycin xaurylsulfate)、红霉素氨基碘酸盐、红霉素乳酸盐及红霉素硫氰酸盐。如制造红霉素乳酸盐，得到的高浓度萃取液，用无水硫钠要干燥，过滤，于滤液中慢慢加入乳酸的醋酸丁酯溶液，直到pH值达到5.1，同时搅拌，就形成白色乳酸盐结晶沉淀。结晶物可在不超过55?下进行真空干燥。收率可达理论值，纯度为830μg/mg，熔点为110~112?。其他的盐，可用相似的方法制得。 红霉素是碱性化合物，在中性和酸性条件下呈阳离子，所以还可用离子交换法来提取。 从不同阳离子交换树脂吸附红霉素的结果来看，用低交联度磺酸型阳离子交换树脂(聚苯乙烯型)是有效的，交联度愈高，孔率愈低，吸附红霉素的能力愈差。可采用交闻度约为1%~5.5%的多孔性阳离子交换树脂，在pH=5.5~7.0(pH,5.5，红霉素十分不稳定,条件下进行吸附，用水、3%及60%甲醇液洗涤，有效地除去有色杂质，再用碱性醇溶液缩萃取。总收率按发酵滤液计可达70%。亦可用低交联度的钠型羧阳离子交换树脂从中性滤液中吸附红霉素。还可采用吸附法提取红霉素，用苯乙烯-二乙烯苯大网格吸附剂来吸附。有机溶剂洗脱，收率和纯度均较好。