卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响

卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响 第 5 卷 第 2 期 生命科学研究V o l. 5 N o. 2 2001J une 2 0 0 1 年 6 月 L ife Sc ien ce R e sea rch α 卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响 1 2 3 3 4 2 范必勤, 钱云, 师蔚群, 朱猛进, 丁家桐, IY u tak a FU KU(1. 南京医科大学第一附属医院人类生殖医学研究中心, 中国江苏 南京 210029; 2. 江苏省农业科学院 畜牧兽医研究所, 中国江苏 南京 210014; 3. 扬州大学畜牧兽医学院, 中国江苏 扬州 225009; 4. O b ih iro ), , 08028555, U n ive r sity o f A g r icu ltu re and V e te r ina ry M ed ic ineO b ih iro J ap an 摘 要: 研究卵泡内环境对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育的影响Λ 主要结果如下: 直径?5 、4, 4. 9 、3, 3. 9 和 2, 2. 9 的卵泡卵母细胞体外成熟率分别为 90. 5% 、89. 7% 、85. 4% 和mm mmmm mm 67. 4% Λ体外受精后, 卵母细胞的发育能力随卵泡直径的增大而增强, 直径?5 和 4, 4. 9 卵泡卵的 22 mm mm () 细胞、3, 42细胞发育率显著高于直径 2, 2. 9 的卵泡卵 < 0. 05 或 0. 01Λ体外成熟培养3 6 、42 和 48 mm P hh () , 直径 2, 2. 9 卵泡卵的体外成熟率, 体外受精后的卵裂率差异不显著 > 0. 05Λ 在体外成熟培养液中h mm P 添加 5% 或 15% 的不同直径卵泡的卵泡液, 各组间卵母细胞的体外成熟率, 受精卵的体外发育率均无显著差 异Λ 结果明: 卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育有重要影响Λ 关键词: 猪; 卵泡内环境; 卵泡卵母细胞; 体外成熟; 体外受精; 体外发育 () 中图分类号: 132; 954. 4 文献标识码: 文章编号: 100727847 20010220114206 Q Q A Ef f ec t of Fo ll icular M icroen v ironm en t on in vit ro M a tura t ion an d D eve lopm en t of Porc in e Fo ll icular O ocy te s 1 2 3 , 2, 2, Q IA N Y u n SH I W e iqu n ZHU M en gjin 3 2 42, 2, D IN G J iato n gFA N B iq in Y u tak a FU KU I ( 1. , , R esea rch C en te r of H um an R ep rod u c t ion T h e F irs t A f f il ia ted H osp ita l of N anj ing M ed ica l U n iv e rs ity 210029, , ; 2. , 210014, , N anj ing J iang su C h inaJ iang su A cad em y of A g r icu l tu ra l S c iencesN anj ing J iang su ; 3. , , 225009, , C h inaC ol leg e of A n im a l S c ience and V e te r ina ry M ed ic ineY ang z h ou U n iv e rs ity Y ang z h ou J iang su ); 4. , , 08028555, C h inaO bih iro U n iv e rs ity of A g r icu l tu re and V e te r ina ry M ed ic ineO bih iroJ ap an A bstra c t: T h e effec t o f th e m ic ro en v iro nm en t o f fo llic le s f rom w h ich th e oo cy te s o r ig in a te o n th e ir ( ) . su b sequ en t in v it ro deve lopm en ta l ab ility w a s in ve st iga tedT h e in v it ro m a tu ra t io n IVM ra te s o f , 4.3, 3.49 po rc in e fo llicu la r oo cy te s de r ived f rom an t ra l fo llic le s?5 mm , 9 mm , 9 mm an d 2, 2. mm in d iam e te r w e re 90. 5% , 89. 7% , 85. 4% an d 67. 4% , re sp ec t ive ly. A f te r fe r t ilized in v it ro, th e . deve lopm en ta l com p e ten ce o f oo cy te s in c rea sed p ro g re ssive ly w ith fo llic le s sizeT h e h igh e r c leavage 3, 42? 4 2,ra te s an d th e p ropo r t io n s o f ce ll em b ryo s w e re o b ta in ed f rom mm fo llic le s com p a red to ()2. 9 < 0. 05 0. 01. 22mm fo llic le s P o r T h e IVM ra te s an d ce ll c leavage ra te s o f oo cy te s de r ived f rom 2, 2. 9 36 , 42 48 mm fo llic le s w e re fo u n d w itho u t sign if ican t d iffe ren ce b e tw een cu ltu red h h an d h fo r ( ) . 5% 15% m a tu ra t io n in v it roSupp lem en t o f o r po rc in e fo llicu la r f lu id P F F f rom la rge fo llic le s in th e IVM m ed ium d id no t sign if ican t ly in c rea se th e c leavage ra te o r em b ryo s y ie ld com p a red to P F F . , f rom sm a ll fo llic le sIn summ a ryth e re is a c lea r re la t io n sh ip b e tw een fo llic le size an d oo cy te qu a lity ( ) ( ), .in te rm s o f IVM in v it ro fe r t iliza t io n IV F an d in v it ro deve lopm en t IV D α 收稿日期: 2000212206; 修回日期: 2001202219 ()基金项目: 南京医科大学科技创新基金资助项目 200002 CX ( ) 作者简介: 钱云 19732, 男, 江苏丹阳人, 南京医科大学第一附属医院实习研究员, 硕士, 主要从事哺乳动物生殖生理学研究, : 0252371883626339, 2: @ 163. .T e lE m a ilyunq ianne t ( ) : ; ; ; ; Key word spo rc in efo llicu la r m ic ro en v iro nm en tfo llicu la r oo cy te sin v it ro m a tu ra t io n IVM in v it ro ( ) ( ); fe r t iliza t io n IV F in v it ro deve lopm en t IV D (() ) , 2001, 5 2: 114, 119L if e S c ien ce R esea rch 10进行Λ 卵泡液和 取自不同直参考文献 早在 70 年代就有研究证实哺乳动物卵母细 CO C s ( ) 胞 必须在卵泡中充分生长 才能在 fu ll g row in g 径的卵泡, 组 1: 卵泡直径?2, 2. 9 mm , 组 2: 卵 1, 2 体外经历自发成熟Λ 等研究认为卵泡成泡直径 3, 3. 9 , 组 3: 卵泡直径 4, 4. 9 , D in g mm mm 熟平行于内部的卵母细胞, 两者在功能上存在相 组 4: 卵泡直径 5 Λ 挑选卵丘细胞层完整且包 mm 裹紧密, 胞质均匀的 移入成熟培养液微滴关, 卵泡发育过程中的分化可能影响卵母细胞的 CO C s ( 质量, 不同大小卵泡中的卵母细胞可能处在不同 添 加 了 N aH CO 3、H ep e s、丙 酮 酸 钠、D 2葡 萄 糖、 3 的发育阶段Λ 等研究发现卵母细胞体外 Epp ig 乳酸钙、双抗的 T CM 199 液+ 10% FC S + 10 IU ƒ 成熟和体外发育能力与体外培养初始卵母细胞所 mL PM SG+ 10 IU ƒmL PM SG+ 10 IU ƒmL H C G ( ) 中处的发育阶段有关, 这主要是由于不同发育阶段+ 1m gL 17Β2E 2 pH : 7. 38中 培 养 每 100ΛL ƒ 4 ) 各种 和蛋白质的合成有差异Λ 研究者们 RN A 10, 15 枚, 微 滴 上 覆 盖 矿 物 油Λ 培 养 条 件 为 39?、5% 、饱和湿度Λ 各组卵泡液 1 000 离 对牛、羊卵泡卵母细胞质量与卵泡大小的相关性 CO 2g 进行了系统研究, 发现在卵母细胞培养初始, 卵泡 心 20 , 上清液经 0. 22 过滤膜过滤灭菌, 2m in Λm 大小对卵母细胞的体外发育能力具有重要判定价 20?冻存, 使用时分别以 5% , 15% 的浓度加入卵 值, 大卵泡卵比小卵泡卵更具有体外生长发育能 母细胞体外成熟液Λ 力, 卵泡的特征似乎是决定卵母细胞体外受精后 1. 2 附睾精子的冷冻及受精前处理5, 6 发育能力的重要参数Λ 附睾精子冷冻方法参考文献11 Λ 解冻后精 子活力不低于 0. 7Λ 解冻后的精液离心洗涤 2 次, 目前, 体外生产猪胚胎一般取卵巢表面直径 88 3, 6 或 2, 5 的卵泡卵, 经体外成熟培养 除去上清液Λ 调整精子浓度, 以 2×10, 4×10 ƒmm mm ( ( 后 发现这类卵母细胞完成核成熟 生发泡破裂, 悬浮于精子孵育液 添加了 3、、 mL N aH CO H ep e s ) , 的比例在不 丙酮酸钠、2葡萄糖、乳酸钙、双抗的 液199 ge rm in a l ve sic le b reak dow n GV BD D T CM 7 ( ) ) 同的研究者之间差异很大 15%, 90% Λ 研究 + 12% : 7. 80中, 在 37?, 5% 浓度,FC S pH CO 2 认为造成这种差异的主要原因是这类卵泡不同的饱和湿度条件下孵育 1 , 备用Λh 1. 3 体外受精, 使得其内部 期卵母细胞大小和卵龄的差异 GV ( 成熟培养 36 后, 将卵丘细胞充分扩散的卵 h 在核的形态上存有差异 散布在 2I 到 2K GV GV 7, 8) ( (之间 母细胞判为成熟, 用受精液 含 10 2ƒ, 2 Λ 另外, 该类卵泡卵经体外成熟 gL B SA V in v it ro ( )) ƒ咖啡因的 液 洗涤 3 遍后,: 7. 40、 体 外 受 精 in v it romm o lm a tu ra t io n , IVM L BO pH () fe r t iliza t io n , IV F 后 正 常 受 精 的 卵 母 细 胞 数 较 移入受精液微滴中, 然后加入经孵育的精子液 每 7 低, 受 精 卵 在 体 外 培 养 仅 有 3% 能 发 育 到 囊100 有 15, 20 枚卵子, 精子终浓度为 2 ×10ΛL 7 9, 10) , 4×10Λ 臵 培养箱中 39?, 5% ,ƒ胚 Λ 所以, 直径 2 以上的猪卵泡卵母细胞mL CO 2 CO 2 mm 饱和湿度条件下共同培养 12, 16 Λ 为评定该体 由于卵泡的差异, 经 后完成核成熟的能力非h IVM 系是否能完成体外受精, 取部分受精卵固定、醋酸 常不一致, 而且仅有少部分能完成全部的胞质成 地衣红染色, 在倒臵显微镜下检查, 以卵母细胞内 熟获得支持胚胎发育的能力Λ因此, 有必要加强对 见有膨大精子头部和尾部或出现雌雄原核而判定 卵泡的选择, 找出与卵母细胞成熟点相关的卵泡 为受精卵Λ特征参数Λ 1. 4 受精卵体外培养1 与方法 ( 将 受 精 卵 在 体 外 发 育 液 添 加 了 、N aH CO 3 、丙 酮 酸 钠、60% 糖 浆 的 乳 酸 钠、双 抗 的1. 1 卵母细胞、卵泡液的获取与处理, 卵母细胞H ep e s ) 液+ 10% : 7. 40中充分洗涤,199 的体外成熟培养T CM FC S pH 除去周围粘着的精子和卵丘细胞, 以每 100 中卵巢的采集、处理与运输和卵丘2卵母细胞复 ΛL (15, 20 枚移入颗粒细胞已铺层的体外发育液中) 合 体 2的 获 取, cum u lu soo cy te com p lex e sCO C s 显著性检验Λ培养, 每隔 24 h 换 液 并 观 察 受 精 卵 体 外 发 育 情 况Λ结果2 1. 5 颗粒细胞单层制备 取成熟培养 36 的卵丘细胞充分扩散的卵2. 1 卵泡大小对卵母细胞体外成熟的影响h , 用 0. 1% 透明质酸酶消化, 打散卵丘细胞从直径?5 以及直径为 4, 4. 9, 3, 3. 9,母细胞 mm ( ) 团 颗粒细胞团, 颗粒细胞经受精卵体外发育液2, 2. 9 卵泡中收集卵母细胞, 分别在体外成 mm 5 充分洗涤后, 以 1×10熟 培 养, 36 后 成 熟 率 分 别 为 90. 5% , 89. 7% , ƒmLh 加入受精卵培养液中 培养, 铺层备用Λ85. 4% , 67. 4% Λ虽然直径大于 3 mm 的 3 类卵泡 () 1. 6 实验数据处理> 0. 05, 但它们均 卵 体外成熟率无显著差异 P ( ) 采用 统计软件对实验数据进行SA S sy stem 显著高于直径为 2, 2. 9 的卵泡卵 表 1Λ mm 表 1 卵泡大小对卵母细胞体外成熟的影响 - Table 1 Ef f ec t of f o ll icular s ize on in vit ro m a tura t ion of oocy te s ()成熟卵母细胞数 成熟率 r组别卵母细胞数 . N oo f oo cy te s w ith . G ro up N oo f oo cy te s cu ltu red exp anded cum u lu s % ƒr 1 141 () 95 67. 4 a () 140 85. 42 164 b () 70 89. 73 78 b () 57 90. 54 63 b ()注: 不同字母表示组间差异显著 < 0. 05 或 < 0. 01 P P (): < 0. 05 < 0. 01N o teP e rcen tage s w ith th e d iffe ren t le t te r s a re sign if ican t ly d iffe ren t P o r P 2. 2 卵泡大小对卵母细胞体外发育能力的影响, 4. 9, 3, 3. 9, 2, 2. 9 Λ 其中直径?5 和 mm mm 4, 4. 9 卵泡卵的 22细胞和 3, 42细胞卵裂率 精卵体外共培养 12, 16 后, 成熟卵母细胞 mm h ( ) 显著高于直径 2, 2. 9 的卵泡卵Λ 虽然 6, 82体 外 受 精 率 为 75. 6% 34ƒ45, 多 精 入 卵 率 23. mm () ( ) 5% 8ƒ34, 正常受精率 61. 8% 21ƒ34Λ 所有用 细 胞 和 12, 162细 胞 的 卵 裂 率 各 组 间 差 异 不 显 于受精的卵母细胞均与颗粒细胞单层共培养, 卵 著, 但 3, 3. 9 组受精卵没有能突破 162细胞,mm 母细胞体外发育结果见表 2Λ 在胚胎体外发育过2, 2. 9 组受精卵没有能突破 82细胞, 所有受 mm 程中, 受精卵 22细胞、3, 42细胞、6, 82细胞的卵 精卵体外发育均未能突破桑椹胚Λ 裂率由高到低依次为直径?5 以及直径为 4mm 表 2 卵泡大小对卵母细胞体外发育能力的影响 2 Table Ef f ec t of f o ll icular s ize on in vit ro deve lopm en t of egg s af ter IVF ()胚胎发育进程 所占比率 r用于受精的 % ƒ I n v i t ro deve lopm en t to r 组 别卵母细胞数 . N oo f oo cy te s G ro up 桑椹胚桑椹胚以上22细胞 3, 42细胞 6, 82细胞 12, 162细胞 u sed fo r IV F 223, 426, 8212, 162M o ru la B eyo nd m o ru la ce ll ce llce llce ll ()() () 1 7. 7 1 92 13 14. 1 2 15. 4 0 0 0 ad () () ()()28 20. 911 39. 36 21. 4 2 134 1 3. 6 0 0 ab de () () 21 33. 311 52. 4()()()3 63 cb e 6 28. 6 2 9. 5 1 4. 8 0 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 4 54 26 48. 117 65. 49 34. 62 7. 71 3. 80 c e ( ) 不同字母表示组间差异显著 < 0. 05 或 < 0. 01; , , ; , : , , ; , : 注: 1. ab cdeP P ab cdeP e rcen tage s w ith th e d iffe ren t le t te r s a re () < 0. 05 < 0. 01;sign if ican t ly d iffe ren t P o r P 2. 所有用于受精的卵母细胞与颗粒细胞共培养. 2. A ll oo cy te s u sed fo r IV F w e re co cu ltu red w ith g ranu lo sa ce lls ( ( )2. 3 不同成熟培养时间对小卵泡 2, 2. 9 67. 4% 、61. 9% 和 71. 7% , 差 异 不 显 著 P > 0. mm ) 卵体外成熟和体外发育的影响05Λ体外受精后, 受精卵与颗粒细胞单层共培养, 直径 2, 2. 9 的卵泡卵经体外培养 36 ,22细胞卵裂率分别为 14. 1% 、17. 4% 和 11. 4% ,mm h 42 和 48 后, 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 率 分 别 为() () h h 差异不显著 > 0. 05表 3ΛP () 表 3 不同成熟培养时间对小卵泡 2, 2. 9 卵体外成熟和体外发育的影响 mm , 2. 9 3 , 2Table Ef f ec t of m a ture t im e on IVM IVD of oocy te s der ived f rom mm f o ll ic le s 成熟卵母 ()用于受精的 胚胎发育进程所占比 率 r% ƒr()成熟培养时间 卵母细胞数细胞数 成熟率 卵母细胞数 I n v itro deve lopm en t to . . M a tu re t im e N oo f oo cy te s N oo f oo cy te s w ith . N oo f oo cy te s 22细胞 3,4 2细胞 6,8 2细胞 82细胞以上 ƒexp anded cum luu s th cu ltu red u sed fo r IV F 3, 426, 822282ce ll ce ll ce ll B eyo nd ce ll ƒ%r ()()()()95 67. 4 13 14. 1 2 15. 4 1 7. 7 36 141 92 0 ()()42 42 26 61. 9 23 4 17. 4 0 0 0 ( ( ( ))) 48 53 38 71. 735 4 11. 41 25. 00 0 注: 所有用于受精的卵母细胞与颗粒细胞共培养 2: .N o teA ll oo cy te s u sed fo r IV F w e re co cu ltu red w ith g ranu lo sa ce lls 2. 4 不同直径卵泡的不同浓度卵泡液对卵母细微 环 境 的 波 动 可 能 影 响 受 精 后 胚 胎 的 发 育 潜 15 胞体外成熟和体外发育的影响 Λ 另一些研究认为在牛小卵泡卵中存在一种力 16, 17在卵母细胞体外成熟培养液中添加不同直径 因子抑制卵母细胞的进一步发育 Λ 而 B a rn e s ( 卵泡的 5% , 15% 浓度卵泡液, 各处理组间的卵母 等则 认 为 在 大 卵 泡 中 卵 泡 处 于 更 加 成 熟 的 状 ) 态, 卵母细胞细胞质中存在增强受精卵体外发育 细胞体外成熟率无明显差异, 虽然随着获取卵泡 5 液卵泡直径的增大, 卵泡液浓度的增加, 卵母细胞 能力的因子Λ 此时核的转录活性处于一个相对 ( 较低的水平, 因而大卵泡卵较强的体外发育能力 的 卵裂率有所升高, 但组间差异不显著 表 4、表 似 乎 归 因 于 卵 泡 发 生 末 期 卵 母 细 胞 的 细 胞 质 成 ) 5Λ 熟, 这种大卵泡即使不处于排卵前状态, 也可能正 3 讨论 在完成优势化, 从而提供了一个有助于诱导胞质 成熟、促使卵母细胞获得更强胚胎发育能力的微由于猪卵泡卵 、和受精卵体外培养IVM IV F 的技术起步较晚, 目前关于猪卵泡卵体外成熟和 卵母细胞在精子穿入后环境Λ胞质成熟是猪 IVM 7 形成雄原核以及支持胚胎早期发育所需的Λ 卵 发育能力与卵泡大小的关系研究尚不多见Λ 虽然 泡液作为卵母细胞的微环境可能会存有一些特殊 有研究认为猪卵泡大小对 的体外成熟以及 CO C s 12 因子对卵母细胞体外成熟和体外发育起作用, 本 卵丘扩散能力影响很大, 但该研究未对卵母细 研究结果表明虽然不同直径卵泡的卵泡液对卵母 胞体外受精后的发育能力作进一步研究Λ 本研究 发现直径?2 的猪卵泡卵体外成熟、体外发育 细胞的体外成熟、体外发育无明显影响, 但随着获 mm 取卵泡液卵泡直径的增大, 卵泡液浓度的增加, 卵 能力与卵泡直径有关Λ 等曾研究认为猪卵M o t lik 母细胞的发育能力有增强的趋势Λ 因而猪不同大 泡卵母细胞恢复减数分裂的能力是在卵泡生长过 13 程中逐渐获得的, 本研究则进一步证实了这一 小卵泡卵 后发育能力有差异的原因可能是:IV F ) 结论, 结果表明在成熟培养过程中, 随着卵泡直径 1小卵泡卵母细胞中存在抑制受精卵进一步发育 ) 增大, 卵母细胞的体外成熟率逐渐升高; 体外受精 的 因子; 2大卵泡卵细胞质中有促进受精卵体外 ) 后, 受精卵体外发育能力也逐渐增强Λ以上结果也 发育的因子; 3大卵泡能提供一个诱导胞质成熟, 与牛和羊的研究结果一致Λ促使胚胎发育的微环境Λ本研究结果表明, 猪卵母卵泡大小和卵母细胞体外成熟、体外发育存 细胞体外经历细胞质成熟的能力是在卵泡生长末 在相关的机理目前尚无定论Λ有研究指出, 在卵泡 期逐渐获得的Λ 内环境中卵母细胞积累了一种非常稳定的 直径 2, 2.卵泡卵在体外经历不同成,RN A 9 mm 它将在成熟、受精和胚胎早期发育过程中翻译Λ这 熟培养时间, 其体外成熟率、卵裂率均没有明显改 14 种 积累受卵泡内环境的影响很大Λ 卵泡变Λ 因而离体培养的卵母细胞可能需在卵泡中突RN A 18 胎发育提供保障Λ 这种改变和积累在体外即使 破某一点, 以完成特殊 RN A 和蛋白质的合成, 才 能获得恢复减数分裂的能力, 并为随后受精和胚 延长成熟培养时间也是无法获得的Λ 表 4 不同直径卵泡的不同浓度卵泡液对卵母细胞体外成熟的影响 Table 4 Ef f ec t of d if f eren t propor t ion s of PFF f rom f o ll ic le s of d if f eren t s ize s in IVM m ed ium on IVM of porc in e oocy te s ()组别卵泡液浓度卵母细胞数成熟卵母细胞数 成熟率 r . N oo f oo cy te s w ith .. G ro up P F F co nc N oo f oo cy te s cu ltu red exp an ded cum u lu s rƒ% ()67 82. 7 1 15% 81 ()69 81. 2 5% 85 ()75 82. 4 2 15% 91 ()73 80. 2 5% 91 ()62 88. 6 3 15% 70 ()5% 90 74 82. 2 ()15% 68 61 89. 7 4 ()75 83. 3 5% 90 0% 91 ()74 81. 3 表 5 不同直径卵泡的不同浓度卵泡液对卵母细胞体外发育的影响 Table 5 Ef f ec t of d if f eren t propor t ion s of PFF f rom f o ll ic le s of d if f eren t s ize s in IVM m ed ium on IVD of oocy te s ()胚胎发育进程所占比 率 I n v itro deve lopm en t to r% r用于受精的卵母细胞 数组 别 卵泡液浓度 . N oo f oo cy te s 22细胞 3, 42细胞 6, 82细胞 12, 162细胞 桑椹胚 桑椹胚以上 .G ro up P F F co nc u sed fo r IV F 223, 426, 8212, 162ce ll ce ll ce ll ce ll M o ru la B eyo nd m o ru la ()()()()30 44. 8 11 36. 7 4 13. 3 1 3. 3 0 1 15% 67 0 ()()()25 36. 2 6 24. 0 2 8. 0 0 0 5% 69 0 ()()()()2 15% 75 33 44. 0 12 36. 4 6 18. 2 1 3. 0 0 0 ()()()30 41. 1 9 30. 0 4 13. 3 0 0 5% 73 0 ()()()()0 15% 62 0 26 41. 9 11 42. 3 7 26. 9 2 7. 7 3 ()()()()30 40. 5 12 40. 0 6 20. 0 2 6. 6 0 5% 74 0 ()()()()()29 47. 5 13 44. 8 8 27. 6 3 10. 3 2 10. 3 4 15% 61 0 ()()()()()34 45. 3 14 41. 2 9 26. 5 3 8. 8 1 2. 9 5% 75 0 ()()()()()0% 73 0 26 35. 6 12 46. 2 7 26. 9 2 7. 7 1 3. 8 注: 所有用于受精的卵母细胞与颗粒细胞共培养. : 2.N o teA ll oo cy te s u sed fo r IV F w e re co cu ltu red w ith g ranu lo sa ce lls 在体外, 猪胚胎活力很大程度上受到培养液 种结果的原因可能是对应于不同的体外发育分化 19 成份的影响Λ 本研究采用的受精卵体外发育液 19 , 21 , 胚胎对营养的需求有差异Λ 因而根据胚 期与 等的相同, 研究认为该培养液由于添 Yo sh ida 胎体外发育的不同时期, 采用多重培养体系能优 加了乳酸和丙酮酸, 并不适合胚胎发育超过 32细 化猪胚胎的体外生产, 当然这要基于对胚胎体外10 发育过程中营养代谢的充分理解Λ胞期 Λ 本研究结果表明, 将受精卵和颗粒细胞 单层共培养, 部分受精卵能发育至桑椹胚, 因而采 () : 参考文献 Ref eren ce s用体细胞共培养能在一定程度上代谢或去除培养 1 SZYB E K K. I n v itro m a tu ra t io n o f oo cy te s f rom sexua lly 液中的胚胎毒性因子Λ 理论上讲猪胚胎在体外突 ( ) [. , 1972, 54 2: 5272528Λ imm a tu re m ice J J E ndo c r in 破 42细胞以后, 大部分能发育至桑椹胚或囊胚, 2 2 , . SO R EN SEN R A W A SSA RM A N P M R e la t io n sh ip be然而本研究却发现在体外发育过程中, 在各个细 [ . tw een g row th and m e io t ic m a tu ra t io n o f m o u se oo cy te J 胞期几乎均有多于 10% 的胚胎损失, 胚胎体外发 ( ) D ev B io l, 1976, 50 2: 5312536Λ , . 3 D IN G J FO XCRO F T G RCo nd it io ned m ed ia p ro duced 育阻滞似乎存在于各个细胞期Λ研究认为, 产生这 ( ) [. , 1984, 72 2: 3232328Λ by fo llicu la r sh e lls o f d iffe ren t m a tu r ity affec t m a tu ra t io n o f J J R ep ro d F e r t( ) [. , 1994, 50 6: 137721384Λ14 , , . p ig oo cy te s J B io l R ep ro dS IRA RD M A CO EN A N K M A SU DA HE ffec t s o f E P P IG J L , SCH RO ED ER A C , BR IEN M J. D eve lop 2 4 f re sh o r cu ltu red fo llicu la r f rac t io n s o n m e io t ic m en ta l cap ac ity o f m o u se oo cy te m a tu red in v itro: effec t s o f re sum p t io n in bo v ine oo cy te s [J . T h e r io geno lo gy, 1992, , ( ) go nado t rop h ic st im u la t io nfo llicu la r o r ig in and oo cy te size 37 1: 39257Λ ( ) [. , 1992, 95 1: 1192127Λ, . J J R ep ro d F e r t M OO R R M POW EL L D JT ran sla t io na l cap ac ity o f 15 [ . sh eep oo cy te s m ic ro in jec ted w ith m e ssenge r RN A J J , , . FA IR T H YT T EL P GR EV E JBo v ine oo cy te d iam e te r 5 ( ) in re la t io n to m a tu ra t io na l com p e tence and t ran sc r ip t io na l , 1989, 86 1: 2892295.R ep ro d F e r t ( ) , . [. , 1995, 42 4: 4372442ΛTA N S J L U K HE ffec t s o f d iffe ren t o e st ro u s cyc le ac t iv ity J M o l R ep ro d D ev 16 stage s o f o va r ie s and size s o f fo llic le s o n gene ra t io n o f CRO ZE T N , A HM ED 2A L I M , DU BO S M P. D eve lop 2 6 ( ) [ . , 1990, 33 1 :, m en ta l com p e tence o f go a t oo cy te sf rom fo llic le s o f IV F ea r ly em b ryo s J T h e r io geno lo gy , 335. d iffe ren t size ca tego r ie s fo llow ing m a tu ra t io n fe r t iliza t io n ( ) , , . [. , 1995, 103 1: 2932M CCA F FR E Y C L U K H SE EN A N J M F ac to r s and cu ltu re in v itro J J R ep ro d F e r t 17 298Λ invo lved in th e in v itro deve lopm en t o f IV F ca t t le o va [ . , . PRA T H ER R SDA Y B NP rac t ica l co n side ra t io n s fo r A P ro ceed ing o f th e Ir ish G ra ssland and A n im a l 7 , 18 P ro duc t io n A sso c ia t io n th A nnua l R e sea rch m ee t ing th e in v itro p ro duc t io n o f p ig em b ryo s [J . T h e r io geno lo gy, [. : ′234., 1992. 33C D ubb inO k ie ly ( ) 1998, 49 1: 23232Λ 钱云, 丁家桐, 刘红林. 卵母细胞成熟的形态学特征及其28 18 Synch ro FU N A HA SH I H , CA N TL E Y T C , DA Y B N. (调 控 [ . 国 外 畜 牧 科 技 , 2, J Q IA N Yun D IN G J iato ngn iza t io n o f m e io sis in po rc ine oo cy te s by expo su re to 2. L IU H o nglinT h e st ruc tu ra l a sp ec t s and m o du la t io n o f d ibu ty ry l cyc lic adeno sine m o nop ho sp h a te im p ro ve s ) ( ) [. , 1999, 26 6: 262oo cy te m a tu ra t io n J A n im Sc i A b r deve lopm en ta l com p e tence fo llow ing in v itro fe r t iliza t io n 30. ( ) [. , 1997, 57 1: 49253ΛJ B io l R ep ro d , , , . GA RDN ER D K L A N E M SP IT ZER A et a l9 19 FU N A HA SH I H , STUM P F T T , T ERL OUW S L. D eve2 E nh anced ra te s o f c leavage and deve lopm en t fo r sh eep lopm en ta l ab ility o f po rc ine oo cy te s m a tu red and fe r t ilized zygo te s cu ltu red to th e b la sto cy st stage in v itro in th e ( ) [. , 1994, 41 7: 142521433Λ in v itro J T h e r io geno lo gyYO : , ab sence o f se rum and som a t ic ce llsam ino ac id s10 , , . 2 SH IDA M ISH IZA K I YKAW A G ISH I HB la sto cy st v itam in s and cu ltu r ing em b ryo s in g ro up s st im u la te fo rm a t io n by p ig em b ryo s re su lt ing f rom in v itro fe r t ( ) [. , 1994, 50 2: 3902400.deve lopm en t J B io l R ep ro d [ . iliza t io n o f oo cy te s m a tu red in v itro J J R ep ro d F e r L E E E S, FU KU I Y. Syne rg ist ic effec t o f a lan ine and ( ) , 1990, 88 1: 128Λt 20 g lyc ine o n bo v ine em b ryo s cu ltu red in a ch em ica lly N A GA I T , TA KA HA SH I T , M A SU DA H. I n 2v itro fe2 11 2 def ined m ed ium and am ino ac id up tak e by in v itro[. r t iliza t io n o f p ig oo cy te s by f ro zen bo a r sp e rm a to zo a J J [ . p ro duced bo v ine m o ru lae and b la sto cy st s J B io l ( ) , 1988, 84 2: 5852591ΛR ep ro d F e r t ( ) R ep ro d, 1996, 55 6: 138321389. PRO CHA ZKA R , KA L A B P , M IYA N O T. E GF st im u2 12 FU KU I Y , L E E E S, A RA K I N. E ffec t o f m ed ium la ted exp an sio n o f po rc ine oo cy te2cum u lu s com p lexe s is 21 renew a l du r ing cu ltu re in tw o d iffe ren t cu ltu re sy stem s affec ted by th e size o f th e do no r fo llic le [ J . o n deve lopm en t to b la sto cy st s f rom in v itro p ro duced ( ) , 1997, 47 1: 199Λ T h e r io geno lo gy ( ) [ . , 1996, 74 7 :ea r ly bo v ine em b ryo s J J A n im Sc i 2, , . M O TL IK J CRO ZE T N FU L KA JM e io t ic com p e ten13 275222758. ce in v itro o f p ig oo cy te s iso la ted f rom ea r ly an t ra l fo llic le s