芪丹通脉片对大鼠缺血心肌的血管新生作用与机制研究

芪丹通脉片对大鼠缺血心肌的血管新生作用与机制研究 芪丹通脉片对大鼠缺血心肌的血管新生作 用与机制研究 ? 190?中国中医急症2007年2月第16卷第2期JETCM.Feb.2007,Vo1.16,No.2 芪丹通脉片对大鼠缺血心肌的血管新生 作用与机制研究 王文王宗仁张金洲李军昌李晶华 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1004—745X(2007)02—0190—02 【摘要l目的观察益气活血复方芪丹通脉片对大鼠缺血心肌的血管新生作用,并探讨其可能机制.方法复 制大鼠急性心肌缺血模型,设生理盐水对照组和芪丹通脉片治疗组,分别于第7,14日取左心室心肌组织,采 用N—BT染色法测定心肌梗死区面积,采用免疫荧光和免疫组化法心肌微血管密度(MVD),心肌血管内 皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况.结果治疗组第7,14日心肌梗死面积减少,心肌微血管密度增加,VEGF蛋 白表达增加,与对照组存在显着性差异,两组第14日心肌微血管密度和VEGF蛋白表达与第7日比较均有增 加,而治疗组明显高于对照组.结论以益气活血为治疗原则的中药复方芪丹通脉片具有增加急性心肌缺血大 鼠心肌微血管密度,减少心肌梗死面积的作用,其作用机制可能与增加心肌VEGF蛋白表达有关. 【关键词】心肌梗死面积微血管密度芪丹通脉片血管内皮生长因子大鼠 TheExperimentalStudyontheEffectofQidantongmaiTabletonIschemicMyocardiuminRa ts ? 实验研究? WANGWeWANGZong—Fen,ZHANGJin—zhou,etaf XijingHospitalAffliatedtotheFouahMilitaryMedicalCollegeofPLA(Xi'an,710032) lAbstract】 Objective:ToobservethetherapeuticangiogenesiseffectofQidantongmaiTablet(QDTMT.芪丹通脉 )onIschemicmyocardiumofrats.andtostudythemechanisms.Methods:Ratsmodelofacutemyocardialis— chemiawasestablishedanddividedintotheQDTMTtreatmentgroupandtheNScontrolgroup.0btainedthemy. ocardiumofleftventricleat7dand14dtomeasuretheinfarctsizeofmyocardiumbynitrobluetetrazolium(N—BT) dyeing,andtodetectmyocardiummicrovesseldensity(MVD)andexpressionofvascularendothelialgrowthfactor (VEGF)byimmunofluorescenceofimmunohistochemicalmethodrespectively.Results:Theinfarctsizewere decreased,whilemyocardiumMVDandexpressionofVEGFwereincreasedat7dand14dinQDTMTtreatment groupcomparedwiththeNScontrolgroup,MyocardiumMVDandexpressionofVEGFwereincreasedat14dinboth group,btuthechangeofQDTMTtreatmentgroupwasmoresignificantthanthatofNScontrolgroup.Conclusion:The ChineseherbalformulaQDTMTbasedonYiqihuoxueprincipleCallincreasethemyocardiumMVDandalleviate myocardialinfarction.Themechanismsmayberelatedtoit'SfunctionofincreasingtheexpressionofVEGF. 1Keywords】Infarctsizeofmyocardium;QidantongmaiTablet(芪丹通脉 片);MVD;VEGF;rat 缺血性心脏病属中医学"胸痹","心痛"范畴,其病机关键为 本虚标实,气虚血瘀.有研究表明,在缺血性心脏病的中医证型 中气虚血瘀证者可占70.3%".因此,益气活血法成为中医药治 疗缺血性心脏病的主要治则.基于此法则而研制的芪丹通脉片 是治疗缺血性心脏病的有效方剂12】,既往研究表明其具有保护心 肌细胞及血管内皮细胞等作用.本研究从其对缺血心肌的血 管新生作用方面进行观察,并探讨其可能机制. 1材料与方法 1,1材料芪丹通脉片提取浸膏干粉(药物组成为黄芪30g, 当归15g,丹参30g,红花30g,桂枝lOg.lg干粉相当于2.86g生 药)由第四军医大学西京医院提供;SD大鼠64只,雄性,体重 (220?30)g,由第四军医大学实验动物中心提供;兔抗大鼠?相 关抗原多克隆抗体,FITC标记的山羊抗兔二抗,抗VEGF及 第四军医大学西京医院(西安710032) DAB染色剂购于武汉博士德公司;生物素标记羊抗兔抗体,ABC 复合物由第四军医大学神经生物教研室提供. 1.2方法【1)分组:64只动物随机分为两组(对照组和治疗 组)各32只,每组再分为7d和14d两个时间点,每个时间点各 16只.对照组在造模1h后灌服生理盐水lOml/kg;治疗组灌服 芪丹通脉片提取浸膏干粉2.0g/kg,用生理盐水配置等体积药 液,每日2次.(2)造模方法:用戊巴比妥麻醉大鼠,气管插管,于 左胸第四肋间行2cm横形切口,连接呼吸机,行正压辅助呼吸, 暴露心脏,于肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1,2mm处用4—0 无损伤线结扎冠状动脉左前降支(LAD),逐层关胸,观察大鼠呼 吸情况,待自主呼吸后撤除呼吸机.(3)指标测定:两组大鼠分别 于造模后第7,14日各取16只大鼠,用0.6%戊巴比妥麻醉后. 迅速取出心脏,一半标本剔除血管和脂肪等非心肌组织,生理盐 水冲洗,用吸水纸吸去水分,称量全心湿重,沿冠状沟处切除心 房,留心室称重,用于测量心肌梗死范围;另一半标本取梗死区 与非梗死区交界处心肌组织4mm×5mm大小,生理盐水冲洗, 中国中医急症2007年2月第16卷第2期JETCM.Feb.2007,Vo1.16,No.2 40g/L多聚甲醛中固定24h,常规石蜡包埋,用于检测心肌微血 管密度和VEGF表达.?心肌梗死范围百分比测定方法:N—BT 染色法,沿房室沟从心尖至心基底部平行将心室切片,生理盐水 冲洗,吸干水分.将心室切片置于0,5%四氮唑蓝染液中,常温 染色15min,正常心肌着色为深红色,而梗死心肌着色为苍白 色,剪去各心肌片被染色的非梗死区心肌,将未染色的梗死心肌 称重,计算梗死区心肌质量占心室肌质量百分比.?心肌微血 管密度测定测定方法:血管内皮细胞特异性抗原?因子免疫荧 光方法标记血管内皮细胞,石蜡切片,常规脱蜡,水化;微波抗原 修复;封闭15min,PBS冲洗,加入1:50兔抗大鼠?相关抗原多 克隆抗体,置于湿盒中4~C过夜,PBS洗涤后加1:50FITC标记 的山羊抗兔IgG,37~C孵育50rain,洗片后用伊文氏蓝复染,50% 缓冲甘油封片.于荧光显微镜下观察?因子阳性细胞,高倍镜 视野(X400)随机选择10个视野计数微血管数目.?心肌 VEGF蛋白表达测定方法:采用免疫组化染色(sP法),一抗(1: 100),37?,2h,PBS冲洗3次;二抗,室温15min,PBS冲洗3次; 滴加辣根酶标记链霉卵白素,室温15min,PBS冲洗3次;DAB 显色,苏木素复染.VEGF阳性为胞浆染色呈棕黄色.根据Weid— nrer法,每个标本选两张片,显微镜下随机选取10个400倍视 野,计数100个同类细胞中的阳性细胞数. 1.3统计学处理应用SPSSIO.0统计软件.计量资料以(面? s)表示,采用方差分析和秩和检验. 2结果 2.1各组心肌梗死范围百分比比较见表1.大鼠急性心肌梗 死造模后第7日,对照组心肌梗死范围百分比为(11.53? 1.7)%,与治疗组(9.7?1.6)%比较,存在显着差异(P<0.05). 造模后第14日,对照组心肌梗死范围百分比为(10.9?1.8)%, 与治疗组(7.6?1.4)%比较,存在显着性差异(P<0.01). 表1各组心肌梗死范围百分比比较(i?s) 与对照组I司期比较,}P<005,}}P<0.01 2.2各组微血管密度及VEGF阳性细胞数比较见表2.大鼠 急性心肌梗死造模后第7日,对照组梗死心肌与非梗死心肌交 界部缺血心肌中血管较少,分布不均;治疗组微血管密度与对照 组比较明显增加(P<0.05).造模后第14日较第7日两组的血 管密度均有增加(P<0.05),而治疗组微血管密度明显高于对 照组(P<0.05).大鼠急性心肌梗死造模后第7日,治疗组 VEGF阳性细胞数明显高于对照组,造模后第14日较第7日两 组的VEGF阳性细胞数均有增加(P<0.05),而治疗组明显高 表2各组微血管密度及VEGF阳性细胞数比较(个,i?s) 与对照组同期比较P<005;与本组第7日比较,?P<0.05 ? 191? 于对照组(P<0.05). 3讨论 目前对于缺血性心脏病的常用治疗方法,如药物治疗,介入 治疗及手术治疗旨在增加病变心肌的血供,从而有效地改善患 者的临床表现,然而其治疗效果均有一定的局限性.因此,近年 来诱导血管新生以重建血运,挽救濒死的心肌已成为治疗心肌 缺血的一个新策略,这种方法被称为"治疗性血管新生".目前血 管新生治疗的主要方式包括生长因子治疗,跨心肌激光血管再 建术,细胞移植和药物刺激.研究表明,诸多中药均有良好的 促进血管新生的作用.缺血性心脏病属中医学"胸痹","心痛" 范畴,气虚血瘀是其根本的病理改变,益气活血,祛瘀生新是行 之有效的治疗原则.芪丹通脉片是基于此原则而开发的有效方 剂,既往实验证明其具有改善心肌缺血程度及减少心肌缺血范 围的作用,并对急性心肌缺血危险因素高血脂,高血黏,冠心病 心绞痛有较好的治疗作用[7,81.本实验从其对缺血心肌的血管新 生作用进行观察,发现急性心肌缺血后第7日,第14日芪丹通 脉片治疗组能明显提高缺血区心肌微血管密度,减少梗死面积, 以治疗第14日效果更为明显.缺血区心肌微血管密度在第14 日时较第7日两组均有增加,而以治疗组增加更为明显.同时, 缺血区VEGF阳性细胞数与心肌微血管密度表现为同样的变化 趋势,提示二者之间可能存在某种效应关系.VEGF是一组特异 作用于内皮细胞,促进其有丝分裂和增殖的同源多肽键二聚体, 是目前公认的最强大的促进新生血管形成的生长因子,新生血 管形成的重要调节者.因此,我们认为,芪丹参脉片增加缺血区 VEGF表达,可能是其血管新生作用的机制之一.同时,研究已 证实芪丹通脉片具有保护血管内皮细胞的作用】,而内皮细胞 是血管新生过程的靶细胞,缺血区周围血管内皮细胞功能的完 整性对血管新生过程有非常重要的影响.因此,我们推测芪丹通 脉片的血管新生作用可能通过多渠道,多靶点而实现,其作用机 制尚待进一步研究. 参考文献 1刘德恒,徐真真,郭伟聪.冠心病心绞痛395例中医证型特点探讨 [J].中医杂志,1995,36(1O):617,618 2马世平,王宗仁,陈学福,等.芪丹通脉片对实验性急性心肌缺血犬 左心功能的影响[J].第四军医大学,2000,21(6):110—112 3李晶华,王宗仁,邵中军,等.芪丹通脉片对实验性急性心肌梗死大 鼠心肌的保护作用及其分子机制[J].中国临床康复,2004,8(9): 1706,1707 4魏立强,王宗仁,王琳,等.芪丹通脉片对大鼠血管内皮细胞损伤的 保护作用[J】.第四军医大学,2005.26(4):321—324 5刘颖,蒋跃绒,殷惠军,等.治疗性血管新生在心肌梗死中的应用 [J].中西医结合心脑血管病杂志,2004,2(1):39—41 6林燕林,雷燕.具有血管新生作用的中药与血管新生[J].天津中医 药,2005,22(3):260—262 7王宗仁,郑瑾,马爱玲,等.中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主 动脉内皮细胞及PAl一1表达影响[J].第四军医大学,2004,25 (14):1290—1293 8李晶华,王宗仁,肖铁卉,等.芪丹通脉片预防异丙肾上腺素所致的 大鼠慢性心肌缺血[J].第四军医大学,2003,24(5):397—399 (收稿日期2006—08一O1)