志贺菌临床株耐药性分析及对氟喹诺酮类抗生素耐药机制研究(可编辑)

志贺菌临床株耐药性分析及对氟喹诺酮类抗生素耐药机制研究(可编辑) 志贺菌临床株耐药性分析及对氟喹诺酮类抗生素耐药 机制研究 天津医科大学 硕士学位论文 志贺菌临床株耐药性分析及对氟喹诺酮类抗生素耐药机制的研 究 姓名:梁帆 申请学位级别:硕士 专业:临床医学;内科学;传染病 指导教师:祁伟 2012-05天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 志贺菌是细菌性痢疾简称菌痢的病原体,从发现至今已有百余年的历 史。志贺菌感染目前仍是全球影响公共卫生健康的重要问题。在中国,细菌性痢 疾每年的发病数接近万,发病率居种监测感染性疾病的前几位,对公众健 康造成严重威胁。抗生素应用于细菌性痢疾的治疗以后,耐药率逐年上升。上 世纪七十年代喹诺酮类药物开始应用于临床并且已成为当前治疗细菌性痢疾的 首选用药。但是,随着该类药物的广泛应用,近年来耐药问题日益严重。 研究目的:为了解天津地区近三年来志贺菌对临床常用抗菌药物的耐药情况 及探讨对氟喹诺酮的耐药机制,本课题选取年. 年天津地区三家三级甲 等医院肠道门诊分离的志贺菌临床株,进行血清学分型及抗生素药敏试验,并 对氟喹诺酮耐药株从染色体靶位酶基因突变及质粒介导两个方面探讨其对氟喹 诺酮类药物的耐药机制。 材料与方法:收集白天津市三家三级甲等医院年、年及 年月. 月肠道门诊患者粪便标本的志贺菌临床株株,采用血清凝集法鉴定其血清学 分群及分型,明确本地区优势流行血清型。采用.纸片扩散法用种临床常用 抗生素进行药敏试验,分析并比较志贺菌不同血清群对不同抗菌药物的耐药程 度。其中采用环丙沙星、左氧氟沙星等种抗生素筛选氟喹诺酮类耐药株,并通 过扩增技术对氟喹诺酮耐药志贺菌的、基因及所有菌株的、 、、佑’夕?、基因进行扩增、测序,测序结果在 进行质粒接合实验, 上进行比对。将基因阳性菌株与大肠埃希菌 采用微量肉汤稀释法比较受体菌对抗菌药物的敏感性变化。对供体菌、受体菌 及接合菌提取质粒,进行质粒图谱分析及特异性扩增确认含基因质粒 成功导入受体菌。 实验结果:、经常规生化及血清凝集实验证实,株志贺菌包括福氏志贺 菌株包括、、、、、及、变种,宋内志贺菌株及鲍氏志 贺菌株。天津地区近三年志贺菌主要流行血清群为宋内志贺菌,其次为福氏志 贺菌。药敏结果显示:株志贺菌对一代喹诺酮萘啶酸敏感率最低,为 .%,其次是氨苄西林、复方磺胺甲噫唑和链霉素,敏感率分别为.%、.% 及.%,种及种以上抗生素多重耐药菌株接近%。福氏志贺菌与宋内志贺 菌对多种抗生素耐药程度存在差异,对氟喹诺酮及三代头孢耐药程度明显高于天津医科大学硕士学位论文 宋内志贺菌。 ,本研究总共筛选出氟喹诺酮耐药志贺菌株,均为福氏志贺菌,耐药率 为.%/。宋内志贺菌无氟喹诺酮耐药菌,但对萘啶酸耐药程度较高。 株氟喹诺酮耐药菌耐药程度均较高,其中株对左氧氟沙星同时耐药。耐药茵 在基因均有突变且突变基因及位点具有多态性,突变株中均有 ,及,位点突变,其中左氧氟沙星耐药株与其 余株菌相比缺乏基因位点突变,其余株菌均同时存在 ,、位点突变。株志贺菌中共检出株基因阳性株, 株阳性菌为福氏志贺菌,对氟喹诺酮耐药;株佑’/.基 因阳性菌均为宋内志贺菌,对氟喹诺酮敏感。通过质粒接合实验获得株接合 株,提取质粒后发现大小约的质粒从供体菌转移到受体菌中,提取接合菌 均扩增出了相应基因,药敏结果显示及佑’夕?基因 分别使受体菌在质粒接合前后对环丙沙星和诺氟沙星的分别提高了、 和、个稀释度,对左氧氟沙星和氧氟沙星的分别提高了、和、 个稀释度,但都达不到临床意义的耐药临界值。进一步印证了基因介导 低水平耐药的推断,并提示介导喹诺酮耐药程度要高于佑’.。 实验结论:本地区近年志贺菌主要流行血清群为宋内志贺菌,其次为福氏 志贺菌。志贺菌对多种抗生素耐药率较高,且多重耐药菌株比例高。福氏志 贺菌与宋内志贺菌对多种抗生素耐药程度存在差异,对氟喹诺酮及三代头孢耐 药程度明显高于宋内志贺菌。对氟喹诺酮类药物耐药率低于%,且全部为福氏 志贺菌。在天津地区志贺菌中分离出质粒介导的喹诺酮耐药基因,既往未见报 道,志贺菌氟喹诺酮药物耐药机制同时存在染色体介导的靶位酶突变及携带 基因,但以靶位酶突变为主。基因可在不同菌株间水平传递,引 起喹诺酮耐药性的水平传播。 关键词:志贺菌属喹诺酮类抗生素耐药质粒天津天津医科大学硕士学位论文.’. ,. , , 【. ,. ,., . :. /砌,.?.. :, ?, . . , ? . ,. . , . , , . .:, , , . ,, .. . . : .%, , ..% .%,.%. 廿%. ... , , . // ,, .%/ 玎以“ .? , .? , , .舢? . ,, 叶 . 。一& , ?,.? ..., . ,,。 。? ,,?. 姗 ?, 口,,..’... :. . ... %..葡 . ....%, ? . , .。,.一乱 .. : . 天津医科大学硕士学位论文 缩略语/符号说明 英文缩写英文全称 中文全称 碱基对 千碱基对 .法 .纸片扩散法 中介耐药敏感多重耐药 . .硼酸.缓冲液 .. 脱氧核糖核酸 聚合酶链式反应溴化乙锭 世界卫生组织 麦氏比浊 最低抑菌浓度 耐药突变预防浓度 质粒介导喹诺酮耐药 ? 喹诺酮耐药基因 超广谱内酰胺酶 国际腹泻病研究中心 天津医科大学硕士学位论文 刖吾 志贺菌又称痢疾杆菌,属志贺菌属,。兼性菌,是细菌性痢疾的病原体之 一,为引起感染性腹泻的常见原因【。据统计,目前全球志贺菌痢疾的发病率已 由年的%.%降至年的%【,但其仍是影响公共卫生健康的重要问 题,其中五岁以下儿童发病率约比成人高%【】。在我国,菌痢是夏秋季常见的 肠道传染病,居于法定传染病发病率的第三位,各地时有爆发流行。志贺茵的 菌型复杂,容易变迁【,根据生化反应及表面抗原群特异型抗原,可分为痢疾 志贺菌群、福氏志贺菌群、鲍氏志贺菌群及宋内志贺茵群群 【】,根据抗原型特异性抗原又可分为个血清亚型。在临床分离的痢疾志贺菌 除型和型外,其余各型已较为少见【。群分为个血清型,型别较多,但抗 原结构单纯,均为独立的血清型。群仅有种血清型,最常见且抗原 结构最复 杂的是群,可用型特异性血清进行菌型鉴定。 随着抗生素的应用,大大降低了细菌性痢疾的病死率,在带给人们福音的 同时,志贺菌耐药率逐渐上升,并出现了对四环素、氯霉素、氨苄西林等多种 抗菌药物耐药的多重耐药菌株在世界范围内流行的趋势。目前,喹诺酮类药物 广泛应用于临床并且己成为当前治疗细菌性痢疾的首选用药,但是,随着该类 药物的广泛应用,近年来耐药问题日益严重。志贺菌对萘啶酸等第一代喹诺酮 类药物已完全耐药,对氟喹诺酮类药物诺氟沙星耐药率也已达到.%【。由 于不同时期所使用的抗生素的种类、应用范围等的不同,细菌的耐药谱也有所 差异。因此,发现并掌握不同时期细菌耐药谱的变化规律,对于临床医生正确 选择抗生素治疗具有重要作用。 喹诺酮类药物的杀菌作用主要是通过抑制细菌复制、转录、重组、修 。型拓扑异构酶包括解螺旋 复过程中所必需的型拓扑异构酶发挥的【 酶和拓扑异构酶?,两者都是细菌生长所必需的酶,其中任一种酶受到抑制都 将使细胞生长被抑制,最终导致细胞死亡。喹诺酮类药物通过与靶位酶的特定 位点结合形成稳定的喹诺酮.酶..元络合物,有效地阻止酶在复制叉上的移 动【】,并抑制的断裂.重接循环,使打开的链无法修复,引发链断 裂等一系列反应而导致菌体死亡。 近年来国内外研究表明,志贺茵对喹诺酮的耐药机制主要包括染色体介导 的靶位酶基因突变、细胞膜孔蛋白缺失或表达下降、膜主动外排泵基因激活主天津医科大学硕士学位论文 要是.系统或过度表达及质粒介导的喹诺酮耐药 ,】。 染色体介导的靶位酶耐药决定区 基因突变引起的氟喹诺酮耐药占主导地位。解螺旋酶亚基基因 耐药决定区是导致福氏志贺菌对喹诺酮耐药的关键突变,仅此单位 点突变即可对萘啶酸高水平耐药,拓扑异构酶?基因同时发生变异时可导致对 氟喹诺酮类药物高水平耐药【钔。研究证实,志贺菌临床耐药株 靶基因突变具有 多态性【】且突变基因数目越多、范围越大,耐药程度也越甜】。 质粒介导的耐药介导志贺菌低水平耐药,在耐药菌及非耐药菌 中的检出率无明显统计学差异,是靶位酶基因突变耐药作用的补充。但 基因可以借助可移动原件如整合子与等通过质粒接合、转化等传递方式在 不同菌株甚至不同菌群之间传播,导致耐药的广泛播散。目前发现的与喹诺酮 蛋 耐药相关的质粒携带的基因编码的蛋白质有三种: 白,‘..氨基糖苷乙酰转移酶变体,主动外排泵蛋白。国 内外关于志贺菌基因携带情况的研究较多,已有发现、、、 ?及叫的报道,不同国家不同地区检出率不同,目前未发现志贺菌 携带有”圮及基因。同一菌株可同时携带多种耐药基因,并常伴随超广谱 ?,】和灿酶基因,含有相 .内酰胺酶船 基因的菌株可属于不同分子分型,同一分型中含有相同耐药基因 的菌株对于氟喹诺酮的值也不同,说明还存在染色体介导的耐药机制或是细 胞外膜蛋白基因突变导致的膜通透性下斛】等机制参与。 本研究以.年收集分离天津地区多家三级甲等医院肠道门诊临床 诊断细菌性痢疾病人的粪便标本的志贺茵临床分离株为研究对象,探讨氟喹诺 酮类耐药志贺菌的耐药机制和耐药基因的突变及流行情况。本研究包括三部分 内容,第一部分,鉴定志贺菌临床株血清分群及福氏志贺菌血清分型,明确近 年来优势流行菌型。选取种临床常用抗生素采用.纸片扩散法进行临床药物 敏感试验,分析志贺菌临床株药敏谱及抗生素耐药情况,并利用环丙沙星、左 氧氟沙星等种抗生素筛选氟喹诺酮耐药菌株。第二部分,通过技术对氟喹 诺酮耐药菌株和对照菌株的、基因进行扩增、测序,与标准 菌株相应基因序列进行比对,明确靶位酶基因突变类型、位点及数量,探讨其 与氟喹诺酮耐药程度的关系。第三部分,对全部菌株的质粒介导的喹诺酮耐药天津医科大学硕士学位论文 基因、、、佑’夕?、基因进行扩增、测序与基因分型, 进行质粒接合实验, 了解分布情况。并将日性菌株与大肠埃希菌 提取供体菌、受体菌及接合菌质粒,以接合菌为模板进行特异性 扩增 确认接合子基因型,并比较接合前后受体菌对抗菌药物的敏感性变化,探讨 基因介导的喹诺酮耐药及水平播散特点。天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 我国以往以福氏志贺菌最为常见,近年来,多地区报道宋内志贺菌已转变 为优势菌群【。本研究部分分析近三年从天津市三家三级甲等医院分离的株 志贺茵临床株的血清分型,检测对种抗生素的耐药特点并且筛选氟喹诺酮类 耐药菌株。 .材料与方法 ..实验材料 ...菌株 测试菌株 试验菌株分离自年至年月天津市三所三级甲等医院天津 医科大学第二医院、天津市儿童医院及天津市第一中心医院肠道门诊就诊患 者的粪便,经常规生化及志贺菌多价血清鉴定为志贺菌属总共株,并通过 志贺菌单价血清鉴定明确具体血清型及亚型。 参考菌株 药物敏感试验质控标准菌株大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 ,均为天津医科大学第二医院感染性疾病研究所保存菌株。 ...试剂与耗材 微生物学培养基 选择性培养基沙门.志贺氏固体培养基琼脂及麦康凯平皿用于菌株的 分离及纯化,水解酪蛋白.琼脂用于纸片扩散法药物 敏感试验,以上均为杭州天和微生物制剂有限公司产品,购自上海伊华生物科 技有限公司。按照产品说明书配制,其中?琼脂及麦康凯琼脂经过高压灭菌 ?分钟后使用。 培养基用于保存菌株:酵母提取物 、细菌培养用胰 蛋白胨、氯化钠,溶于蒸馏水中,用/氢氧化 钠调节值至.,加入蒸馏水至总体积,在 /.×高压下 蒸汽灭菌分钟,保存于?。氯化钠为天津市塘沽化学试剂厂出品,酵母提 取物、胰蛋白胨均为英国公司产品。 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 天津医科大学硕士学位论文 保存培养基为含甘油终浓度为%的?培养物。 一次性血平皿用于复苏及保存菌株,购白天津市金章科技发展有限公司。 志贺菌诊断血清 志贺菌四种多价混合血清及分群血清均为兰州生物制品研究所产品。 痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌亚型诊断血清为宁波天润生物药业 有限公司产品。 药敏纸片均购白于中国药品生物制品检定所,详细内容见表: 表抗生素药敏纸片中英文名称及药物含量 主要实验仪器::高压蒸汽灭菌器山东安得医疗科技有限公司、 ..型电热恒温培养箱上海市新苗医疗器械制造有限公司、恒温 水浴振荡器哈尔滨东联电子技术不发有限公司、显微镜日本奥林巴斯、 超净工作台冰峰、/电子分析天平、一?冰柜新一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 天津医科大学硕士学位论文 乜,。 ..试验方法 ...菌株分离、培养及鉴定 标本采集:用灭菌棉签蘸取少量临床诊断为细菌性痢疾患者耋/ 视野新鲜粪便以脓血处为宜,采用分段划线法,分别接种在麦康凯琼脂 培养基及培养基上,。恒温培养箱培养.小时后,挑取圆形、直径在 .,无色半透明、边缘整齐、中等大小的菌落转种营养培养基进行分离。宋 内志贺菌只有一种血清型,迟缓发酵乳糖,.小时后菌落可呈玫红色。根据 菌落特征可分为光滑型相和粗糙型相,粗糙型菌落一般较大,有时 可出现扁平,边缘不整齐的菌落。 志贺菌血清学鉴定:采用玻片凝集法,取一洁净载玻片,两侧分别加一 滴诊断血清及对照用生理盐水。取新鲜培养的可疑菌落.个,分别与血清及盐 水混合均匀,生理盐水呈现均匀浑浊,多价血清在数分钟内出现反应澄清透明、 凝集颗粒较多为阳性,反之为阴性。若对照同时出现凝集考虑为盐水自凝,参 考生化鉴定结果确定是否为志贺菌。 将鉴定结果为志贺菌的细菌菌落接种于双糖铁、生化管,?温箱 孵育.小时,参考结果为/./,一、、./、,进 行进一步确证。 采用群特异性志贺茵诊断血清及志贺菌单价诊断血清,将根据菌 落形态、 生化反应及志贺菌多价血清鉴定结果符合志贺菌定义的细菌鉴 定到具体血清型 及亚型。福氏志贺菌亚型诊断说明见表.。 表.福氏志贺菌各型、亚型及变种血清凝集反应表天津医科大学 硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 一 一 一 一 一 一一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 刚剐雕雕 , 一 一 一 一 一 铂赴如乳砸【 一 一 一 十 一 一 一 一 一 一 一 , , ...药敏试验 抗生素药物敏感试验采用改良纸片扩散法,质控菌株为大肠 埃希菌及铜绿假单胞菌。 平板的配制 ,搅拌加热煮沸至完全溶 称取琼脂粉,加入去离子水或蒸馏水 解,调节至.。 分装为瓶,每瓶,?高压灭菌,备用。 放置数分钟后待其冷却至大约?,倾入无菌平皿一次性硬碟, 厚度?,约, 无菌环境下晾干后倒置,。冰箱储存。 菌液的制备及贴纸片 用高压蒸汽灭菌过后的棉签蘸取.个菌落置于灭菌的.%溶液中, 制成均匀悬液。经与.麦氏标准液比浊,至浊度一至,将每株志贺 菌制备成 ×/的菌悬液。 无菌棉拭子蘸取菌液在管壁上旋转挤压几次,去掉过多的菌液, 均匀涂布 至整个琼脂平板,反复涂布几次,每次将平板旋转度,最后沿平板 周边绕两 圈,以保证涂布均匀。 菌液涂布后短暂放置,使平板表面干燥,用灭菌镊子分别取药敏纸 片均匀贴于培养基表面纸片距平板边缘.,纸片距平板中心一般控制 在左右为宜,并用镊子轻按纸片中心,使其附着严密。 将平板倒置培养,于。培养.小时,用游标卡尺测量抑菌环直径, 年版标准见表.进行 根据美国临床实验室标准化研究所一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 天津医科大学硕士学位论文 判读。 数据统计学分析 本部分所得实验数据采用.软件,卡方检验进行统计学分析,以. 差异有统计学意义。 表 纸片扩散法抑菌环药敏结果判读标准 .实验结果 ..志贺菌血清学鉴定 ...志贺菌血清学分群 株志贺菌中,宋内志贺菌株,占.%:福氏志贺菌株,鲍氏 志贺菌株,见表..天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株 血清学鉴定、分布及药敏特征痢疾志贺菌群 .% 福氏志贺菌群 .% 鲍氏志贺菌群 .% 宋内志贺菌群 % 合计 图志贺菌血清群构成 ...福氏志贺菌血清学分型 对福氏志贺菌采用型特异性血清进行血清亚型的鉴定,本地区近 三年流行福 氏志贺菌包括、、、、、、及,未发现,其中 所占比例最大,占总福氏志贺菌数的.%,、分别为.%和.%/, 其余血清分型较为分散,如表.所示: 表. 株福氏志贺菌血清分型及分布表 天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分 布及药敏特征 一 一兰 一 一囹圜口口一囹叠一 图. 株福氏志贺菌血清型构成图 ..药敏结果 ...志贺菌临床株对种抗生素药物敏感性试验结果 年.年分离出的株志贺菌对一代喹诺酮萘啶酸敏感率最低,为 .%,其次是氨苄西林、复方磺胺甲嗯唑和链霉素,敏感率分别为.%、. 及.%,对类及类以上抗生素多重耐药菌株接近%。对三代头孢菌素药 物敏感率高,未发现亚胺培南及头孢哌酮舒巴坦耐药株。对环丙沙星、氧氟沙 星等三代氟喹诺酮类药物耐药率低于%,对左氧氟沙星耐药率低于%。共检 测出株氟喹诺酮耐药菌,均为福氏志贺菌;宋内志贺菌对萘啶酸耐药率高, 未出现氟喹诺酮耐药菌,差异显著,见表。 表 株志贺菌药敏结果 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 天津医科大学硕士学位论文 痢特灵 四环素 链霉素 ?墨 萘啶酸 舒普深 .亚胺培南 头孢他啶 氧氟沙星 诺氟沙星 头孢曲松 头孢噻肟 阿米卡星 环丙沙星 庆大霉素 氨苄西林 左氧氟沙星 图. 株志贺茵对种抗生素敏感性比较 ...不同血清型志贺菌药敏情况比对结果 本实验志贺菌临床株血清分群主要为福氏志贺菌与宋内志贺菌,鲍氏志贺菌天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 仅分离出株。因此将株福氏志贺菌与株宋内志贺菌对种抗生素的敏感 率进行比对,运用卡方检验及校对公式样本量差异较大对两组进行统计学 分析,结果见表.。福氏及宋内志贺菌对多种药物的敏感性有差异,福氏志贺 菌对痢特灵、头孢曲松、头孢噻肟的敏感性低于宋内志贺菌,而对于四环素、 庆大霉素及复方磺胺甲噫唑的敏感率要高于宋内志贺菌,差异都具有统计学意 义。本研究部分总共检测出株氟喹诺酮耐药菌,均为福氏志贺菌且耐药药敏谱 不同;宋内志贺菌对萘啶酸耐药率高,但未出现氟喹诺酮耐药菌,差异具有统 计学意义。 表.福氏志贺菌与宋内志贺茵药敏情况对比天津医科大学硕士学 位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 、阿米卡星、舒普深、亚胺培南、头孢他啶、庆大霉素、左氧氟沙星 、诺氟沙星、痢特灵、头孢曲松、环丙沙星、头孢噻肟、庆大霉素 、四环素、 、氨苄西林、链霉素、萘啶酸 图.福氏志贺菌与宋内志贺菌对种抗生素敏感性比对结果天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 .讨论 志贺菌是细菌性痢疾简称菌痢的常见的病原体之一,是一类传染性较 强的革兰氏阴性肠道致病菌,属肠杆菌科,志贺菌属。主要是通过粪.口传播, 多于夏秋季节发病。目前,志贺菌在欧美等发达国家及亚洲、非洲等发展中国 家仍旧是重要的公共卫生问题,国际上每年都有由志贺氏菌引起的疾病的暴发 与流行。根据年度,亚不包括中国、非、拉各洲仅小于岁的儿童 每人每年发生腹泻.次,细菌性腹泻的病例多达.~.亿人【。我国广大 农村地区由于卫生条件差,经常有由于水源或食品受到志贺氏菌污染而引起痢 疾、腹泻等疾病流行的报道。 志贺菌的优势血清型群可随时间不断变迁,国外发达国家在世纪 年代以前是群占优势,年代后以群为主,而年后以后宋内志贺菌的检 出率要高于福氏志贺菌【。志贺菌引起的菌痢也存在明显的地区差异,从菌群 分布上来看,发达国家主要流行宋内志贺菌,引起菌痢的症状较其他血清型较 轻,在美国,临床分离的宋内志贺菌是福氏志贺菌数量的倍以上。拉丁美洲的 特立尼达~年志贺菌临床分离株中,宋氏志贺菌占%,福氏志贺菌 仅占%。痢疾志贺菌近年来已较为少见,仅在非洲和亚洲的少数发展中国 家仍有致病性较重的痢疾志贺菌型流行,且多呈多重耐药【】。孟加拉国年 和年分别有两次痢疾志贺菌型暴发流行,年以后再无报道【。福氏志 贺菌目前仍是发展中国家的优势流行菌群,在印度占临床分离志贺菌数的 %【。 国内现阶段各地报告的志贺菌痢疾仍以以福氏志贺菌感染多见,约为%以 上,其次为宋内志贺菌及痢疾志贺菌型,在福氏志贺菌中又以、及型居多 。近年来,宋内志贺菌的比例呈逐年上升趋势,北京、甘肃、贵州等地均有 超过群成为优势菌群的报道【?,可能与当地人群生活水平的提高和卫生状况改 善有有关。济南市对.年志贺菌血清型检测,发现为优势菌型,占 .%,并于年后新出现了、、痢疾志贺菌及宋内志贺菌【。 年江苏省为优势菌型,占.% 。青海省福氏志贺氏菌占.%为优 势流行菌群,其中变种占.%【】。西安地区?年间志贺菌感染仍以福 氏志贺菌为主,但己由%,%,.%,%,.%转变为%,%, %,%,.%。 天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 本实验统计结果表明,.年天津地区志贺菌临床分离株中,宋内志 贺茵占.%/,优势菌群己由上世纪年代本研究所统计的福氏志贺 菌转变为宋内志贺菌;福氏志贺菌株,占.%/,血清分型包括、 、、、、、及,未发现,其中以为优势流行血清型, 占全部福氏志贺菌的.%/,明显多于其它血清型,其它血清型较为 分散。 与本所年检测结果【】相比优势血清型未发生转变,但出现了新的血清型 、及。福氏志贺菌多为多重耐药菌且耐药程度较高,目前国内多地 区已有福氏志贺菌优势血清型变迁为及其他血清型报道【’,可能与抗 生素的选择性压力有关,志贺菌感染人体后各血清型间无交叉免疫,福氏志贺菌 血清型变迁逃避机体免疫,妨碍对福氏志贺菌的预防、治疗甚至疫苗的使用。因 此本地区在监测血清学变化方面应引起足够重视,控制高耐药性福氏志贺菌血 清亚型的转变与流行,并为志贺菌性痢疾的疫苗构建提供依据。 近年来,随着抗生素广泛应用于细菌性痢疾的治疗,志贺菌的耐药率逐渐 上升,并出现多重耐药菌株在世界范围内流行的趋势。近年来甘肃、河南、黑 龙江临床分离的志贺菌已普遍对氨苄西林、四环素、利福平耐药,耐药率可达 .%~%【。目前,国内外临床上主要应用氟喹诺酮类药物和三代头孢 治疗细菌性痢疾,但近年来耐药性也呈逐年上升趋势。锄 ,国际腹泻病研究中心对孟加拉国? 年年间志贺菌耐药性检测结果显示【,?年间福氏志贺菌对萘啶酸耐 药性增长缓慢,年开始增长迅速,年己达到%,年出现环丙沙星 耐药株,年对环丙沙星及美洛西林的耐药率分别为%和%,宋内志贺菌 对这两种药物耐药性略低,分别为%和%。国内河南、甘肃省分离株对头孢 噻肟、环丙沙星的耐药率分别为.%..%,.%..%】。 本研究. 年天津市株志贺菌临床分离株对一代喹诺酮萘啶酸耐 药性最高,为.%,其次是氨苄西林、复方磺胺甲嗯唑和链霉素,耐药率分 别为.%、.%及.%。康倩【】等发现志贺菌存在两个与抗生素抗性有 关的岛,毒力岛携带四环素、氯霉素、氨苄西林和链霉素抗性基因,转座 子样毒力岛携带甲氧苄氨嘧啶、链丝菌素、链霉素、大观霉素抗性基因。本研 究中药敏结果也表明志贺菌临床分离株几乎对、、和普遍耐 药,与以上结果一致,提示临床治疗中已不宜考虑应用此类抗生 素。本研究中 的受试菌株对三代头孢菌素药物敏感率高,为.%..%,其中对头孢噻肟天津医科大学硕士学位论文 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 耐药率最高,为.%,与国内其他报道类似。未发现对碳青霉烯类抗生素亚 胺培南及添加.内酰胺酶抑制药的.内酰胺类抗生素复方制剂头孢哌酮舒巴坦 耐药菌株。对氟喹诺酮类药物敏感性高,对环丙沙星、氧氟沙星等三代氟喹诺 酮类药物耐药率均低于%,对左氧氟沙星耐药率低于%,由此可见,氟喹诺酮 与三代头孢类药物仍可作为治疗志贺菌引起的细菌性痢疾的首选用药。近几年 来,由于抗生素使用不等原因,志贺菌耐药和多重耐药现象严重,类抗生 素多重耐药菌率接近%,类抗生素的多重耐药率达到.%,类抗生素多重 耐药菌耐药率为.%,高于国外报道【】及新疆地区.年类抗生素多耐 率.%.%【】,低于黑龙江地区.%。 志贺菌不同的血清分群、福氏志贺菌不同血清型的耐药率差异明 显。上海 市【.年志贺菌耐药监测显示宋内志贺菌耐药性明显低于福氏志贺菌。 福氏志贺菌对诺氟沙星、环丙沙星等的耐药率在%左右,对氯霉素、头孢噻 肟和头孢曲松等的耐药率大于%:宋内志贺菌对头孢噻肟和头孢曲松的耐药 率不到%,对氯霉素、头孢他啶、环丙沙星和氧氟沙星的耐药率也低于%。 甘肃省【年.年志贺菌耐药监测显示,福氏志贺菌型对头孢噻吩和复 方新诺明耐药率低于其它血清型,菌株对环丙沙星的耐药率达到.%,远 高于其它福氏血清型。本研究将? 年组福氏志贺菌与宋内志贺菌的药敏 结果比较后发现:福氏及宋内志贺菌对多种药物的敏感性有差异,福氏志贺茵 对痢特灵、头孢曲松、头孢噻肟的敏感性低于宋内志贺菌,而对于四环素、庆 大霉素及复方磺胺甲嗯唑的敏感率要高于宋内志贺菌,差异都具有统计学意义。 本研究部分总共检测出株氟喹诺酮耐药菌,均为福氏志贺菌且耐 药程度不同, 详见本研究第二部分;宋内志贺菌对萘啶酸耐药率高,但未出现氟喹诺酮耐药 菌,差异具有统计学意义。提示福氏志贺菌对氟喹诺酮类抗生素耐药程度明显 高于宋内志贺菌。本研究中福氏志贺菌优势血清型为,其余血清型样本量小, 药敏结果分散。株福氏志贺菌型均对庆大霉素耐药,株氟喹诺酮耐药菌中 血清型株、、,及血清型各株,其它 血清型无氟喹诺酮耐药株。由于本研究福氏志贺菌样本量小,各血清型之间药 敏结果无法进行统计学分析,有待进一步增加样本量进行研究。 .小结 综上所述,天津市. 年志贺菌性痢疾的优势流行菌群为宋内志贺菌, 一、志贺菌临床株血清学鉴定、分布及药敏特征 天津医科大学硕士学位论文 其次为福氏志贺菌。福氏志贺菌与宋内志贺菌对多种抗生素耐药程度存在差 异,福氏志贺菌对氟喹诺酮及三代头孢耐药程度明显高于宋内志贺菌。天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶 基因突变介导的耐药机制 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 喹诺酮类药物进入菌体后,主要通过抑制细菌复制、转录、重组、修 复过程中所必需的型拓扑异构酶的作用发挥杀菌作用的。型拓扑异构酶包 括解螺旋酶和拓扑异构酶?,喹诺酮类药物与.酶复合体结合形成稳定 的喹诺酮.酶.三元络合物,能有效地阻止酶在复制叉上的移动【】。目前研 究表明,染色体介导的型拓扑异构酶靶位酶基因突变是引起喹诺酮耐药的主 要原因,当、基因区基因突变或引入终止密码子时,志贺菌靶位 酶发生氨基酸取代或亚基形成不完整,影响喹诺酮类药物的结合而产生耐药【】。 为探讨天津地区志贺菌喹诺酮耐药临床株耐药性与染色体靶位酶基因突变 的关系,本部分采用结合测序及序列分析,对株氟喹诺酮耐药株从靶 位酶基因突变位点、数量同耐药程度的关系进行较为深入的研究。 .材料与方法 ..材料 ...实验菌株 测试菌株 研究用菌株为第一部分收集并通过药敏试验筛查出来的氟喹诺酮耐药菌 株,总共为株,全部为福氏志贺菌,菌株编号分别为、、 、和 。 对照菌株 福氏志贺菌,为本所保存,对一代喹诺酮类抗生素萘啶酸耐药,对氟喹 诺酮类抗生素敏感。 ...试剂与耗材 培养基:培养基、血平皿配制及来源同第一部分。 主要试剂: 聚合酶、 分子量标准.、 溴化乙锭,均为大连宝生物生物工程公司产品。 琼脂糖、×电泳缓冲液,购自上海生物工程技术服务有限公司。其他化学试 剂均为进口及国产分析纯化。 实验仪器天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 高压蒸汽灭菌器山东安得医疗科技有限公司、..型电热恒 温培养箱上海市新苗医疗器械制造有限公司、超净工作台冰峰、 / 电子分析天平、.?冰柜新飞,.、微量可调移 液器和扩增热循环仪德公 、 高速离心机、.型电泳仪北京六一仪器厂、.型凝胶成 .版分析软件。 像系统美匡.公司及 ..实验方法 ...引物合成 参照文献,氟喹诺酮耐药菌、基因扩增引物/【】、 /由北京六合华大基因技术有限公司合成,其中包含解螺旋酶 亚基及拓扑异构酶?亚基基因耐药决定区,引物序列及特征见 表.。 表? 扩增、基因反应引物序列及特征 ... 模板的提取与制备 采用煮沸法【】提取志贺菌的模板: 将临床分离的志贺菌氟喹诺 酮耐药临床株纯培养物挑取单个菌落接种于高压灭菌后的液体 培养基 中,恒温水浴振荡培养.时。 摇匀后取.菌液,/ 离。后弃去上清液,加入去离子水,震荡充分混匀。置于? 气浴锅中煮沸,/离,巴,小心吸取上清,注意勿吸取到沉 淀,即为反应的模板,于.?冰箱保存备用。 ... 、;基因的扩增 反应体系见表.,天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 循环 产物的检测与分析 琼脂糖凝胶电泳检测 量取. 置于锥形瓶中,准确称量.琼脂糖粉加入其中,摇动锥 形瓶混合成均匀悬浊液,沸水浴至其完全溶解。冷却至?左右,加入.% 溴化乙锭溶液,终浓度为./,充分混匀。将制备好的琼脂糖溶液 倒入制胶模具中,并插入齿梳,注意梳子平面与胶床地面垂直。.后待凝 胶完全凝固后,拔下齿梳,将凝胶放入盛有.×的电泳槽中,保证缓冲 液没过胶孔。用微量加样枪吸取反应产物,加入加样孔中。在 恒压 条件下电泳后,于.凝胶成像系统观察结果。 产物的测序与分析 分别取反应产物以及相应扩增基因上下游引物各进行纯化与测 序。测序结果经程序与志贺氏标准茵相应基因片段序列进行比天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 对,分析其基因突变数量和位点。 结果分析 根据目的基因的测序结果,结合株菌对氟喹诺酮类药物的药敏特点及对照 菌相应的基因序列,分析氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变位点及数量与耐 药性的相关性。 .实验结果 ..耐药志贺菌及阴性对照菌氟喹诺酮类药物药敏结果,见表.: 表 株氟喹诺酮耐药福氏志贺菌及阴性对照药敏结果 .. 、基因扩增结果 基因扩增结果 株菌全部扩增出基因片段,片段长度为,琼脂糖凝胶电泳呈现均 一条带,且与目的片段大小相等如图.所示: :菌株; :菌株; :菌株 ; :菌株; :菌株 :菌株;: 图,氟喹诺酮耐药菌及对照菌基因扩增电泳图天津医科大学硕士 学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 基因扩增结果 株菌全部扩增出基因片段,片段长度为,琼脂糖凝胶电泳呈 现均一条带,且与目的片段大小相等,如图.所示: :菌株;:菌株; :菌株;:菌株; :菌株 :对照菌株:: 图.,氟喹诺酮耐药菌及对照菌基因扩增电泳图 .. 、基因片段序列测序与分析 株氟喹诺酮耐药菌在、基因均有突变,突变株均有 及位点突变,与其余株菌相比缺乏 位点突变,萘啶酸耐药但氟喹诺酮敏感菌株仅有基因突 变,突变位点位于位点。研究报道氟喹诺酮耐药志贺菌多有 位点突变,本研究菌株无此位点突变。另有 位点突变, 但位于区外。具体突变基因及位点见表?: 表 株氟喹诺酮耐药志贺菌及对照菌基因突变 ;; ;僦豫黜撇触 ? ?。 ?阱黜%尘乜塑筘:: 翘鬻疆粼蚴醵?联;怂; :; ’望赫黼鲢艘点艘譬强粼謦龆觥跹艘?鱿堂链?真?妫乞 譬毳重蕊瑚;臻蛋 畿毫 图,扩增氟喹诺酮耐药菌 片段序列比对结果 刮?, 。茎窭 嚣露篡麓嚣黧黧点篡:: 占叛黜一拦妥;妊甾妊;垂臻薰纛蠹:燕嚣;羔二腻量 涮裂譬糍摇怂怂裂必黜驻嘉三慰薮:奠黧嚣鼐:: 戚爨您霹爱麓蕊篓: ,茹黼古描矗鲑撩喜;娶;;品??丝妊婪譬:喜三点怂::::麓,。, 驺聊斌避古描避一揣喜;娶;撩??丛;裂黜拦必基撩:妊蜥 篡撼悬嚣黧黧甄藏篡 篡濒 ,慰娄?;筌基出娶毛必誉饿饕噩噩墓耍堕篡颡嚣重煎驻嚣: 露爱黧懋黧一冀 ,奎谶赫战撼描占揣喜;拦拦揣;拦拦邕攥搬撩鏊抛删奠? ::。,奎谶赫战撼描占揣喜;拦拦揣;兴拦岂尝三堪出占撩甜篾拦 硒 ,羔谗毛出鍪是一?嗽蹴基三翼疆惩妻:黧瓣捌心抛竖 荔麓嚣黧黧一必渊编 踟埘己出出挺擞;搂鉴妊器蛾鲫薅三戛垂彝凛蘸嚣篓黧兰 蕊 嚣撼黧黧 篡篓一黧您 枷喜岂涨拦娶:娶錾撄娶擞芝媳妊妊囊露愿甄爱嚣嚣筻三戮;:『: 咪;幽僦燃溉僦四四;三:? 逊四 ?盆盛怂裟?艘盆必毒拦出瓣霹蚕蕊蕊赫麓: 蕊趟贬鳓麟篡 ; .. ‘产 式 啊,’,, 图,扩增氟喹诺酮耐药菌株‖叫片段序列比对结果 ,,/矗;; ;;; ;;; ; ?? 王 网;艘量船 一 ; ;; 卫磊磊尘翟 .? 酣锹; ?醯强暇能五懿 ? ;;甚醛 茹 哇 ; ? ;~?:瑟 ? 专蠢亡毫宣矗旺‘ 。‘‘ 如 尘 盯: 硒 蛇里戳;黜饼妃 弱 ?’豫?硪嫂毫矗毫曲 鸵 ? ?蚣 . 图,扩增氟喹诺酮耐药菌株 片段序列比对结果 拿罩粤?;??;? ???‘ 。 ’‘’‘ ’’ ’‘’‘ 解?勇尘;。。。.。.。.。;;壬毒主般 陷 韶掣鼎罩?警磁: .,.。.必.型? ?谢亡毒晒釜般 争?磊:;;‘ .,??一 尘艮涩谶 管警;譬孵??,。.: :~?’ ,.烨。。。,?;? ‘击;毒习妄 ?? ,’一矗一,’蕞?一川 图,扩增氟喹诺酮耐药菌株朋,. 片段序列比对结果 “天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶 基因突变介导的耐药机制 .讨论 ..志贺菌属对喹诺酮类药物的耐药性 喹诺酮类药物由于对革兰氏阴性菌和阳性菌均有良好的抗菌活 性而广泛应 用于临床。氟喹诺酮类药物无论在肠道抗菌活性、肝肠循环、肠 道药物浓度及控 制质粒介导耐药性方面均有其特殊优越性,而且价格相对便宜,服用方便,目前 已用作临床治疗菌痢的首选用药。但是,随着该类药物的广泛应用,近年来耐药 及多重耐药问题日益严重,尤其是肠杆菌科细菌中,有报道显示年一年 临床菌株的喹诺酮耐药率已达到%以上】,志贺菌对喹诺酮类药物的敏感度 也呈逐年降低趋势,对萘啶酸等第一代喹诺酮类药物已完全耐药,年印度、 孟加拉国和尼泊尔开始出现耐环丙沙星等氟喹诺酮类药物的群痢疾志贺菌的 报道】,目前志贺菌对氟喹诺酮类药物耐药性正在逐渐上升,对诺氟沙星耐药率 已达到了.%引。 本研究中志贺菌对一代喹诺酮类药物萘啶酸普遍耐药,仅分离出株敏感 株,敏感率仅为.%/,福氏志贺菌对萘啶酸完全耐药,耐药程度高于 宋内志贺菌且具有统计学差异。萘啶酸及二代喹诺酮类药物吡哌酸等由于其高耐 药性已不再应用于临床。目前临床上喹诺酮类药物的首选用药为 三、四代氟喹诺 酮。本研究总共分离出株氟喹诺酮耐药菌,均为福氏志贺菌,占全部菌株的 .%/,低于印度%【】及国内甘肃.%【】的报道,接近杭州地 斟删%..%氟喹诺酮耐药率。株福氏志贺菌对喹诺酮类药物的耐药谱 有差异,对一代喹诺酮类药物萘啶酸及三代氟喹诺酮药物环丙沙星、氧氟沙星完 全耐药。菌株、对诺氟沙星中介耐药,对左氧氟沙星分别为敏感和中 介,菌株对诺氟沙星和左氧氟沙星分别为耐药和中介,仅有、对左 氧氟沙星同时耐药,且耐药程度最高。 ..志贺菌靶位酶基因突变多态性 喹诺酮类药物主要通过抑制细菌复制、转录、重组、修复过程中所 必需的类拓扑异构酶的作用发挥杀菌作用,包括解螺旋酶和拓扑异构酶 【 。喹诺酮类药物进入菌体后与.酶复合体结合形成稳定的喹诺酮.酶 .三元络合物,能有效地阻止酶在复制叉上的移动?】,并抑制的断裂 .重接循环,使打开的链无法修复,引发链断裂等一系列的反应而导 致菌体死亡。志贺菌对喹诺酮类药物耐药主导机制是靶位酶基因突变。解天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 旋酶和拓扑异构酶?都是异二聚体,其中解螺旋酶由两个亚单位 和两个亚单位 组成,分别由和基因编码, 拓扑异构酶?由两个亚单位 和两个亚单位 组成,分别由和基因编码【。当基因突变或引入终止密码子时,志 贺菌靶位酶发生氨基酸取代或亚基形成不完整,影响喹诺酮类药物的结合而产生 耐药。 研究发现,志贺菌突变部位常集中于喹诺酮耐药决定区,在研究大肠埃 希菌喹诺酮耐药的过程中拓扑异构酶?亚基编码基因常发生突变,且 突变部位集中在位氨基酸附近,’.末端第.位氨基酸 区间内,将此区域称为喹诺酮耐药决定区 ,,即酶蛋白分子与链结合的区域,这一区域发生氨基酸位 点突变会影响到与喹诺酮药物的结合,突变常发生在靠近酶活性位点氨基酸 的与【,“,,的也常位于’区,且最常见突 变于位和位。临床分离的志贺菌突变株较少,其突变时引起的耐药程度 也远比‖脚变异引起的低。至于的突变在志贺菌中则尚未发现,即使在大肠 杆菌中也不常见。近年来报道的志贺菌耐药株‖硝基因存在的位、位、 位、位、位、位、位的突型,的位、位、位、 位、位、位、位、位、位、位、位突型删。 国内外研究证实,志贺茵靶位酶基因突变具有多态性,喹诺酮耐药菌株可 单独或同时具有不同的种类及数量的突变基因及突变位点。本研究通过对株耐 药菌和株对照菌的倒刊与基因耐药决定区扩增并测序后发现,株耐药 菌在、基因均有突变,对照菌株仅有基因突变,无仅有 基因突变株,提示志贺菌‖硝与可同时或单独发生变异,但基因突 变只有在‖叫突变的基础上才会发生,与目前国内外研究一致。株耐药菌均 有在及位点突变,突变率为分别为%, 左氧氟沙星耐药株与其余株菌相比缺乏基因位点突变,此位点突 变率为%。本研究还发现,耐药菌位点突变有两种基因型,、 和的突变型为,菌株突变型为 ,提示相同基因相同位点突变的情况下,替代氨基酸的 基因型也可能不相同。此外,株耐药志贺菌在‖硝、基因其它位点还存 在突变,但多为无义突变,仅有 位点存在有义突变,,天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 但位于区外,与氟喹诺酮类药物耐药的相关性也有待进一步证实。 ..志贺菌靶位酶基因突变与喹诺酮耐药的关系 解旋酶和拓扑异构酶?基因的点突变都与志贺菌形成喹诺酮耐药密 切相关,其中前者是主要作用靶位,但要形成显著耐药,后者也必须同时发生 变异,且突变是渐进性的,首先是基因单位点突变,随后在药物的作用下 极易发生双位点及多基因多位点的突变等,且突变数目越多、范围越大,尤其 是涉及第靶酶,耐药程度也越高【。 突变是导致福氏志贺菌对喹诺酮耐药的关键突 解螺旋酶 位点氨 变,几乎所有耐喹诺酮志贺菌株中均存在此位点基因突变,仅 基酸取代可以使菌株表现出对萘啶酸的高水平耐药,但对环丙沙星等氟喹诺酮产 生耐药需同时存在和/或多个位点突变或其他耐药机制,而且即使在同 一突变位点,不同的氨基酸替代也会导致不同的耐药水平。拓扑异构酶?是次要 的靶位点,基因突变在突变的基础上才会发生,突变可能引起福 氏志贺菌对诺氟沙星或环丙沙星不敏感,但在宋内志贺菌中此关联不明显。 本研究中株耐药菌均对三代氟喹诺酮类药物耐药,其中、对左氧 氟沙星同时耐药。耐药菌在、基因均有突变,突变株中均有 及位点突变,对照菌株仅在单基因位点有突变,提示仅 单基因单位点突变就可以引起志贺菌对一代喹诺酮类药物萘啶酸的高水平耐 药,但要引起对氟喹诺酮类药物耐药,基因也需同时突变。胡立芬【】等人 研究证实,同时具有和突变株的值是仅具有单点突变菌株 值的~倍。也有研究证实,单基因、多位点同时发生突变就 可以对氟喹诺酮类药物耐药,但本实验未分离出此类耐药菌株。与其余株 菌相比虽同时为双基因突变,但缺乏基因位点突变,却对左氧氟沙星同 时耐药,可能与携带质粒介导喹诺酮耐药基因有关见本实验第三部分, 其余株菌均同时存在、位点突变,但只有表现出 对左氧氟沙星耐药。此外,本研究药敏结果还显示,菌株、、具有 相同的基因突变,但对诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药程度不同,因此,推测基 因突变表型相同但耐药程度不同的原因可能为存在如外排泵基因过表达及膜耐 药等其他机制参与,具体原因有待进一步研究。 总之,志贺菌耐药与和基因突变密切相关且临床耐药靶基因突 变存在多态性,由于氟喹诺酮类抗菌药物作用的靶位相同,因此,当志贺菌对天津医科大学硕士学位论文 二、氟喹诺酮耐药志贺菌靶位酶基因突变介导的耐药机制 一种氟喹诺酮类抗菌药物呈现耐药时,通常对其它氟喹诺酮类药物交叉耐药。 .小结 本研究总共分离出氟喹诺酮耐药志贺菌株,全部为福氏志贺菌,耐药率为 .%/。耐药菌株同时存在、基因突变且临床耐药株靶基因的 突变类型及位点具有多态性。基因突变可使志贺菌对氟喹诺酮的 耐药程度 增加,且突变位点越多,耐药程度越高。具有相同基因突变的志贺菌对氟喹诺 酮类耐药程度不同,提示尚存在如外排泵基因过表达及膜耐药等其他机制参与。天津医科大学硕士学位论文 三、质粒介导的喹诺酮耐药基因筛查及水平传播的研究 三、质粒介导的喹诺酮耐药基因筛查及水平传播的研究 质粒介导的喹诺酮耐药是近年来研究的热点,介导细菌的低水 平耐药,但在染色体基因突变的基础上,质粒的传播可导致耐药性迅速播散。 自年以来,发现了三种决定子:,’.,和。 基因常借助可移动遗传元件,如通常与插入序列共同区形成复 合物,插入到携带多种耐药基因的型整合子中,并常伴随超广谱.内酰胺 酶和酶基因。而勘一作为基因盒常出现在各种整合子中,对 耐药性在不同菌体及菌群间水平传播,具有重要意义,目前国内外已多次见诸 报道,因此,本研究部分将对天津地区近三年来收集志贺菌、佑‘.‖ 以及基因进行扩增及测序,探讨基因的流行情况,并对基 因阳性菌株进行质粒接合实验,比较接合前后受体菌对多种抗茵药物敏感性变 化,结合药敏结果分析与喹诺酮耐药的相关性。 .材料与方法 一 ..材料 ...实验菌株 测试菌株 本部分所用测试菌株同第一部分,为近三年收集的全部志贺菌共 株。 对照菌株 、、、?,.阳性对照菌株分别为肺炎克雷伯菌、 大肠埃希菌、大肠埃希菌及大肠埃希菌均为本研究所保存, 阴性对照菌株为大肠埃希菌。 参考菌株 质粒接合实验所用的受体菌株大肠埃希菌 由上海复旦大学王明 贵 教授惠赠。 ...试剂与耗材 培养基 肉汤培养基为陆桥生物制品有限公司产品,其余培养基同第 一部分。天津医科大学硕士学位论文 三、质粒介导的喹诺酮耐 药基因筛查及水平传播的研究 主要试剂 扩增所用试剂 聚合酶、溴 分子量标准.、 化乙锭 ,均为大连宝生物生物工程公司产品。琼 脂糖、电泳缓冲液,购自上海生物工程技术服务有限公司。其他化学试剂 均为进口及国产分析纯化。 质粒接合实验所用试剂及耗材 叠氮化钠为上海化学试剂采购供应站产品,复方磺胺甲嗯唑购自 天津市药品检验所,微孔滤膜为公司产品。 抗生素标准品 本研究部分采用微量肉汤稀释法测定供体菌及质粒接合前后受体菌的最 小抑菌浓度变化,所用抗生素种,分别为左氧氟沙星、环丙沙星、氧 氟沙星、诺氟沙星、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和头孢哌酮舒 巴坦,以上标准品均购自天津市药品检验所,孔板为天津金章生物科技有限公司产品。 实验仪器 高压蒸汽灭菌器山东安得医疗科技有限公司、..型电热 恒温培养箱上海市新苗医疗器械制造有限公司、超净工作台冰峰、/ 电子分析天平、.?冰柜新飞,.、微量可调移 液器和扩增热循环仪德国公司、 高速离心机、.型电泳仪北京六一仪器厂、.型凝胶成 .版分析软件。 像系统美国.公司及 ..实验方法 ... 扩增基因 引物合成 引物参照文献【,,、、、佑’夕?,及乞础基因扩增 引物同样由北京六合华大基因技术有限公司合成,引物序列及特 征见表.。