中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种宿主后中肠组织化学变化的动态观察

中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种宿主后中肠组织化学变化的动态观察 中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种宿 主后中肠组织化学变化的动态观察 ? 28MediciHe. 2No,1Mar..2002 中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种宿主后 中肠组织化学变化的动态观察 童华章刘志刚朱清仙叶炳辉 1江西医学院免疫学教研室(南昌330006) 2.江西医学院组织胚胎学教研室(南昌330006) 3.南京医科大学寄生虫学教研室(南京210029) 【摘要】目的观察中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种宿主后,其中肠组织化学变化.方法采用茚 三酮法,PAS法,Feulgen法及图像分析仪,对中华硬蜱叮咬不同免疫力宿主后中肠蛋白质,糖原及多糖定位和分布 以及DNA的含量进行研究.结果中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原组宿主后,中肠上皮细胞蛋白质含量较对照组 明显降低,但糖原及多糖含量与初次叮咬或佐剂对照组相比无显着性变化;随着叮咬时问的延长,纯化抗原组 DNA含量明显低于对照组,且以2,4倍体为主.结论105kDa纯化抗原组诱导的抗蜱免疫作用可干扰中肠消化 细胞蛋白质和核酸的台成,而对中肠糖代谢无明显影响. 【美键词】中华硬蜱;免疫接种;DNA;组织化学 中图分类号:R4572文献标识码:A文章编号:0254900X(2002}01002804 Dynamicchangesofhistochemistryinthemidgutofticks(Ixodessinensis) afterinfestingonrabbitimmunizedwiththe105kDapurifiedantigen TongHuazhmlg,LiuZhigang,ZhuQingxian2,YieBinghui 1.DepartmentofImmunohy,diang.riMedicalCollege,,Nanchang330006 2DepartmentofHistology&Embryology,Jiangzi54edicalCollege,Nancl~zng330006 3.DepartmentofParasitology,No巧ingMedicalUniversity,Naing210029 【Abstract】 ObjectiveToobservethed?mamicchang~ofhlstochemistryinthemidgutofticks(Iaxdessinends) afterinfestitagonrabbitsimmunizedwith105kDapurifiedantigenMethodsThetechniquesofproteinstaining,PAS, FeulgenmethodandimaginganaIysisvcl~reemployedtodetermioethecontmtofprotein.glycogen.Folysaccharldeand DNAin七hedigestivecellstieks'midglitResultsTber图堪 st-z,wedtMtthemntentofproteininthedigestiveeelk oftheticksinf~tingonin~nunizedhostsvmobviouslytowerthanthatofticksfirstinfestingOnhosts.Butthecontentof glycogenandl~>lysacrharldeshowednOdil'l'erencebetweentheticksinfestingOntheintrnumz~hostsOrun-in~nunized hostortheticksoffirstinl'estingonhost.Dcontentofdigestivecdisdoubledat24hpastinfestingWiththe incre~ngtinmolhemat.phaa,theen]argernentofthenucleusvdumew&Supto706timesOFtthe5thdayButthe incnea_mofthenucleusvutumewa5notobviouswhentheticks1nfestedonimmunizedhosts.CondasionTheresubs indicatedthatMterinl'estit,.gthehostimmunizedwithput,fledantigem,thesyntheticmetabolismoftheproteinandDNA intheticks'digestivecallsofmidgutmightbeaffected,butnoeffectOnImlysacvharidemetabolism 【Keywordslh'~desdnendsDNA;histochemisn3' 自从Johi~ston和Bancroft首次报道了宿主抗蜱 免疫反应后,经大量实验室和现场动物实验,人们发 现家畜和实验动物对多种蜱类叮咬和免疫接种可产 收稿日期:2002—01—31;修回日期:2002.02—20 生获得性免疫力,这种抵抗力可现在以下几方面: (1)吸血量下降;(2)产卵率和卵的孵化率下降;(3) 在宿主体上吸血时间延长;(4)在宿主体上的死 亡[.以上几种表现的病理学基础主要为宿主 热带医学杂志2002年第2卷第l期 免疫力对蜱中肠造成的严重损伤和破坏6,9].我们 对中华硬蜱叮咬有免疫力宿主后造成中肠组织细胞 的病理学动态变化进行了观察和分析(详见另文报 道).但是蜱叮咬有免疫力宿主后中肠组织化学的 研究,目前国内外尚未见报道.本文选用中华硬蜱 对不同免疫力宿主进行感染,观察中华硬蜱叮咬不 同免疫力宿主后中肠蛋白质,糖原及多糖的分布和 含量,以及中肠上皮细胞核DNA进行计量学分析, 探讨抗蜱免疫作用对蜱中肠蛋白质,核酸,糖原及多 糖的影响,进一步阐明抗蜱免疫对蜱中肠损伤的作 用机理. 1材料与方法 1.1中华硬蜱与实验动物分组 1l1中华硬蜱(Ixodessinensis)中华硬蜱均从 江西奉新县和靖安县野兔体上采集或拖旗方法采 集,由奉新县卫生防疫站提供.雌性成虫体重均为 (6?2)mg,饲养在湿度为(25=1)?,相对湿度为 (85?5j%的小型恒温箱内. 1.1.2实验动物与分组新西兰兔共l5只,均为 雄胜.体重(2.25025)kg.将新西兰兔随机分 为3组,即:初次感染组(空白对照组),佐剂对照组, 105kDa纯化抗原组.每组5只新西兰兔,动物单独 在清洁级恒温动物饲养房饲养,饲料为含丰富蛋白 质,维生素等多种营养物质的颗粒饲料.新西兰兔 及兔饲料均由江西医学院实验动物中心提供. 1.2标本制备 将叮咬不同免疫力宿主不同时间的中华硬蜱在 解剖镜下解剖出中肠,部分中肠经Carnoy液固定, 部分中肠用10%福尔马林固定,常规脱水,透明,石 蜡包埋和切片. 1.3蛋白质染色f茚三酮法) 中肠石蜡切片脱蜡后,用70%酒精冲洗后加入 含有05%茚三酮的无水酒清溶液,于37?浸24h 洗涤,Schiff氏试剂染45min,用水冲洗后经梯度酒 精脱水,透明,封固,蛋白质呈红色. 1.4糖原染色(PAS法) 切片脱蜡后人1%高碘酸水溶液氧化5min,然 后Schiff氏试剂染色60rain,蒸馏水速洗2次,经 95%及纯酒精脱水各lmin,二甲苯透明,用中性树 胶封片.染色结果:糖原或多糖呈紫红色或红色. 1.5脱氧核糖核酸染色(Feulgen法) 切片脱蜡后经1N盐酸水解(室温)1,2min,再 ? 29? 人I盐酸6O?水解6,8min,稍冷却,人lN盐酸 水解(室温)l--2min.然后用蒸馏水速洗2次.切 片疆人Schiff氏试剂中作用30min.用亚硫酸水速 洗3次,每次lmin.用蒸馏水充分洗净l,5min. 经95%与100%酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封 片.染色结果:DNA呈紫红色. 1.6DNA含量与体视学分析 用北航图像中心与空军总医院共同研制的彩色 病理图像分析仪,对Feulgen染色切片的中华硬蜱 叮咬不同免疫力宿主和不同时间中肠消化细胞核原 位定量测定8,得出细胞DNA的相对含量,并在同 张切片中测定20--30个左右中肠替代细胞(贮备细 胞)DNA的含量以其均值作为正常2倍体(2c)细胞 DNA的参照值,计数中肠上皮消化细胞DNA含量 和消化细胞DNA倍体分布情况 2结果 2.1中华硬蜱叮咬不同免疫力宿主后中肠蛋白质, 糖原及多糖的动态观察 21.1蛋白质中华硬蜱叮咬宿主不同时间,中肠 上皮细胞蛋白质的分布与含量稍有变化,初次叮咬 后24--48h,蛋白质在中肠上皮细胞(主要为消化细 胞)染色中呈中等强度的阳性反应,蛋白质主要位于 基底部.叮咬后3,5d,蛋白质在中肠上皮细胞内 呈网格状分布,部分蛋白质在消化细胞顶端呈细密 颗粒状,蛋白质含量明显增加,呈现较强的阳性反 应,叮咬第8d,中肠上皮细胞有较粗的颗粒. 中华硬蜱叮咬纯化抗原免疫接种组新西兰兔 后,叮咬24,48h,蛋白质在中肠上皮细胞含量较 低,呈较弱的阳性反应,蛋白质主要位于上皮细胞基 底部和周边部,叮咬后3,5d,消化细胞较初次叮咬 组明显减少,有些顶部有大网格空白区,部分细胞出 现空泡化,严重的出现细胞破碎.而中华硬蜱叮咬 佐剂对照组免疫接种新西兰兔后,中肠上皮细胞蛋 白质含量变化与初次叮咬组基本相似. 2.1.2糖及多糖中华硬蜱初次叮咬宿主不同时 间内,糖原及多糖随着中肠上皮细胞的生长,发育而 略有变化,多糖在中肠上皮细胞基膜染色较深,在初 次叮咬24,72h,可显示出中肠上皮细胞有一条完 整的基膜,上皮细胞内呈阿格状,叮咬5,8d时,中 肠上皮细胞表面糖原颗粒增厚.提示此时中肠消化 细胞表面的糖衣增厚,糖原及糖含量增加. 中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种组宿 ? 30? 主后,基膜出现明显区域性破损,断裂,消化细胞数 减少,细胞膜着色中等.随着叮咬吸血时间的延长, 基膜和消化细胞损伤现象加重,严重者中肠呈崩解 状态. MedicineVol2No.1Mar..2002 2.2中华硬蜱中肠上皮细胞DNA体视学分析 22.1DNA倍体含量与中华硬蜱叮咬各组之间的 关系中华硬蜱叮咬不同免疫力宿主各组DNA含 量的均值见表1. 表】中华硬蜱叮咬不同免疫力宿主后中肠上皮细胞DNA含量的动态变化 Tab.1I)ymu3dcchangesofDNAcontentinthetick~'midgutceilsafterinfestingOI1rabbitsw ithdifferentimmunity 从表1可知,各组中肠上皮细胞DNA的含量 按其初次叮咬组,佐剂对照组和纯化抗原组顺序排 列而逐渐递减,统计学分析表明佐剂对照组与初次 叮咬组(空白对照组)问无显着性差异(P>0.05), 而105kDa纯化抗原与初次叮咬对照组均有非常显 着性差异(P<0.O1).其中初次叮咬组和佐剂对 照组第5d较叮咬24hDNA含量分别增加1.27和 111倍,而纯化抗原组叮咬第5dDNA含量仅稍增 加(0.41倍),但远较初次叮咬组为低. 22.2DNA倍体分布与中华硬蜱叮咬各组之间的 关系中华硬蜱叮咬不同免疫力各组DNA的倍体 分布不同.图像分析可见,其倍体分布按初次叮咬 对照组,佐剂对照组和纯化抗原免疫接种组的顺序 排列逐渐减少.初次叮咬组在叮咬24,48h,DNA 倍体分布主要集中在2,4倍体(C)之间,而在叮咬 第72h,DNA倍体数在叮咬不同时间的分布与初次 叮咬组基本相似.中华硬蜱叮咬纯化抗原免疫接种 组宿主24,4813,中肠上皮细胞DNA倍体数主要集 中在2--4c之间,与初次叮咬组无显着性差异,但随 着叮咬时间的推移叮咬3,8d,DNA倍体数以2, 5c为主,较初次叮咬组有显着不同(P<0O1). 3讨论 在抗蜱免疫研究中,国外不少学者对蜱疫苗进 行了深人研究,尤其是在研究保护性抗原方面. Ackerman等_9_9用未吸血的变异革蜱全虫抗原,中肠 抗原免疫大鼠,从产生保护性作用角度看,全虫抗原 免疫接种所产生的抗蜱免疫作用要低于中肠抗原. W[kel等2对美洲花蜱唾液腺抗原免疫接种进行了 研究,唾液腺抗原与中肠抗原一样可诱导宿主产生 有效的免疫抵抗力,可使蜱吸血量降低,产卵前期延 长,产卵量及卵的孵化率下降.Agbede和Kemp[ 报道用微小牛蜱叮咬免疫接种宿主后,对蜱各系统 组织形态学检查表明,蜱中肠是主要损伤部位,叮咬 24-48h,消化细胞脱落人肠腔或完全破坏,中肠仅 剩下基膜和肌层,但对蜱叮咬有免疫力宿主(或免疫 接种宿主)后,中肠的组织化学分析,目前尚未见报 道. 本文对中华硬蜱叮咬初次感染宿主以及经 105kDa纯化抗原免疫接种宿主后中肠上皮细胞的 组织化学进行分析.对中华硬蜱叮咬不同时问其蛋 白质和糖原及多糖含量进行动态观察,并测定了各 组不同时间段DNA含量与DNA倍体数.中华硬 蜱初次叮咬24,48和7213,第5d时,中肠上皮细胞 (主要为消化细胞)蛋白质含量逐渐增加,叮咬第 8d,中肠上皮细胞蛋白质含量稍有下降,这与中华硬 蜱叮咬宿主血餐和消化过程完全一致,在中华硬蜱 叮咬前期(24--72h)蜱的血餐速度较叮咬后期(第6 , 7d)为缓慢,此时可见中肠消化细胞生长,发育,向 肠腔延伸,故中肠消化细胞在第3,5d蛋白质含量 达高峰,说明此期上皮细胞生长代谢旺盛,上皮消化 细胞积极参与消化过程[11,12J.而中华硬蜱初次叮 咬宿主不同的时间,中肠上皮细胞糖原及多糖的含 量与分布变化不显着. 中华硬蜱叮咬105kDa纯化抗原免疫接种组宿 主后,中肠上皮细咆(尤其是消化细胞)可发生一系 列病理学变化(具体详见另文报道),此时蜱中肠组 织化学也发生不同程度的变化,中华硬蜱叮咬柱层 析纯化抗原免疫接种宿主后,中肠上皮细胞蛋白质 含量减少.糖原及多糖的含量与对照组相比,无显 医学杂志2002年第2卷第1 着性差异,但通过多糖的分布可显示中肠基膜和细 胞膜的损伤现象,表现为基膜肿胀,厚薄不一,着色 深浅不一,基膜可出现断裂;消化细胞膜裂解,严重 者出现中肠上皮细胞碎裂.可能诱导宿主产生大量 针对中肠上皮细胞抗体,在抗体,补体和杀伤性T 细胞的联合作用下,造成中肠更严重损伤导致中肠 上皮基膜断裂和消化细胞破损.而中华硬蜱叮咬佐 剂对照组后,中肠上皮细胞蛋白质,多糖含量的变化 趋势,基本与对照组一致,这与病理学结果一致. 从表1和图像分析可知,初次叮咬感染组DNA 量增加显着,增到706c以上,5d值比24h值增加 了126%,峰值达12c,?5c细胞达44.2%.佐剂对 照组与初次叮咬组结果相似,DNA量增到68c以 上,5d值比24h值增加了110%以上,峰值达11. 8c,?5c细胞达347%,5d始全为?6c细胞.纯化 抗原组平均DNA在4c以下,倍体数增加40%以 下,?5c细胞低于17%.提出105kDa纯化抗原可 诱导宿主产生有效的免疫力,干扰中肠上皮细胞的 核酸合成,影响蜱的吸血与消比功能,甚至使之死 亡. 综上所述,中华硬蜱柱层析纯化抗原可诱导宿 主产生有效的抗蜱免疫力,使蜱中肠上皮细胞DNA 和蛋白质的合成受到干扰,导致上皮细胞蛋白质和 DNA含量下降,进而影响消化细胞血餐和消化过 程,干扰蜱的吸血和消化功能,严重者中肠上皮细胞 可出现裂解,碎裂,甚至在叮咬宿主时在宿主体上死 [参考 [1]AgbedeRIS,KempDH 文献] [rnmuni~tionofcatdeagainst ? 31 Bmphilusmicroph~sLextracts6erlvodfromadultarlaIe ticks!histopathologyofticks{~ding?vzcci~tadcattlehttJ m,1986;16(1):3541 l2]WikelSKTe1I1dunI[moflostreslstanctotickinImtzrionwith salivaryglandantigenAmJTmpMed.1981;30(1):284 — 288 [3:OodebeeckJP\,'aminesagainstblmd—suckingarthropodsVa Parasirvi.199454:205222 【4]j,sJchan?tI嘶oftickmtige~sinducing}immune …f?jInwF?.fmkbitaoftuiref2?fto Amldyom…?1c02.[1ckandIda】cIfIcatL[nlofr"ten?Itick antigorJsbys:cblotanalysisVetParasitzd.1988;2:245 259 :5]Dt~npaulSKa,af~wR.BalcseicMDiffeentialmcagnitlon ofsalivarvemtiget~frcmtheix~lidtickAmblvom~heb~u (Ac~ri:ad)byserafrominfmtcdandinm~unizedrabbits. 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