龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究

龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 湖北中医药大学 硕士学位论文 龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 姓名:章志雄 申请学位级别:硕士 专业:中药学 指导教师:熊富良 20100530中文摘要 动态逆流提取技术是近年来应用于中药提取领域的新技术,具有提取 效率高、能耗低、生产周期短等优点,本课题采用正交试验设计,获得了 龙牡壮骨颗粒动态逆流提取的最佳工艺条件,并通过和普通热回流提取方 法的对比分析,总结了该工艺的参数。此外,从有效成分的含量和指纹图 谱两方面进行了龙牡壮骨颗粒动态逆流提取物的质量控制研究。 在龙牡壮骨颗粒的动态逆流提取工艺研究中,在文献及预试验的基础 上,采用正交试验设计,以干膏得率、黄芪甲苷含量为主要考察 指标,优选出动态逆流提取工艺为:料液比为:,每阶段提取时间为 ,提取温度为。。对该提取工艺进行了验证,工艺稳定可行。动 态逆流提取和普通热回流提取相比较,在保证及提高指标成分提取率 的基础上,节省能源,缩短生产周期,是一种科学的中药提取方法,值得 推广应用于中药生产领域。 建立了动态逆流提取物高效液相色谱指纹图谱,用以控制其工艺和质 量的稳定。方法:用水超声提取后正丁醇萃取制备供试品溶液,色谱条件 为:甲醇..%磷酸溶液梯度洗脱;检测波长:;流速:./; 柱温:;进样量:“;信号采集时间:。结果:在所建立 的动态逆流提取物指纹图谱中,共标定了个共有指纹峰,方法 学考察结果符合指纹图谱技术要求。结论:指纹图谱可作为动态逆 流提取物全面质量控制的方法。 建立了动态逆流提取物中黄芪甲苷的含量测定方法。方法:选用蒸发 柱 ×., 光散射检测器,色谱柱为大连依利特 “;流动相为乙腈.水:,流速./,柱温 。结果: 此方法线性关系良好,.;平均回收率为.%,.%; 结论:该方法简便、快捷、准确性和重现性好,可用于测定动态逆流提取 物中黄芪甲苷的含量。 主题词动态逆流提取物;提取工艺;指纹图谱;含量测定 ? : : ? : . . .., . , , , ::, . . , ?, ?, . .:? .: ; :; :./; 一.%:. : 。; :肛; : .: . .:.:.%, ....; .%;: ,,, .;; ; 湖北中医药大学学位论文原创性声明 本人声明: 所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,本论文不包 含其它个人或集体已经发或撰写过的研究成果,也不包含为获得湖北中 医药大学或其它单位的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出贡 献的个人和集体,均已在论文中作了明确的。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:音苦纠亿 年岁、月扣日 钞 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的规定,即: 学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位 论文的全部或部份内容,可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文; 学校可以根据国家或湖北省有关部门的规定送交学位论文。 保密论文在解密后遵守此规定 。年孓月岁日 黻储擀卞弘锄签号龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 ‘上.】, 刖 罱 选择适宜的提取技术和提取设备是中药生产的关键技术,也是中药现 代化的必然要求。近年来动态逆流提取技术逐渐应用到中药领域,它是通 过多个或多段提取单元之间物料和溶剂的合理浓度梯度排列和相应的 配置,结合物料的粒度、提取单元组数、提取温度和提取溶媒用量, 循环组合,对物料进行提取的一种新技术【】。 动态逆流提取技术在单味中药的提取方面已经有较多的应用,如孙达 峰、史劲松等采用罐组式连续逆流提取设备提取白芨多糖,在料液比: 、提取时间、提取温度。的提取条件下,白芨多糖提取率可达. %,与传统的单罐二次提取法相比,白芨多糖提取率提高.%,提取时 间缩短,且每千克原料可减少水用量,具有节水、节能的优点。 蔡铭、陈勇等采用正交试验设计,考察提取时间、溶剂用量、提取温度和 粒度四因素对丹参素提取率的影响,获得了四效逆流提取丹参中丹参素的 最佳工艺条件,该工艺相比于热回流提取工艺,提取率提高了.%,溶剂 用量减少/,提取时间大大缩短【】。 但鲜有见到该技术在中药复方提取研究方面的报道,基于动态逆流提 取与一般提取方法相比,具有提取效率高,节约溶媒,能耗低,生产周期 短等优势,本课题试图运用该项提取技术对龙牡壮骨颗粒进行提取工艺研 究,采用正交试验设计,以主要有效成分含量及出膏率为指标进 行工艺参数的筛选,并且与热回流提取方法相比较,从提取效率、能耗、 生产周期等诸多方面评价该提取技术的优劣。 中药指纹图谱是一种创新型中药质量控制核心技术,它充分利用现代 科学技术手段,能完整地表征中药复杂体系的特征性。在草药评价 指南中,对有效成分不能鉴别的植物药制品和终产品可提供特征成分或混 合成分的色谱指纹图谱以保证产品质量的一致性【;英国草药典、印度草 药典、欧共体草药质量指南均将指纹图谱作为鉴别项,用以鉴别产品的真 伪并评价质量的一致性】。指纹图谱技术得到了国际的公认。目前指纹湖北 中医药大学届硕士学位论文 图谱研究和应用集中在中药注射剂、有效部位提取和单味药材的质控方 面,也应用到中药的生产过程,正在发挥越来越重要的作用。 因此,本文应用现代仪器分析方法,对龙牡壮骨颗粒动态逆流提取物 进行主要指标成分的含量测定和指纹图谱分析,并与回流提取物进行对比 分析,以控制提取物中间品的质量,确保工艺合理、质量可控,为本 制剂的进一步研究和开发奠定良好的基础。龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺 及质量控制研究 第一部分龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺的研究 引言 传统中药的提取方法主要有水煎煮法、热回流法、渗漉法等,这些方 法虽然有一定优点,但存在以下主要问题:?提取温度过高会增有效 成分的含量,降低产品质量,不适合热敏性成分的提取;?单个提取罐进 行多次间歇式提取,溶剂消耗量大,生产效率低,大大增加了后续浓缩能 耗;?药材与溶剂中的有效成分在接近平衡时的浓度差小,导致提取时间 长,提取率低。这些问题对中药产品的质量也都存在一定影响。 动态逆流提取技术是近年来应用于中药领域的新型提取工艺,它集萃 取、重渗漉、动态和逆流技术为一体。该提取技术具有工艺简单、溶剂大 大节省、能耗低、提取时间短、提取效率高等优点,是一种值得推广的新 技术、新工艺【】。它是在多个提取单元之间,通过药材和溶剂的合理浓度 梯度排列和相应的流程配置,结合物料的粒度、提取单元数和提取温度, 以循环组合的方式对物料进行提取的方法。该技术主要利用了固液药材 与溶剂两相中有效成分的浓度差,逐级将药材中有效成分溶出扩散至起 始浓度较低的提取溶剂中,达到最大限度转移药材中有效成分的目的。动 态逆流提取技术的主要工艺参数有药材粒度、提取温度、溶剂用量、提取 时间和提取单元组数,可根据具体对象,对工艺参数进行优化,获得最佳 提取工艺。 龙牡壮骨颗粒是被中国药典收载的品种,由党参、黄芪、麦冬、白术、 五味子、茯苓、山药等多味中药组方而成,主治小儿厌食、夜惊汗出、发 育不良为症状的小儿佝偻病。龙壮壮骨颗粒填补了以中药为主体治疗佝偻 病的空白,是全国最大的儿童用中药,国家一级中药保护品种。它疗效确 切,质量可靠,赢得了极高的市场占有率。目前龙牡壮骨颗粒的提取方法 采用水煎煮法,这种提取方法存在着提取率低、提取时间长、溶剂用量大、 后续工段能耗大等缺点。动态逆流提取技术确保了各提取单元的药材与溶 剂始终保持较大的有效成分浓度差,大大增加提取推动力,加快提取速率,湖 北中医药大学届硕士学位论文 提高最终溶剂有效成分的浓度,降低后续浓缩能耗】。 在中药材有效成分的提取领域,动态逆流提取技术有望成为广泛应用 的提取技术应用于中药制药企业。对于以复方为主导的中药领域,动态逆 流提取技术也会有较好的应用前景,特别是对多指标的研魁】。因此,本 部分将应用动态逆流提取技术对龙牡壮骨颗粒复方药材进行提取工艺的 研究,根据处方药材所含成分的理化性质及药理作用【,】,本提取工艺以 水为提取溶剂,考察指标以黄芪甲苷含量为主、浸膏得率为辅,以单因素 考察和正交实验相结合的方法,对提取单元组数、固液比、提取时间、提 取温度等因素进行考察,优选出最佳的提取工艺条件。 仪器与试药 动态循环分级逆流提取设备武汉健民科研所自主研制; 型液相色谱仪日本岛津; 色谱柱:大连依利特 柱×.,?; 旋转蒸发仪无锡市星海王生化设备有限公司; .型减压干燥箱上海浦东荣丰科学仪器有限公司; 电子分析天平,.; 黄芪甲苷对照品购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号为: .; 乙腈色谱纯,美国公司;双蒸水;其它试剂均为分析纯。 方法与结果 .逆流提取单元组数的确定 逆流提取工艺一般采用个以上的提取单元,而以~个单元最为 常用】,本文中采用单级实验的方法来确定提取单元组数,即以第一份药 材的提取液来提取后续的每一份药材,测定每次提取液中的黄芪甲苷含 量,结果见表.。 从表中可知,提取次后所得提取液中的黄芪甲苷含量不再增加,反 而有所减少,这是因为随着操作次数的增加,提取溶液已经达到饱和,会 导致成分被药材吸附而少量损耗。故初步选择提取单元组数为四组,即四龙 牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 提取条件:称取.倍处方量的混合药材等份,固液比::,水浴提取/次. .水提工艺条件正交试验 ..正交试验因素预试验 ...提取时间的考察 根据文酬】,多级逆流提取工艺研究中,单个提取过程的提取时间水 平的中间值,一般选择热回流时间除以罐组数,因此本实验在~ 范围内的不同时间条件下对处方药材进行一次性热回流提取预试 验,结果见图.,以确定单过程的提取时间。 提取条件:称取.倍处方量的混合药材等份,固液比::,在热回流提取。 图提取时间对提取率的影响 由图可知,最佳提取时间为。在选择四级逆流提取模式的条件 下,即确定单过程提取时间的中间水平为。 ...提取温度的考察 在。一。范围内的不同温度条件下对处方药材进行四级逆流 提取实验,结果如图.所示。从图中曲线可以看出,当温度为。时, 药材在短时间内难以被水完全浸润,故指标成分的提取率很低。随着温度 的升高,指标成分的提取率明显增加,在。时提取率达到最大值,当湖北中医 药大学届硕士学位论文 温度超过 时,黄芪甲苷提取率有所下降。这可能是因为温度升高有 利于其它成分大量溶出,使得黄芪甲苷在此溶液中的溶解度稍有减少。但 和。相比,提取率增加不明显。从降低能耗和节省成本的角度考 虑,选择提取温度水平的中间值为。冰 锝 甾裂 . 提取温度? 提取条件:称取.倍处方量的混合药材等份,固液比::,级逆流提取,/次. 图提取温度对提取率的影响 .. 正交试验设计 在预试验的基础上,以剪碎状的药材粒度作为固定条件,以固液比、 提取时间、提取温度为主要考察因素,以干膏得率、黄芪甲苷含量为考察 指标,设计四级动态逆流提取的因素水平,因素及水平见表.。 表 因素水平表 .试验方法 根据四级动态逆流提取的原理和方法【】,每次实验称取等份.倍 制剂处方量的混合药材,按正交试验设计提取,将水提取液过滤并浓龙 牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 缩至一定体积,定容,依下法测定。 ..干膏得率的测定将上述定容液摇匀,精密量取置蒸发皿中 水浴蒸干,转移至烘箱中烘至恒重,置干燥器冷却半小时,减去蒸 发皿的重量,计算干膏率。 ..黄芪甲苷的含量测定方法 色谱条件与系统适应性试验: 型蒸发光散射检测器;色谱 ×., ;流动相为乙 柱为大连依利特 反相柱 腈.水:;流速为/;柱温为。。 对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品.,置量 瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得每含黄芪甲苷.。 供试品溶液的制备:精密称取龙牡壮骨颗粒逆流提取物.,置具塞 锥形瓶中,精密加入甲醇,密塞,称定重量,超声处理功率, 频率,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀, 滤过,精密量取续滤液,水浴上蒸干,残渣加水,微热使溶 解,用水饱和的正丁醇振摇提取次,每次,合并正丁醇液,用氨 试液充分洗涤次,每次,再用正丁醇饱和的水洗一次,正丁醇液 蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用 微孔滤膜.“滤过,即得。 ,注 测定法:精密吸取对照品溶液“、“,供试品溶液 入液相色谱仪,测定,以外标两点法对数方程计算,即得。 .试验结果 以提取物中黄芪甲苷含量和干膏率为考察指标综合优选最佳提取工 艺,正交试验结果及结果分析见表.。 数据统计分析用正交设计助手 .,方差分析结果见表.,.。 表.直观分析结果表明:影响干膏率和黄芪甲苷含量的因素的大小 顺序为:,。表.、.方差分析表明:因素提取温 度对干膏率和黄芪甲苷含量均有显著性影响.,故应该选择最 佳的;因素提取时间对干膏率有显著性影响.,对黄芪甲苷湖北中医药大学届 硕士学位论文 含量无显著性影响,考虑到黄芪甲苷含量比干膏率重要,为节约成本,应 选最佳的;因素对两指标无显著性影响,从大生产降低能耗、节约 成本考虑,选择最佳提取条件为。,即固液比为:,单过程提取 时间为分钟,提取温度为。 表 正交实验结果龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 注:.,.;.,.;.,. .优选提取工艺验证 根据所筛选的最佳提取条件,分别提取等份.倍处方量的混合药 材,依次测得各批的干膏率、黄芪甲苷含量,结果见表,验证结果与 正交试验结果相近, 证明该工艺稳定可行。 表 验证实验结果 .动态逆流提取与热回流提取工艺的比较 各取.倍制剂处方量的混合药材数份,分别按回流法将药材加入湖北中医药 大学届硕士学位论文 水。回流提取次,前次各倍量水提取,后次倍量水提取 和四级动态逆流提取工艺固液比:,提取温度。,单级提取 时间进行比较,结果见表.。 从表.可知,动态逆流提取工艺与热回流法相比,黄芪甲苷的提取 率提高了.%,效果显著,溶剂消耗量明显下降,提取时间也大大缩 短,生产效率大幅度提高。 表 两种工艺各指标结果比较 小结 .动态逆流提取的单元组数,又称提取级数,如提取单元组数为的, 称为四级动态逆流提取。根据动态逆流提取的原理【和本实验的方法,动 态逆流提取的级数,与药材的量和加入溶剂的次数存在如下表所示关系, 据此计算出溶剂的用量/药材和总的提取时间。 .黄芪为本方的君药之一,它所含有的黄芪甲苷为主要活性成分之一, 中国药典也是以它作为含量测定的指标,故在本文中以黄芪甲苷含量作为 优选动态逆流提取工艺的考察指标之一。 .由于使用了动态逆流提取工艺,最大程度提高了水的利用率,因而水 的用量从热回流工艺的 /药材减少到动态逆流提取工艺的. /药材,使得生产过程中溶剂周转量和实际消耗量大大下降,节省提 取时间.%,而且本工艺使有效成分的转移率达到%以上,较热回流 法提取工艺有较大提高。龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 第二部分龙牡逆流提取物的指纹图谱研究 中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中 药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半 成品质量的真实性、优良性和稳定性。建立中药指纹图谱将能较为全 面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质 量进行整体描述和评价】。但优选适宜的提取方法及分离条件一直是 色谱分析中药制剂中最关键的步骤之一【】。本文采用高效液相色谱法 建立了龙牡壮骨颗粒动态逆流提取物的特征指纹图谱,以期为龙牡壮 骨颗粒相关产品的开发建立新的质量控制标准。 仪器与试药 高效液相色谱仪系统; 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统版》国家药典委员会发行; 色谱柱.×, ; 大连依利特 .型超声波清洗器上海; ; 电子分析天平,. 批龙牡壮骨颗粒逆流提取物为自制批号为?; 乙腈、甲醇色谱纯,美国公司; 磷酸分析纯,水为双蒸水。 实验方法 色谱柱.× .液相色谱条件色谱柱:大连依利特 ,“;确定的梯度洗脱程序见表.;检测波长:;流 速:./;柱温。;信号采集时间:;理论塔板数以号 峰计,应不低于。 .供试品溶液的制备精密称取龙牡壮骨颗粒逆流提取物.克,加入 水超声提取,提取液离心,倾取上清液,转移至分液漏斗中, 用水饱和的正丁醇萃取次,,,分取正丁醇层,水 浴蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,湖北中医药 大学届硕士学位论文 用微孔滤膜. 滤过,即得。 表 确定的梯度洗脱条件 ,注入液相色谱仪中,测定,构建 .测定法 精密吸供试品溶液 指纹图谱,并用“计算机辅助相似性评价系统对样品指纹图谱的相似度 进行测定。 .实验条件选择和优化 .流动相选择 流动相采用等度洗脱无法分离样品中的复杂成分,因此需采取梯度洗 脱的方法进行分析【。比较了甲醇.水、甲醇..%磷酸溶液、甲醇..% 磷酸溶液、乙腈.水、乙腈..%磷酸溶液和乙腈..%磷酸溶液等流动相 的分离效果,结果表明,同一条件下甲醇较乙腈对样品中成分的分离效果 较佳,.%磷酸溶液与.%磷酸溶液相比没有明显改善各峰分离情况和 峰形。因此,选择甲醇..%磷酸溶液作为基本的流动相。 .检测波长的选择 对供试品溶液在~波长下进行扫描,结果显示供试品溶 液在和波长下出现吸收峰,见图.。 一 ” 詈 : 看 \ , . 弋 僮 。; 一’?如一’。如一’幽一’’如一一山’~’如’一。幽~’如’止赫赫 图 逆流提取物供试品溶液紫外扫描图龙牡牲骨颗粒动态逆流提取工艺及质 量控制研究 本实验考察了,,,波长下的高效液相色 谱图,见图.。对不同波长下的出峰数和总峰面积进行了考察,结果见 表。 几. 、川从 。.认. 、一 川~。?..一 ..、 ....\.. 以。.. .几... . ....九 .,、 ....。. 、,、,: 儿 ?儿?. 、?一 。、.,、.....、..,.。,九,、、.、..凡. . 湖北中医药大学届硕士学位论文 图龙牡壮骨颗粒逆流提取物在不同检测波长下的高效液相色谱图 表 不同检测波长的考察结果 结果显示,从峰面积来看,峰面积最大,但峰分离度和基线稳 定情况均较差;下的峰面积也较大,但各峰分离度较差,且. 处的峰面积在所有峰中占的比重高达.%,影响了指纹图谱相似度评 价的灵敏性;比较,下的色谱图,可知下峰面积较 大,基线稳定情况和分离度均相对较好。综合考虑,选择作为检 测波长。 .供试品制备方法的选择 考察了超声提取法和回流提取两种提取方法,结果显示超声提取效果 近似于水浴回流提取效果,故最终选择操作更为简单的超声提取作为提取 方法。 考察了供试品溶液的不同制备方法甲醇超声法、乙醇超声法、醇沉 法,正丁醇萃取法,甲醇法制备的供试液放置天会产生水溶性颗粒结 晶,乙醇法和醇沉法出峰数较少,而用正丁醇法处理,可以除去水溶性的龙牡 壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 单糖和多糖,延长色谱柱的使用寿命,而且测定的峰数较多、各峰分离良 好。因此,选择.项下的正丁醇法处理样品。 方法学考察 .精密度实验取同一供试品溶液,在上述色谱条件和测定方法下,连续 进样次,结果表明各共有峰的相对保留时间均低于%见表., 相对峰面积的均低于%见表.,表明仪器系统精密度良好。 表 精密度和稳定性试验中的相对保留时间及值湖北中医药大学届硕士学位 论文 .稳定性实验取同一供试品溶液,在上述色谱条件下,分别在、、、 、小时进行指纹图谱测定,测得各共有峰的相对保留时间均低 于%见表.,相对峰面积均低于%见表,表明供试 品在常温下稳定,符合指纹图谱要求。龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质 量控制研究 .重复性实验取同一批号的供试品,按.项下方法制备份供试液, 按上述方法和色谱条件测定指纹图谱。结果表明,各共有峰的相对保留时 间均低于%见表,相对峰面积均低于%见表, 符合指纹图谱要求。 表 重复性试验中的相对保留时间及值 峰号 样品 样品 样品 样品 样品 % 。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 雄 . . . . . . . . . . . . 屿 . . . . . . 坞 . . . . . . . . . . . . 坞 . . . . . . . . . . . . 湖北中医药大学届硕士学位论文 指纹图谱及技术参数 .共有峰的确定 根据批供试样品的检测结果,比较其色谱图。采用相对保留时间标 定共有指纹峰,标定了范围内的个峰为共有指纹峰,典型色 谱图如图.所示。龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 ? ..八.己. 级 乏 一七苏二芷。一.腔&、 一 图指纹图谱共有峰 表 六批样品指纹图谱共有峰相对保留时间 湖北中医药大学届硕士学位论文 .参比峰的确定 号峰不仅为各批样品共有,而且其峰大小合适,峰面积值稳定峰 面积为.%,在色谱图中分离度良好分离度均大于。所以将 号峰作为参比峰计算各指纹共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结 果见表.,。 表 六批样品指纹图谱共有峰相对峰面积龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及 质量控制研究 .样品指纹图谱的相似度评价 相似度是评价中药指纹图谱的一个重要参数,现在常采用中药指纹图 谱间的相似度来判断中药质量是否稳定合格【。本文主要采用国家药典委 员会推荐试用的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统版》对批 样品进行相似度评价,图谱见图。计算了批龙牡壮骨颗粒逆流提取 物的指纹图谱与它们的共有模式图谱共有模式图谱的建立采用平均数 法的相关系数,结果见表。结果表明,批样品相似度良好,批次 之间质量稳定。 表 指纹图谱全谱相似度评价 一’ 图?指纹图谱相似度评价结果 .龙牡壮骨颗粒逆流提取物指纹图谱与药材相关性分析 按照单味药材在复方中所占的重量称取六味药材黄芪、党参、麦冬、 茯苓、五味子、甘草,依照第一部分确定的提取工艺进行提取,并按照 本部分项下方法进行指纹图谱测定,将各味药材指纹图谱与龙牡壮骨颗 粒逆流提取物的标准指纹图谱共有峰的相关参数进行对比分析,对比图见 图.,相关性分析结果见表.。湖北中医药大学届硕士学位论文 。 肌~ 。肌.。~。 ..??.. : 一 ; . .?~、,、.、...、.., 晒 一..芒..』口 口 口 口 一 ?』.... 矗 ~ ,? 。.,芒一』 ‰~~』己愁一蜒芒 段 。 ’ ’ . 。。’’’石.’。’。’ 。。’’’。’。口’ . ..,“,一 .伯 一.一一?。, 比 . 以 删 默 』 : 九 ... 叶 : .?、一 ’ ’ 。 ’ 。 。 ? ’ 。 ’ ’ ’ 。 ’。’’’。。口 。 。从上至下依次为党参、黄芪、五味子、甘草与龙牡壮骨 颗粒逆流提取物的对比指纹图谱 图部分药材指纹图谱与标准指纹图谱对比 。 。 山...三疋: 、,,?龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 表 龙牡壮骨颗粒逆流提取物指纹图谱与部分药材的相关性 共有峰 归 属 五味子 甘草 五味子 甘草、黄芪 党参 甘草 甘草 黄芪 黄芪 甘草 甘草 他幅垢挎 黄芪 在相关性分析过程中,我们发现茯苓、麦冬两味药材在波长 下的指纹特征峰面积很小,且对逆流提取物指纹特征峰的归属没有贡献, 故未将这两味药材列入上表中。 动态逆流提取物与回流提取物指纹图谱对比分析 动态逆流提取物与回流提取物制备方法见第一部分.项的指 纹图谱见图,对各共有峰的相关参数进行分析可知,在逆流提取物指 纹图谱的共有峰中, 号峰、 号峰、号峰的峰高比约为::., 在回流提取物的指纹图谱中,、 、号峰的峰高比为.::.,说 明逆流提取物中和号峰所代表的成分相对含量有所下降,但为何种 成分以及对药效有何影响,有待进一步的研究。 运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统版》对两组指纹图 谱进行相似度评价,相似度结果均在.以上,表明两种提取物在化学 成分种类和数量上存在极高的相似性和一致性,同时也说明指纹图谱是一 种能更好地评价、控制中药及中药产品质量的有效手段。湖北中医药大学届 硕士学位论文 图两种提取物的指纹图谱对比图 小结 .中药治疗疾病的效果,是其所含的多种化学活性成分共同作用的结果, 无论是薄层鉴别,还是针对某一有效成分的含量测定,都无法全面系统的 揭示中药的内在质量。指纹图谱具有整体性和模糊性统一的特点,提供的 有效信息较单一化学对照品作为鉴定依据要丰富的多【 。本文采用高效液 相色谱法对个批次的龙牡壮骨颗粒复方逆流提取物进行指纹图谱分析, 并进行了相似度评价,为其质量控制提供了科学依据,有利于龙牡壮骨颗 粒逆流提取物相关产品的质量控制。 .考虑到中药复方的成分复杂,极性不一,有脂溶性成分也有水溶性成 分,目前的分离技术很难将极性差异较大的成分同时分离。因此,有必要龙牡 壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 按极性分组,通过不同溶剂提取分离,将组分从数量上减下来,再分别建 立指纹图谱,这样形成一组图谱来表达中药的药效物质基础。本文只建立 了正丁醇部位的指纹图谱,其它部位的指纹图谱有待进一步研究。 .目前的指纹图谱基本上反映的都是中药的化学成分信息,而不是药效 信息,存在指纹图谱与药效脱节的现象【。我们应该将指纹图谱研究与药 效学研究相结合,探讨药物的“谱效学关系,以达到真正反应药品质量 优劣的目的,从而利用指纹图谱的整体性与药效学的宏观性来反映、探索 中医药作用,促进中医药理论体系研究的深入发展。 .流速的选择流动相流速为./时,无论怎样优化洗脱梯度,色 谱图中的主峰都很难与相邻峰较好分离。进一步考察了./和 ./两种流速,结果表明流速为. /时各色谱峰分离度良好, 出峰时间居中,因此选择流速为./。湖北中医药大学届硕士学位论文 第三部分龙牡逆流提取物中黄芪甲苷的含量测定 龙牡逆流提取物由十三味中药材提取而制得,其中黄芪为本方的君药 之一。黄芪甲苷为黄芪的主要活性成分之一,能抗炎降压、镇痛镇静【】 和促进再生肝水平【。现代药理研究表明,黄芪甲苷具有改善白细 胞变形能力、改善心肌收缩及舒张功能、促进胰岛素分泌和清除自由基等 药理作用。中国药典也是以它作为含量测定的指标。近年来,随着蒸发光 散射检测器的应用,.法解决了黄芪甲苷只有末端吸收 的问题,大大提高了测定的专属性,降低了共存物的干扰,越来越广泛地 应用于质量控制中?】。本文用高效液相色谱法和蒸发光散射检测器,研究 并建立了龙牡壮骨颗粒动态逆流提取物中黄芪甲苷的含量测定方法。 仪器与试剂 型液相色谱仪日本岛津; 型; 蒸发光散射检测器 色谱工作站; 黄芪甲苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用,批号: ?; 色谱柱:大连依利特 柱×.,“,理论塔板 数按黄芪甲苷峰计算应不低于; 电子分析天平,.. .型超声波清洗器上海; 乙腈为色谱纯美国公司,水为双蒸水; 其它试剂均为分析纯。 实验方法 .色谱条件及系统适用性试验 柱 ×., ; 色谱柱:大连依利特 流动相:乙腈.水:;流速:./;柱温:;检测器: 型蒸发光散射检测器雾化室温度,增阈值;在该条龙牡壮骨颗粒动态逆流提 取工艺及质量控制研究 件下测定,黄芪甲苷峰与相邻其他峰可达到基线分离,分离度均大于., 处方中其它成分对测定没有干扰。 .对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品.,加甲醇溶解 并定容至量瓶中,制成每合.的溶液,即得。 .供试品溶液的制备:取龙牡壮骨颗粒逆流提取物约.,精密称定, 置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇,称定重量,超声处理功率, 频率分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇 匀,滤过,精密量取续滤液,蒸干,残渣加水,微热使溶解, 用水饱和的正丁醇振摇提取次,每次,合并正丁醇液,用氨试液 充分洗涤次,每次,再用正丁醇饱和的水洗一次,正丁醇液蒸干, 残渣用甲醇溶解并转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤 膜. 滤过,即得。 .测定法:精密吸取对照品溶液“、 ,供试品溶液?,注 入液相色谱仪,测定,以外标两点法对数方程计算,即得。 供试品溶液的制备条件考察 参考中国药典版一部第页【】黄芪【含量测定】项下,样品 制备方法重点考察样品第一步的提取方法,正丁醇提取部分同药典方法。 .提取方法的比较 分别取逆流提取物约.,精密称定,采用以下种方法进行考察: ..置索氏提取器中,加甲醇,冷浸过夜,再加甲醇适量,回 流提取小时,提取液回收甲醇并蒸干,残渣加水溶解,用水饱和 正丁醇振摇提取次,每次,合并正丁醇液,用氨试液洗涤次, 每次,再用正丁醇饱和的水洗一次,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶 解并转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜.“ 滤过,即得供试品溶液。 ..置锥形瓶中,精密加甲醇,称定重量,超声,用甲 醇补足减失的重量,过滤,取续滤液,置蒸发皿中蒸干,残渣加水 溶解,用水饱和正丁醇振摇提取次,每次,合并正丁醇液,湖北中医药大学届 硕士学位论文 用氨试液洗涤次,每次,再用正丁醇饱和的水洗一次,正丁醇液 蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用 微孔滤膜. 滤过,即得供试品溶液。 分别取上述份供试品溶液进样,结果见表。 表 不同提取方法含量比较 由上述结果可得:采用索氏提取和超声提取方法测得的黄芪甲苷含量 基本一致,故采用甲醇超声提取方法制备供试品溶液。 .超声时间的比较: 取龙牡壮骨颗粒逆流提取物约.,共份,精密称定,同..操 作,分别超声处理,,,检测,计算,结果见表.。 表 超声时间考察 超声时间 测定的含量/ . . . 根据上述结果:选择超声时间为。 专属性实验 按照.项下方法制备龙牡壮骨颗粒逆流提取物样品及缺黄芪的阴性 样品供试品溶液,按照项下色谱条件和测定方法测定,结果显示黄芪甲 苷与相邻峰分离度好,且阴性样品无干扰。黄芪甲苷对照品,逆流提取物 样品及缺黄芪的阴性样品色谱图见图.。龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及 质量控皋】研究.对照品溶液;.动态逆流提取物样品;.缺黄芪的阴性对照色谱图 图黄芪甲苷高效液相色谱图 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品.,加甲醇溶解并定容至容量 瓶中,制成对照品溶液./。分别精密吸取对照品溶液.、 .、.、、、置量瓶中,分别用甲醇稀释定容 至刻度,摇匀,配成浓度分别为./、 ./、./、 ./、 ./、/的黄芪甲苷对照品溶液。精密吸取 ,分别注入高效液相色谱仪中,按上述色谱条件进行测定。结果见表 .湖北中医药大学 届硕士学位论丈 表 黄芪甲苷线性关系 以对照品进样量常用对数为横坐标,相应峰面积常用对数为纵坐标, 绘制标准曲线,计算回归方程,方程为:..,., 见图.。结果表明,黄芪甲苷进样量在 .~范围内线性 关系良好。 图?黄芪甲苷标准曲线 精密度试验 .重复性试验 取同一批龙牡逆流提取物样品,平行称取份,按.项下方法测定, 测得含量平均值为./,为.%。其结果见表?。 .中间精密度试验 在同一实验室,不同的分析人员换用不同的高效液相色谱仪在不同时 间对同一批逆流提取物进行含量测定,测定结果见表?。结果表明:相龙牡壮 骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制研究 对标准偏差为.%,本方法中间精密度较高。 表 重复性试验 准确度试验 称取已知含量./均龙牡逆流提取物样品约.,共份, 精密称定,分为组,分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液.,/, ../,../各,按项下方法制备供试品溶液并测 定,计算回收率,结果见表。结论:平均回收率为.%,为 .%,表明本方法准确度良好。 耐用性试验 .稳定性试验取同一批龙牡逆流提取物样品,按.项下方法制备供试 品溶液,在室温下放置,,,,,小时后测定,含量基本不变, 说明样品液在配制好后至少小时内稳定,为.%。其结果见表 .。湖北中医药大学届硕士学位论文 .流动相比例影响:称取动态逆流提取物样品,按.项下方法制备供 试品溶液,固定色谱柱为大连依利特 ×.,“ ,对流动相条件进行了优化研究,测得黄芪甲苷含量见表.,表明流 动相比例小幅变动对含量测定结果无影响。 流动相:乙腈.水:,色谱图见图.。 图流动相乙腈.水:的色谱图 左为黄芪甲苷对照品,右为样品龙牡壮骨颗粒动态逆流提取工艺及质量控制 研究 流动相:乙腈.水:,色谱图见图.。 图流动相乙腈.水:的色谱图 左为黄芪甲苷对照品,右为样品 流动相:乙腈.水:,色谱图见图.。 图流动相乙腈.水:的色谱图 左为黄芪甲苷对照品,右为样品 表; 流动相比例调整对结果影响考察 为.方法确定的流动相比例 .色谱柱影响 选择三根不同厂家不同牌号填料的色谱柱,测定动态逆流提取物样品 中黄芪甲苷的含量,结果表明不同的色谱柱对结果无影响。结果见表。湖北 中医药大学 届硕士学位论文 表 不同牌号色谱柱对结果影晌考察 样品的测定 按.项下的方法,制备对照品溶液与供试品溶液。分别精密吸取对 照品溶液“,?及供试品溶液?注入液相色谱仪,测定,用外标 两点法对数方程进行计算,共测定批样品,结果见表.。 表 批样品含量测定结果 小结 .通过调节蒸发光散射检测器的载气压力和漂移管温度可以使检测器 达到最高灵敏度。通过实验发现,在. /均流速条件下,设定. 的载气压力和的漂移管温度可以获得最大的检测灵敏度。当载气压力 较低时,会因喷出的雾滴不均匀产生色谱峰顶端尖刺的现象;而流速过高, 则会因为雾滴的粒度过小,使灵敏度降低。当漂移管温度过低时,流动相 的蒸发不完全,直接由蒸发管流出,导致检测信号较低;温度过高,则会 使形成的微粒大小不均匀,导致精密度较差。另外,设定增阈值为,可 以使信号响应增高,且基线的噪音不会对检测产生任何影响。 .对未经氨水处理的黄芪药材检测中发现黄芪甲苷的含量偏低,而经 过氨水处理后的药材黄芪甲苷的含量明显增高。分析其原因主要为,用氨 水处理样品的主要作用是将黄芪醇类皂苷酯氨解为黄芪甲苷,从而明显增 加药材中黄芪甲苷的含量。