附件1：人感染猪链球菌病样品采集与实验室检测方案

附件1：人感染猪链球菌病样品采集与 附件1 人感染猪链球菌病样品采集与实验室检测方法 一、样品采集 1(采样器材 ?无菌封闭性好的试管～最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管～避免使用玻璃试管。 ?可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。 ?可以方便采集组织标本的无菌容器。 ?无菌的剪刀、镊子和手术刀。 ?血平皿和增菌培养瓶。 ?乳胶手套、隔离服、防护口罩等。 ?带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器。 ?采样送检单。 2(样品种类 ?现症病人非抗凝全血 ?现症病人抗凝血 ?脑脊液标本 ?尸体解剖应无菌采集淋巴结、脾、肝、心腔血、胸,腹,水 ?如有病死猪也可进行解剖～取淋巴结、脾、肝、心腔血、肉 3(血液和脑脊液标本采集方法 ?无菌抽取血液10ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中 按常规方法腰穿采集3，5ml脑脊液标本置于无菌试管中。 ? ?采集的标本立即接种血平皿和/或增菌培养瓶～置于35，37?培养。 4(样品运输保存 ?所有的原始标本在转运过程中应置于安全密闭的容器中。 ?标本应冷藏运输。 ?用于检测的标本可在4~8?冰箱暂放。 ?剩余标本应放置于-70?保存。 5(注意事项 ?严格无菌操作～防止标本污染。 ?用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。 ?应尽可能床边接种血平皿和增菌培养瓶。如无法床边接种～样品应尽快送实验室～并立即检测。 ?在标本采集过程中～注意安全防护。使用乳胶手套、隔离服、防护口罩。采取预防～防止针头等锐器刺伤。 二、实验室检测 1(推片镜检 抗凝血或脑脊液可推片进行革兰氏染色镜检。阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒～细胞外偶尔可见革兰氏阳性链球菌。 2(猪链球菌分离鉴定 ?血平板接种 血液或脑脊液等标本可直接接种于新鲜羊血琼脂平板,如无血平板可用含8 %胎牛血清的营养琼脂平板代替,。组织标本可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤～洗液接种平板。平板置37?5% CO培养箱或者烛缸中培养24，722 小时。也可在37?普通培养箱中培养。 ?增菌培养 无菌部位采集标本置脑心肉汤或含8%新生牛血清葡萄糖肉汤或商品化血培养瓶中～37?增菌培养24小时，1周～逐日观察～接种新鲜羊血琼脂平板～置37?5% CO培养箱或者烛缸中培养24，72小时。对污染标本接种选择增菌培养2 液,含15微克/毫升多粘菌素B～30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基,增菌约15小时后接种血平板～或直接划线接种含两种抗生素的羊血琼脂平板培养基～在蜡烛缸或CO2培养箱中培养24，72小时。 ?形态学鉴定 猪链球菌在血平板上呈直径l，2毫米的细小菌落～灰白色～半透明～边缘整齐～凸起～光滑～α溶血,偶尔也有弱β溶血或α溶血、β溶血现象均不明显,。 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检。猪链球菌无芽胞～刚分离的猪链球菌为典型的革兰氏阳性链球菌～链长达二十多个～多次传代培养后细菌形态不典型～结晶紫着色不良～多为短链或不成链的球杆菌。 ?筛检生化试验 猪链球菌触酶试验阴性～可与葡萄球菌区别。 ?血清学检测 用分型诊断血清～进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验。确定所分离的菌株为R群～与2型猪链球菌分型血清反应。 目前国内无血清供应。据报道,加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。 ?生化鉴定 在血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验～如符合链球菌特征～接种血平板纯培养后进行生化鉴定。 梅里埃API 20 strep等生化鉴定系统可鉴定2型猪链球菌。 ?PCR检测 采用PCR技术可以检测猪链球菌种特异性基因16S rDNA、猪链球菌2型和1/2型特异的荚膜多糖基因(cps2j)、毒力因子溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和细胞外蛋白因子基因(ef)～有条件的实验室可以采用。 猪链球菌种特异性基因16S rDNA检测可以鉴定猪链球菌,猪链球菌特异的荚膜多糖基因(cps2j)检测可以鉴定猪链球菌2型和1/2型,毒力因子溶菌酶释放蛋白基因,mrp,和细胞外蛋白因子基因,ef,检测可以鉴定高致病性的猪链球菌。