喷昔洛韦脂质体制备及质量控制

喷昔洛韦脂质体制备及质量控制 第45卷第6期 2007年6月 山东大学学报(医学版) JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) v01.45No.6 Jun.2007 文章编号:1671—7554(2o07)06—0635—04 喷昔洛韦脂质体制备及质量控制 宋丽洁,王唯红,陆金萍 (山东大学药学院药物分析室,山东济南250012) [摘要]目的:制备喷昔洛韦脂质体,并控制其质量.方法:以均匀优化工艺制得喷昔洛韦脂质 体,透射电镜观察其形态,广角度激光光散射仪测定粒径,凝胶柱层析法结合系数倍率法测其包封率及渗漏 率.结果:脂质体平均粒径426.8nm,平均包封率60.76%.结论:该脂质体制备工艺可行,检测方法可靠. [关键词]喷昔洛韦;脂质体;质量控制 [中图分类号]R944[文献标识码]A Preparationandqualitycontrolofpenciclovirliposome SONGLi—jie,WANGWei—h0ng,LUJin—ping (InstituteofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,ShandongUniversity,Jinan250012,Shand ong,China) [ABSTRACT]Objective:Tostudythepreparationofpenciclovirliposomesanditsqualitycontro1.Met hods: Theoptimumpreparationtechnologywasestablishedbyauniformdesign.Negativestainingandthelase rscatteringpatti— clesizedistributionanalyzerwereusedtostudythestructureandsizeofliposomes.AgelcolumnandK—ratiospeetropho— tometryweredevelopedtodeterminetheentrapmentefficiency.Results:Theaveragesizeofliposomes Was426,8Bin. TheentrapmentefficiencyWas60.76%.Conclusion:Thepreparationofpenciclovirliposomeispractic ableandshould beinvestigatedfurther. 【KEYWORDSJPenciclovir;Lliposome;Qualitycontrol 喷昔洛韦(penciclovir,PCV)是鸟嘌呤衍生物, PCV的溶解性不佳,在水中微溶,在乙醇中极微溶 解,在氯仿或乙酸乙酯中不溶uj,因此,局部用药时, PCV的皮肤渗透性较差.脂质体作为新型的局部药 用载体,可提高PCV的皮肤渗透性,使病毒感染的 局部药物浓度增加,增强局部的抗病毒能力.本实 验以薄膜分散法制备PCV脂质体,并对其处方工艺 及质量控制方法进行了研究. 1与方法 1.1仪器与试药Brookhaven广角度激光光散射仪 (英国Malvenn公司),H一7000型透射电子显微镜(13 本Hitachi公司),uV一2401PC型紫外分光光度计(13 [基金项目]山东省自然科学基金资助课(Q99co6). 【作者简介]宋丽洁(1982一),女,硕士研究生,研究方向:药品质量控制.【通讯作者] 王唯红(1956一),女,教授,硕士生导师,研究方向:药物分析. 本岛津),R201旋转蒸发仪(上海申生科技有限公 司),PCTbasic加速磁力搅拌器(ZKA—WERKE公 司),电热恒温水浴锅(江苏省东台市电器厂). PCV原料药(丽珠集团常州康丽制药有限公 司,含量98.9%),PCV对照品(丽珠集团常州康丽 制药有限公司,含量99,5%,批号20011005),大豆磷 脂和胆固醇(生化试剂,上海伯奥生物科技有限公 司),Sephadex-G75(进口分装,上海化学试剂厂),乳 糖(生化试剂,哈尔滨制药厂),其他试剂均为分析 纯. 1.2PCV脂质体的制备根据预试验结果,以磷脂 与胆固醇的摩尔比(X),水化时间(X2)和搅拌速度 (x)3个因素为主要考察因素,每个因素取5个水 平,按均匀设计法.设计(见1),按U5(5)安排 636山东大学学报(医学版)45卷6期 1.3.2PCV脂质体包封率的测定 1.3.2.1凝胶柱层析法分离脂质体和游离药物柱 层析条件:Sephadex.G75柱,洗脱液为PBS(pH6.8), 流速1ml/min,室温下层析.精密移取脂质体混悬液 1ml上柱,以柱层析条件洗脱,分段收集,记录各组分 的洗脱体积和相应的吸收度值,结果为?1,5ml为 PBS空白洗脱液;?5,25ml为PCV脂质体;?25,40 ml为PBS空白洗脱液;?40,65ml为游离的PCV. 脂质体与游离药物可以很好的分开. 1.3.2.2柱回收率考察配制一系列不同浓度的 PCV标准溶液,精密量取1ml上柱,按”3.2.1”项下 的层析条件进行柱层析.收集游离药物组分后,稀 释定容,测吸收度值,按”3.2.2”项下的标准曲线,计 算PEV柱回收率,其平均值为9o.41%(表3).配制 一 系列不同浓度的PCV标准溶液,分别与空白脂质 体混合,得标准混合液.精密量取lml上柱,相同条 件进行柱层析,测定游离药物的组分吸收度值,计算 PCV的柱加样回收率,其平均值为88.6%(表4). 表3PCV的柱回收率(n:3) 表4PCV的柱加样回收率(n=3) 1.3.2.3系数倍率法测定PCV脂质体中的PCV 测定波长的选择与K值的测定将PCV与空 白脂质体分别用PBS溶解(空白脂质体需加适量异 丙醇破乳),以PBS为空白,于200,400nln范围内 扫描,见图1.采用系数倍率法进行测定,选定PCV 最大吸收波长253nnl作为,选定:295nll[1.以 PBS配制一系列不同浓度的空白脂质体溶液,以 PBS为空白,在253nlTI,295nln处分别测定吸收度 值,倍率系数K为空白脂质体在两波长处的吸收度 比值,即K=A,/A2.求得K平均值为1.4023, RSD=0.34%(n=5),见表5. 餐 波长(t/ma) 图1PCV(1)和空白脂质体(2)的紫外光谱图 Fig.1UVabsorptionspectraofPCV(1)andblankfiposomes(2) 表5倍率系数的测定(n=5) 宋丽洁,等.喷昔洛韦脂质体制备及质量控制637 标准曲线的建立取PCV对照品0.O1g,精密 称定,置于100ml容量瓶中,用PBS溶解并稀释至刻 度,得浓度为106~g/m]标准储备液.分别移取储备 液0.5,0.8,1.0,1.2和1.5ml于1Oml容量瓶中,PBS 稀释至刻度,分别于入.=253nIn,=295nIn处测定 吸收度值.以/XA=A.一kA2计算/XA值.并以C 对?A回归,得回归方程:/XA=0.0046C+0.0056, r=0.9998,线性范围5.30,15.90ml. 回收率的测定取空白脂质体加适量异丙醇破 乳,用PBS溶解并分别稀释成3种不同浓度的溶液, 以磷脂浓度计算分别为25,5O和75~e,/ml.精密移 取PCV标准储备液0.5,0.8,1.0,1.2和1.5ml于 1Oml容量瓶中,分别用以上3种不同浓度的空白脂 质体稀释至刻度,分别测定253nnl和295nnl处的吸 收度值,由标准曲线计算回收率,平均值为99.95%, RSD为0.54%(n=15). 1.3.2.4样品包封率的测定按建立的柱层析条 件,精密移取1ml脂质体上柱,分离含药脂质体和 游离药物,收集游离药物部分,稀释定容,测其/XA 值,由标准曲线计算游离药物量W游.另取1ml脂 质体,加异丙醇破乳,PBS稀释定容,测定AA值,计 算总药量W总.包封率=(一W游)/W总X100%,共 测定3批产品. 1.3.3PCV脂质体渗漏率的测定制备PCV脂质 体,密封于棕色瓶中,4?条件下放置,定时取样,测 其渗漏率.按”1.3.2”项下测定贮存一定时间后脂 质体渗漏出来的游离药物量w.另将贮存前测定 的该批脂质体的游离药物量记为W2,由该批脂质体 贮存前的包封率,计算贮存前包封的药物量W旬. 渗漏率=[(W一W2)/wl旬]X100%. 2结果 2.1处方与工艺条件的筛选结果数据处理与结 果分析以包封率(Y.),平均透过率(Y2),皮肤表面残 留量(Y3),皮肤内滞留量(Y4)作为评价指标.数据 用SAS6.12版程序进行多元回归处理,得回归方程: ?Y1=69.89800—0.08985X3(r=0.9174, F=15.95) ?Y2=71.8500—0.012388X3(r=0.8869, F=11.05) ?Y3=11.5200+0.13008X3(r=0.8621. F=8.68) ?Y4=32.15533—5.74133X1—2.67067X1 (r=0.9792,F=23.24) 方程?,?以a=0.10检验,F值均大于 F0. .03)=2.68;方程(4)以a=0.10检验F> Fo10(2-2]=4.00.按a=0.10水准认为四个方程中, Y与变量间线性关系存在.根据方程?,?,胆固 醇的量与水化时间对包封率,透过率,皮肤表面滞留 量影响不大,而搅拌速度对其有较大影响.处方设 计要求高的包封率,透过率和较低的皮肤表面残留 量,故搅拌速度应取下限值.根据方程?,搅拌速度 对皮肤内滞留量影响不大,而胆固醇的量与水化时 间在设计范围内有较大影响.要求高的皮肤内滞留 量,故胆固醇的量与水化时间取下限为好.综上,最 佳处方为:X.=1:1,X2=1,X3=200. 根据均匀设计结果,最后确定PCV脂质体最佳 制备工艺为:精密称取适量大豆磷脂,胆固醇及乳糖 溶于l0ml乙醚中,(32?2)?恒温水浴旋转蒸发至 形成薄膜.精密称取0.1gPCV,溶于1Oml60?蒸 馏水中,保持60?倒入成膜的茄形瓶中,60?恒温 水浴200drain电磁搅拌,水化1h后,静置放冷,即 得PCV脂质体. 2.2PCV脂质体的质量评价按上述方法制备的 喷昔洛韦脂质体外观圆整,部分有指纹状螺旋 (图2),平均粒径为426.8am(见图3,表6).包封率 分别为60.48%,65.26%,56.53%,平均值为(60.76? 4.23)%.以外观和渗漏率为指标考察稳定性,结果 见表7. 图2PCV脂质体透射电子显微镜照片 Fig.2TransmissionelectronmicrogramsofPCVliposomes 瓢 ____一 / /--]. 粒径(吼) 图3PCV脂质体的粒径分布图 Fig.3ParticlesizedistributionofPCVliposomes 638山东大学学报(医学版)45卷6期 表6PCV脂质体粒径分布表 粒径范围(dlnm)分布率(%) 0—96.61 96.61—160.55 160.55—266.78 266.78—443.32 443.32—736.68 736.68—1224.16 1224.16— 0 24 25 24 23 4 0 表7PCV脂质体稳定性试验结果 3讨论 由于生物膜是由脂类,蛋白质以及糖等组成的 超分子体系,其中糖蛋白及糖脂分布在生物膜的外 被上面,与膜的稳定性有关,所以在PCV脂质体的 处方中加入了乳糖,在以前的研究中,比较了加糖脂 质体与未加糖脂质体的渗漏率【4】,结果表明,储藏期 间,加糖脂质体的渗漏率明显低于未加糖脂质体,说 明糖对增加脂质体的稳定性是有作用的. 在PCV脂质体的测定中,在PCV的吸收范围 内,空白脂质体也具有明显的吸收,对PCV的测定 有干扰,故采用系数倍率法排除干扰.实验中通过 高,中,低3种不同浓度的空白脂质体对照液所做的 回收率试验结果表明,不同浓度的空白脂质体载体 对药物回收率结果均无影响. 处方与工艺条件的筛选可采用正交设计,也可 采用均匀设计,二者相比,均匀设计将考察因素的各 水平数均匀分散在实验范围内,减少了实验次数, 实验结果的多项式回归模型可用计算机处理,并通 过回归方程得出理论的最佳实验条件. 文献报道的同类药物PCV脂质体的包封率为 65%[51,本实验通过优化工艺处方,制得的PCV脂 质体的包封率约为61%,和同类药物相似. (本文中均匀设计实验的数据处理得到山东大学公共卫生学院 流行病与卫生统计学研究所的刘言训副教授的帮助,在此表示衷心 的感谢) [参考文献] [1]国家药品监督管理局标准(试行)[S].WS-105(X一093)一 2000. [2]方开泰.均匀设计极其应用(?)[J].数理统计与管理, 1994,13(3):52—55. [3]方开泰.均匀设计极其应用(?)[J].数理统计与管理, 1994,13(4):54-56. [4]吴骏,朱家壁.阿昔洛韦脂质体的制备和稳定性的初 步考察[J].药学学报,2003,38(7):552—554. [5]陈萍,张泰松.糖对喷昔洛韦脂质体稳定性的影响 [J].山东大学学报(医学版),2005,43(3):275—276. [收稿13期2006-05—16] (编辑:孙玉芝) (上接第634页) [7jReisA,MegahedM,ReinhardR,eta1.SynergismofRAD andcyclosporinAinpreventionofacuteratcornealallograft rej’eetion[J].Cornea,2002,21(1):81.84. [8]DeshpandeS,ZhengM,LeeS,eta1.Bystanderactivation involvingTlymphoeytesinherpeticstromalkeratitis[J].J Immunol,2001,167(5):2902—2910. [9]AbrahamRT,WiederrechtGJ.Immunopharmacologyofrapa— mycin[J].AnnaRevImmtmol,1996,14:483.510. [收稿13期2006-07.20] (编辑:孙玉芝)