分子生物学笔记完全版

分子生物学笔记 第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列. 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene),外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和,基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp),共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值,与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组(human genome project, HGP) 基因组学(genomics),结构基因组学(structural genomics)和功能基因组学(functional genomics)。 蛋白质组(proteome)和蛋白质组学(proteomics) 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点:, ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中. ②真核基因组中,编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3%), 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因.可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。 基因家族的特点: ①基因家族的成员可以串联排列在一起,形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes),如rRNA、tRNA和组蛋白的基因;②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上,如珠蛋白基因;③有些成员不产生有功能的基因产物,这种基因称为假基因(Pseudogene).Ψa1表示与a1相似的假基因. 四、超基因家族(Supergene family ,Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族,结构上有程度不等的同源性,但功能不同. 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1.功能相关的几个结构基因往往串联在—起,受它们上游的共同调控区控制,形成操纵子结构, 2.结构基因中没有内含子,也无重叠现象。 3.细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1.每种病毒只有一种核酸,或者DNA,或者RNA; 2.病毒核酸大小差别很大,3X103一3X106bp; 3.除逆病毒外,所有病毒基因都是单拷贝的。 4.大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA),仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成. 5.真核病毒基因有内含子,而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子. 6.有重叠基因. 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone):一类小的带有丰富正电荷<富含Lys,Arg)的核蛋白,与DNA有高亲和力. (二).端粒(telomere):真核生物线状染色体分子末端的DNA区域 端粒DNA的特点: 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb). 人的端粒DNA重复序列:TTAGGC。 1 2、端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3’端突出。 端粒的作用:防止DNA末端降解,保证染色体的稳定性和功能 (三)、复制原点 第二章DNA的复制、修复和重组 第一节DNA的复制(DNA Replication) 一、DNA复制的基本特性 1. 半保留性(Semi-Conservative) 2. 双向复制(一般) 复制起始点(origin)+两侧复制叉=复制单位(复制子, Replicon) 3.半不连续性(Semi-discontinuous) 前导链(leading strand)-连续合成,随从链(Lagging Strand)-不连续,由岗崎片段(okazaki fragment)连接而成. 二、DNA复制必需的成份(真核生物) 1.染色体DNA复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒. 2.RNA引物(RNA Primer) 一般8-14nt.带游离3'-OH末端. 3.参加DNA复制的主要酶和蛋白质 ①DNA聚合酶(DNA Polymerase) 真核DNA复制的主要酶DNA Pol a/δ. 功能:从5'-3'方向延伸与模板互补的子代链. ②引发酶(Primase)与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体(Primosome).催化RNA引物合成和复制起始. ③DNA连接酶(DNA Ligase) 催化一个双链DNA的5'磷酸与另一双链DNA的3'-OH形成磷酸二酯键. ④DNA解链酶(DNA Helicase),打开DNA双链. ⑤增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen.PCNA) 辅助催化前导链合成. ⑥端粒酶(Telomerase) 末端复制问题。 端粒酶负责染色体末端(端粒)复制,是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒复制的模板.(因此端粒是逆转录酶) 作用:维持端粒长度. 端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”(Telomerase repeat amplification protocol)法测定 端粒与细胞寿命。 端粒、端粒酶与肿瘤的关系:绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短,但也有约5%的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。 端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点. 第二节DNA修复(DNA repair) DNA修复是维持基因组完整性的重要机制,在保护基因组避免发生可能导致肿瘤或遗传疾病的突变中起关键的作用。引起DNA损伤的因素: 1、细胞内源性损伤因素: DNA复制错误;自发损伤包括碱基互变异构、碱基脱氨(C→U、A→I)和碱基丢失等;氧化代谢副产物如活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)的攻击等。 2、环境中的损伤因素: 辐射(含紫外线、X射线)产生胸腺嘧啶二聚体;化学致癌物(氧化脱氨,烷化剂或代谢活化物如苯并芘、黄曲霉素等产生碱基加合物) 一、碱基切除修复(Base excision repair、BER) 该途径中最关键的是必须通过一种糖苷酶(glycosylase)先除去变异碱基(如被氧化、烷基化或脱氨的碱基),该糖苷酶催化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解,释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点,然后由去嘌呤/去嘧啶(AP)核酸内切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等利用相对的一条正常链为模板进行修补合成。 BER是修复内源性DNA损伤(自发水解、烷基化和活性氧攻击)的主要途径,因此对于降低自发突变的频率、防止肿瘤发生有重要作用。 二、核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair,NER) 首先由多聚体复合物识别损伤,再在损伤的两侧进行切除。随着DNA链被解开,包含损伤的单链片段释放出来,留下的缺口由DNA聚合酶填补,DNA连接酶封闭。该途径包括20种以上蛋白,可以修复紫外辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和(6—4)光产物((6—4)PPs),以及一些化学物质产生的大加合物。 NER可再分为二条子途径: (1)全基因组修复(Global Genomic repair,GGR)途径:修复整个基因组内的损伤,其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。 (2)转录藕联修复(Trancsription—coupled repair,TCR,):特异地修复基因组中具有转录活性(即表达)的基因的被转录DNA链上的损伤,该途径的特点是依赖RNA聚合酶II催化的转录,其中的一些蛋白是普通转录因子TFIIH 的亚基。 三、错配修复(Mismatch repair)负责修复DNA复制过程中由于错误掺入而产生的错配。 四、重组修复(Recomhinant repair)修复DNA的两条链均受损伤的部位的双链断裂或链间交连。 第三节重组(recombination) 重组的本质是基因的重排或交换.即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间,通过断裂和重接,交换DNA片段从而改变基因的组合和序列. 一.同源重组(Homologous recombination) 指DNA同源序列间的重组,常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。可通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中. 二.转座(transposition) 可移动的DNA元件(mobile DNA elements) -转座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子内或DNA分子间转移的DNA片段. 转座元件的转移过程-转座 转座的特点: 1.转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA 复本插入到另外一个位点. 2.转座过程需要转座酶(transposase).它催化断裂和重接两步连续的过程(需要M2+) 3.转座元件插入位置的两茶有3-12bp的正向重复序列(靶序列),它是由于转座酶错位切割DNA造成的.这种短正向重复序列是存在转座元件的特征. 转座元件的分类 ①转座子(transposon):通过DNA复制而转移的转座元件. ②逆转座子(retroposon)或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件(DNA→RNA→DNA→插入新位点) 转座的遗传效应-导致基因重排、插入、缺失。 第三章基因表达的调控 基因表达:DNA→mRNA→蛋白质的遗传信息传递过程 第一节基因的活化 基因的“开关”-染色质的活化 一、活性染色质的结构 二、活性染色质的结构特点 (一)DNaseI敏感性 转录活性(或有潜在转录活性)的染色质对DNase I更敏感. (二)组蛋白H3的CyS110上巯基暴露, 三、活性染色质结构的形成 (二)、组蛋白修饰。 (三)HMG蛋白结合 HMG(high mobility group)蛋白—高迁移率蛋白, 如HMG14/HMG17. 与核小体核心颗粒结合,有利转录。 四、DNA甲基化与基因表达. (一)、真核生物基因组DNA的甲基化(Methylation) (二)DNA甲基化的转录抑制作用。 持家基因(housekeeping gene):是指对所有类型组织细胞在任何时候都需要其表达的基因,通常都是维持细胞基本生存所必须的基因,其表达常保持在固定的水平。又称为组成性基因(Constitutive gene)。 (三)甲基化与基因组印迹 基因组印迹(genomic imprinting):指基因表达活性只局限于来自双亲之一的基因版本。 被印迹(imprinted)的基因. 第二节转录水平的调控 一、真核基因转录基本条件: 特异性基因转录的基本条件包括: ①启动子(特别是核心启动子) ②转录模板(转录起始点(+1)---终止点) ③RNA PolⅡ ④普通转录因子(GTFs) (一)启动子(promoter) 与基因转录启动有关的一组DNA序列,一般位于RNA poII转录起始点上游100-200bp以内,其功能是决定转录的起始点和调控转录频率. 启动子区域包括核心启动子和启动子上游近侧序列: 1、核心启动子(core promoter) 是决定转录起始位置的关键序列,也是普通转录因子TFⅡD的结合位点, ①TATA盒(TATA box) 位于转录起始点上游-25~-30bp. ②起始子(initiator,Inr) Inr是与转录起始位点重叠的短的较保守序列. 注:①不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列.有的只有其中之一,有的两者都无. ②这些核心启动子的序列和它们之间的间隔多变 2、上游启动子元件(Upstream Promoter element,UPE) 位于较上游(-30一-110bp),能较强影响转录起始的频率,如CAAT 盒和GC盒.其中GC盒是转录因子SPl的结合位点。 (二)RNA聚合酶Ⅱ 负责真核生物蛋白编码基因的转录(产物mRNA),有7-10个亚基,最大亚基的羧基末端结构域(CTD)具有7个氨基酸(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser -Pro-Set)的重复序列,其中有多个磷酸化位点.CTD磷酸化对调控基因转录有重要作用. (三)基础转录因子(basal transcription factor) 真核基因转录除RNA聚合酶外还需要许多蛋白因子—转录因子参加,其中一些转录因子是RNA聚合酶Ⅱ转录起始必需的,并且可以维持基础水平的转录,因此称为基础转录因子或普通转录因子(general transcription factor) 1.RNA聚合酶II的普通转录因子(TF II) 包括TFIID,TFⅡB,TFIIF,TFIIE,TFIIH,TFIIA等. TFIID是由TATA盒结合蛋白(TATA binding protein,TBP)和8种TBP协同因子(TBP associated factor,TAF)组成的复合物,TFIID可识别和结合核心启动子(TATA盒和Inr); TFⅡB的C端与TFIID和DNA的复合物结合,N-端与TFⅡF协同作用募集RNA聚合酶II,再加上TFIIE,TFIIH形成完整的转录复合物. TFIIH有蛋白激酶活性,可使RNA Pol最大亚基CTD磷酸化,使转录起始过渡到转录延伸. TFIIA有助于TFIID与TATA盒核心启动子结合. 2、TAF的作用 TFIID中包括至少8种TBP协同因子,分子量为30—250kD,分别命名为TAFⅡ-30~250. TAFⅡ150识别起始子(1nr)序列. TAF是基因转录调控的辅助因子,它的作用是通过与多种转录调控因子(激活物或阻遏物)的转录调控结构域结合, 而介导转录激活或抑制。 二、基因转录的顺式调控元件 顺式调控元件(cis-regulating element)是指对基因表达有调控活性的DNA序列,其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因. (二)增强子(enhancer) 能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件(其核心序列常为8-12bp). 增强子的作用特点: 1.能(通过启动子)提高同一条链上的靶基因转录速率; 2.增强子对同源基因或异源基因同样有效; 3.增强子的位置可在基因5’-上游、基因内或3’下游序列中; 4.自身没有5’-或3’-方向性; 5.增强子可远离转录起始点(最多30Kb); 6.增强子一般具有组织或细胞特异性. (三)负调控元件—沉寂子 负调控元件是能抑制基因表达的序列.如沉寂子(silencer) (四)其它顺式调控元件 1.应答元件(responsive elements) 真核细胞中对某些特定的环境作出应答的基因,常具有相同的顺式元件—应答元件. 应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因子识别(又称为可诱导的顺式调控元件/反式作用因子)。 2.转座元件对基因表达的调控,。 三、基因转录的反式作用因子 转录水平的调控主要是通过与多种DNA元件结合的蛋白因子来实现. 反式作用因子(trans-acting factor)是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而调控靶基因转录效率的一组蛋白质.反式作用因子对基因表达的调控可正(激话)可负(阻遏). 第三节转录后加工 在细胞核内对基因产物(mRNA前体)进行各种修饰、剪接和编辑,使编码蛋白质的外显子部分连接成为一个连续的开放读框(open reading frame,ORF)的过程称为转录后加工. 一、mRNA前体加工的分子机制- 核内mRNA前体—异质性核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA), hnRNA与蛋白质结合形成核异质性核糖核蛋白(hnRNP), mRNA前体的加工在hnRNP上进行. 选择性剪接(alternative splicing):在mRNA前体的剪接过程中,参加剪接的外显子可以不按其线性次序剪接,内含子也可以不被切除而保留,即一个外显子或内含子是否出现在成熟mRNA中是可以选择的,这种剪接方式称为选择性剪接。此外,不同的启动子或不同的poly(A)加尾位点的选择,也可看作选择性剪接. 选择性剪接的主要方式。 由来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA,并翻译出的不同蛋白质,称为同源异构体(isoform). >5%的人基因可在不同的组织或生理状态下,通过选择性剪接产生不同的蛋白质异构体,这是造成真接生物高度异质性的基础。 第四节翻译水平调控 四、翻译后修饰 1、氨基酸侧链的共价修饰:乙酰化、磷酸化、糖基化(N-、O-); 2、蛋白质前体的切割和成熟。Proprotein→protein.例:胰岛素的成熟。 五、蛋白质的分泌和胞内定位 信号肽:作为蛋白质定位信号的短肽序列,指导蛋白质运输到正确位置,定位结束后通常被特异的信号肽酶切除。 第四章原癌基因与抑癌基因 第一节概述 病毒致癌作用,病毒癌基因Viral oncogene,V-onc).。 细咆癌基因(cellular oncogene ,c-onc)或原癌基因(protoncogene) —正常细胞中与v-onc同源的基因, 抑癌基因(tumor suppressor gene):是指由于其存在和表达而抑制细胞癌变的基因。 原癌基因与抑癌基因生物学性质差异: 1.功能:抑癌基因在细胞生长中起负调节作用,抑制增殖、促进分化成熟与衰老,或引导多余细胞进入程序性细胞死亡(PCD),原癌基因的作用则相反. 2.遗传方式:原癌基因是显性的,激活后即参与促进细胞增殖和癌变过程,而抑癌基因为隐性,只有发生纯合失活时才失去抑癌功能. 3.突变的细胞类型:抑癌基因突变不仅可发生在体细胞中,也可发生在生殖系(germ 1ine)细胞中,并通过其遗传突变,而原癌基因只在体细胞中产生突变。 第二节原癌基因 原癌基因是细胞的正常基因,其表达产物对细胞的生理功能极其重要,只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时,才有可能导致细胞癌变。 一、原癌基因表达的特点: l、正常细胞中原癌基因的表达水平一般较低,而且是受生长调节的,其表达主要有三个特点:①具有分化阶段特异性; ②细胞类型特异性;③细胞周期特异性。 2、肿瘤细胞中原癌基因的表达有2个比较普遍和突出的特点: ①一些原癌基因具有高水平的表达或过度表达? ②原癌基因的表达程度和次序发生紊乱,不再具有细胞周期特异性。 3、细胞分化与原癌基因表达. 在分化过程中,与分化有关的原癌基因表达增加,而与细胞增殖有关的原癌基因表达受抑制。 二,原癌基因的结构改变与其表达激活 (一)点突变 (二)染色体易位染色体易位(translocation):是染色体的一部分因断裂脱离,并与其它染色体联结的重排过程。 (三)基因扩增即基因拷贝数增加. (四)LTR插入LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复,其中含有强启动子序列。 三、原癌基因产物的功能 大多数原癌基因编码的蛋白质都是复杂的细胞信号转导网络中的成份,在信号转导途径中有着重要的作用. 原癌基因产物可作为: 1、生长因子,如sis(PDGF-β),fgf家族(int-2,csf-1等) 2、生长因子受体(质膜):具酪氨酸蛋白激酶活性,如neu,ht,met,erbB,trk,fms,ros-1等。 3、非受体酪氨酸蛋白激酶(质膜/胞质) 如src家族:src,syn,fyn,abl,lck,ros,yes,fes,ret等. 4、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(胞质):如raf,raf-1,mos,pim-1, 5、G蛋白(质膜内侧),具GTP结合作用和GTP酶活性,如ras家族中的H-ras,K-ras,N-ras,以及mel和ral等., 6.核内DNA结合蛋白(转录因子) 如myc家族,fos家族,Jun家族,ets家族,rel,erb A(类固醇激素受体) 第三节抑癌基因 一、抑癌基因失活与杂合性丢失 抑癌基因为隐性癌基因,只有发生纯合失活时才对肿瘤形成起作用,通常的表现为抑癌基因的一个等位基因丢失,面另一个存留的等位基因发生突变(点突变、微缺失,重排等),等位基因丢失常伴有抑癌基因相邻区域的杂合性丢失(Loss of heterozygosity,LOH), LOS指肿瘤中特定染色体上某种DNA多态性标志(如RFLP,VNTR、STR或SSCP等)的等位基因片段在同一患者中由正常组织基因组中的两种变为一种,即等位基因型由杂合子变为纯合子。 LOH是肿瘤细胞中部分染色体区域缺失的表现。 二、抑癌基因产物的功能 巳知的肿瘤抑制基因及其蛋白产物功能 基因相关癌产物胞内定位作用 p53 Rb WT-1 APC DCC NF l RET VHL P16(MTS-1) WAF/CIPl BRCAl 肺癌、乳腺癌等(>51种)视网膜细胞瘤等 wilm’肿瘤结肠癌结肠癌神经纤维瘤甲状腺癌肾癌黑素瘤等(多种) 多种乳腺癌、宫颈癌等 核胞质?粘附分子GTP酶激活剂受体酪氨酸激酶转录延伸因子CDK抑制剂CDK抑制剂转录因子抑癌基因p53 人P53基因定位:17P13,11个外显子编码393个氨基酸。 p53基因突变:存在于一半以上的人肿瘤中,多为点突变,主要发生于外显子5-8,如肝癌中的249号密码子第3碱基G→T ,与黄曲霉素B1有关。 P53蛋白结构和功能: P53蛋白为核内转录因子,包括①核心区的DNA结合域;②N端转录激活域;③C端介导寡聚体化的结构域。 1、P53的中央域识别和结合一个10bp的启动子序列,可激活转录(通过N-端的反式激活域)。P53突变大多发生于中央DNA结合域。 2、P53也可结合DNA损伤时产生的单链区域。 3、P53是四聚体,寡聚化需要C-端域 4、P53激活cki p21, 后者抑制细胞周期于G1期. 5、p53 激活与负责辐身损伤的修复蛋白GADD45,维持基因组稳定性。 6、P53诱导凋亡的机制尚不清楚。 7、正常情况下p53以低水平存在,半衰期短。DNA损伤稳定P53并增加其转录活性 8、Mdm2使p53不稳定,易被降解,并能直接抑制其反式激活活性(Mdm2是癌基因) 第五章信号转导 细胞外信号通过与细胞表面的受体相互作用转变为胞内信号并在细胞内传递的过程称为信号转导(signal transduction) 跨膜信号转导过程包括: 1,胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别,受体被活化; 2,通过胞内信号转导物(蛋白激酶,第二信使等) 的相互作用传递信号; 3,信号导致效应物蛋白的活化,引发细胞应答(如激活核内转录因子,调节基因表达)。 第一节胞内信使 细胞内信使(intracellular messenger)是具有信息传递作用的一些小分子,也称为第二信使(second messengers)。一、cAMP{环磷酸腺苷) , 生成:腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP; 代谢:cAMP磷酸二酯酶水解cAMP产生5’-AMP 功能:, ①激活蛋白激酶A ②抑制蛋白磷酸酯酶 二、cGMP(环磷酸鸟苷) 生成酶:鸟苷酸环化酶 代谢酶:cGMP磷酸二酯酶 功能:①激活蛋白激酶G ②调控细胞膜离子通道 三、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)和甘油二酯(diacyglycerol, DAG) G-蛋白偶联受体激活磷脂酶Cβ生成IP3及DAG 功能: 1、IP3:开放胞内钙库,激活Ca2+途径. 2、DAD:在Ca2+和磷脂酰丝氨酸存在下,激活蛋白激酶C, 四、钙离子 细胞内钙离子主要贮存于胞内钙库(如肌细胞的肌浆网,SR)和线粒体中。 细胞质膜两铡[Ca2+]跨膜梯度:细胞外液>>胞浆 胞浆内[Ca2+]的调节一通过(质膜和钙库膜上的)钙离子通道(进入)和钙泵(出), 钙通道开放的条件: ①质膜或钙库膜去极化(可兴奋细胞); 成②IP3介导钙库膜上钙通道开放(任何细胞). 钙泵激活.线粒体钙泵的作用. Ca2+功能:与钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合形成Ca2+?CaM复合物: ①激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶,②激活Ca2+?CaM依赖蛋白激酶 钙通道阻断剂及其临床应用。 五、一氧化氮(NO) NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸 NO合成酶(NOS)分类:①神经元型(nNOS). ②内皮细胞型(ecNOS) ③诱导型(iNOS) 功能:激活乌苷酸环化酶,刺激cGMP合成。 NO的生理病理作用 第二节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶 蛋白激酶(Protein kinase,PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝/苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯(ATP的γ磷酸基转移至氧). 蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase,PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。 细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。 蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用,是细胞生命活动的调控中心。 一、信号转导过程中的蛋白激酶 {一)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr PK) 是一大类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族,参与多种信号转导过程。 1、蛋白激酶A(PKA) -cAMP依赖性蛋白激酶. PKA由两个催化亚基C和两个调节亚基R所构成 PKA参与cAMP介导的转录水平调控。 PKA的其它(下游)底物:①多种代谢相关酶②核内组蛋白和非组蛋白③膜蛋白等。 2、蛋白激酶C(PKC) -Ca2+激活的/磷脂依赖性蛋白激酶. 调节:可被Ca2+,DAG和磷脂酰丝氨酸激活.TPA(佛波酯)也可激活. PKC分子由N-端的调节区和C—端催化区(亲水的蛋白激酶结构域)所组成。 PKC有多种亚型(>12种). PKC可激活: ①受体,如EGFR,胰岛素受体,细胞因子受体等。 ②细胞骨架蛋白如Map,Tau. ②膜蛋白,如Na+-H+交换蛋白,Ca2+-ATP酶等. ④核蛋白/转录因子,起始因子等, ⑤信号转导物如鸟苷酸环化酶,Raf-1等. 3、Ca2+?钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Cam-PK) Cam-PKII是一种多功能的蛋白激酶. 4。cGMP依赖的蛋白激酶(PKG) 功能:调节胞内钙离子. 5,DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK) 调节:结合游离DNA片段后被激活, 底物:核内DNA结合蛋白和转录因子,如SPl,Fos/Jun,Myc和P53, 作用:①参与DNA修复和重组, ②通过激活TF调节基因表达; ③参与细胞周期的关卡机制(Checkpoint). 6.丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK) 调节:MAPK激酶-MAPKK(MEK)。 下游底物:核内转录因子如Myc,Jun,Ets及其它胞内蛋白. (二)酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,TPK) —特异地催化蛋白质的酪氨酸残基磷酸化, 蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞生长,分化和转化的调节中起重要作用。 1、经典的src激酶家族 原癌基因c-src蛋白产物Src是一种酪氨酸蛋白激酶,它有三个基本结构域:从C-端至N--端依次为SH1、SH2, SH3(SH=src homolog)。 SHl结构域:具酪氨酸激酶活性, SH2结构域:能识别并结合含磷酸化酪氨酸的短序列, SH结构域:通过脯氨酸和疏水性氨基酸残基与靶蛋白结合, Src家族:包括原癌基因src,yes,lyn,fyn,lck,blk,fgr,bcd和yrk编码蛋白,它们都有TPK活性.共同参与细胞转化的信号转导过程. SH2结构域在信号转导途径中的重要作用:由于含SH2结构域的信号转导分子可以识别和结合其他含磷酸化酪氨酸的蛋白,因此,通过蛋白质的酪氨酸磷酸化/去磷酸化调节可以决定信号转导分子的结合与解离,从而导致信号的开启或关闭。 2、JAK嫩酶家族 JAK(Janus kinase)激酶家族包括Jakl,Jak2,Jak3,Tyk2等, Jak激酶具有一个TPK结构域和一个激酶样结构域,它们与Src的TPk激酶结构域具有同源性,但JaK激酶没有SH2, SH3结构域; Jak激酶主要参与细胞因子的信号转导. 二、蛋白磷酸酯酶对磷酸化的调节 (一)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶 这类酶选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链,使之脱去磷酸基团并改变生物活性. 主要成员:PPl,PP2A,PP2B,PP2C,等. PP2A,催化亚基及其功能. (二)酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase) 蛋白质酪氨酸磷酸酯酶催化磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应,与相应的酪氨酸蛋白激酶共同调节蛋白质的磷酸化水平, PTPase家族可分为2类: 1、胞质型(非受体型):小的可溶性蛋白,只有一个催化结构域, 特点是合有SH2 domain,如PTPlC,,PTPlB等., 2.受体型(PTPR),是大的跨膜蛋白,特点是有2个串联的胞浆催化结构域,如白细胞共同抗原CD45, PTPlC(存在于造血细胞):N端2个串联重复的SH2结构域{识别Tyr?P,并指导蛋白与蛋白结合),C端为磷酸酯酶催化结构域。 Jak可作为PTP1C底物. PTPase基因可能是肿瘤抑制基因. 第三节细胞膜受体介导的信号转导 一、受体的分类 质膜受体和胞内受体(胞浆或核受体,如类固醇激素受体) 膜受体的分类: (一)G蛋白耦联受体家族 又称为七次胯膜受体家族,特点是具有七段跨膜的α螺旋结构,本身无酶活性,胞浆侧肽链上有磷酸化位点,受体功能受磷酸化调节。成员;肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。 (二)酪氨酸激酶受体家族 受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性,并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点,配基结合后受体形成二聚体,二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基,从而启动信号转导。 这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF,EGF,PDGF,NGF,SCF,HGF等生长因子的受体),除胰岛素受体外,这类受体均由一条肽链组成. (三)细胞因子受体家族 这类受体本身无TPK活性,但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点,在配基与受体结合后,受体发生二聚化或寡聚化,并激活Jak族蛋白酪氨酸激酶. 此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体. 细胞因子(cytokine):是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子(LIF)、抑癌素M等(但IL-8R为G蛋白藕联受体) (四)离子通道受体 与配基结合后构成离子通道,主要存在于神经突触,如乙酰胆碱(ACH),5-HT受体等。 二、G蛋白介导的信号转导。 G蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成: ①细胞膜受体;②G蛋白③效应物(effector),其中G蛋白将受体与效应物藕联. G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白,是由α、β和γ三个亚基组成的异三聚体,多,β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位Gβγ Gα亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq等,其活性可被霍乱毒素(CT)或百日咳毒素(PT)修饰。 G-蛋白介导的信号转导的机制:G-蛋白循环。 G-pr的效应物:离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等 三、RAS-MAPK信号转导途径 1、途径中的信号分子 Ras:具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白(与G-蛋白不同) Ras活性与其结合的鸟苷酸有关。 鸟苷酸交换因子(SOS) Ras?GDP Ras?GTP (失活) GTP酶激活蛋白(GAP)(激活) 接头蛋白:生长因子受体结合蛋白Grb2,通过其SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合,同时通过其SH3域与具有pro富集区的SOS结合,并通过SOS活化Ras蛋白. 2、Ras-MAPK途径: 生长因子→生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)→含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)→鸟苷酸交换因子SOS→Ras-GTP→Rafl→MAPKK(MEK)→MAPK→转录因子→调节基因表达。 3.Ras-MAPK途径的调节 ①Ras-MAPK途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变. ②其他信号转导途径的影响 cAMP-PKA:抑制Raf-1;PKC:活化Raf~l, 四、Jak-stat途径: STAT:信号转导物与转录激活剂(signal transducer and activators of transcription) 至少6种,分子量84-113KD,含一个SH2结构域(羧端),一个SH3样结构域,并合有DNA结合域,Stat的激活依赖通过磷酸化形成二聚体. Jak-Stat途径: 细胞因子→受体(二聚体化)→Jak→Stat→Stat二聚体(活化)→易位至核,影响转录.? 第六章细胞周期及其调节 细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期. 第一节细胞周期 一、细胞周期(cell cycle):指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程,这个过程所需的时间称为细胞周期时间。 细胞周期由G1、S、G2和M期组成(G1、S和G2期又合称为分裂间期)。 G1(Gap1)期:DNA合成前期(复制前期),从上次有丝分裂完成到DNA复制之前的阶段; S期:DNA复制期; G2期:合成后期,从DNA复制完成至有丝分裂开始; M期:有丝分裂(Mitosis)期,包括核分裂和胞质分裂. M期结束后形成两个新的子细胞。 注:①不同细胞的细胞周期时间不同,一般S+G2+M期较恒定,而G1期变化较大,因而它决定了细胞周期时间的长短; ②G1期细胞有三种可能的趋向:1)进入S期(即进入细胞周期).2)处于静止期即Co期(在一定条件下可重新进入增殖周期),3)分化、衰老、凋亡。 二、细胞周期中各时相的主要生化事件 细胞周期中每期都有其特殊功能,其中S期的DNA复制和M期细胞核的有丝分裂是细胞周期中2个最关键的过程: 1、G1期:为DNA复制作准备,G1早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等,细胞通过一个限制点(restriction point, R点)后在G1后期合成DNA复制有关的蛋白和酶。 在开始合成DNA之前有一个关卡(checkpoint),检查染色体DNA是否有损伤,如有则先要进行修复。 2、S期:DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配.S期后每一染色体复制成2个染色单体? S→G2期关卡:检查DNA复制是否完成 3、G2期:为有丝分裂作准备.有RNA和非组蛋白合成。 4、M期:染色体浓缩一仿锤体形成→染色体分离并移向细胞两端→染色体解聚,形成两个新核→胞质分裂。 第二节周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节 周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs) 通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行,其活性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。 一、周期素-周期素依赖性蛋白激酶 周期素家族和周期素依赖蛋白激酶(CDK)家族. 细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK,这些cyc-CDK复合物在各不同的细胞周期过渡点起作用. 1、G1期cyc-CDK G1期表达的周期素为周期素C、D(D1、D2、D3)和E。 D族周期素主要与CDK4(以及CDK2、CDK5、CDK6)结合成活性的蛋白激酶复合物,对细胞通过R点(G0→G1过渡有重要作用。 E族周期素与CDK2形成复合物。 cycE-CDK2复合物调控G1→S过渡。 2、S期和M朔cyc-CDKs cycA-CDK2:驱动细胞通过S期. cycB-cdc2:驱动G2→M期过渡(cdc2或p34cdc2即CDKl). 二、周期素依赖性蛋白激酶抑制物 (cyclin-dependent kinase inhibitor,CKIs) CKls通过与CDKs结合而抑制激酶活性,在细胞周期中起负调控作用. CKIs一般按其分子量命名.: CKls的分类: 1、Kip/Cip家族:包括三种结构相关蛋白P21、P27、P57、特点是能结合并抑制大多数cyc-CDK复合物; P21(其它名称WAFI/CIPl等):可被P53诱导转录,P21抑制cycDl-CDK4和cycE-CDK2,参与(由于DNA损伤诱导的)P53介导的细胞周期停止。 P27参与血清去除、接触抑制和TGF-β等导致的细胞周期停止。 2、INK4蛋白家族,包括四种相关蛋P16、P15、P18、P19. 特点:INK4是cycD-CDK4和cycD-CDK6的专一性抑制剂,并与CDK单体结合。 P15可能参与TGF-β诱导的细胞周期停止于G1期,’ 三、细胞周期调节因子与肿瘤 1、cyclin和CDKs可能为原癌基因,其突变或过度表达可导致细胞转化。 2、CKI可能是广谱的肿瘤抑制基因,其失活导致CDK活性失调。 p16(MTSl)在肿瘤中突变特点及其作用。 第三节细胞周期的其它调节机制 生长因子、生长抑制因子、原癌基因(如,myc)和抑癌基因产物、蛋白质可逆磷酸化、蛋白水解等对细胞周期也有重要调节作用。 一、pRB ,? 抑癌蛋白,分子量106KD,其活性与磷峻化状态有关: G0及G1早期:pRB非磷酸化,与转录因子E2F-1结合(抑制转录) GF等→cycD-CDK4及cycE-CDK2激活→pRb磷酸化(失活)→释放E2F→DNA合成基因表达。 二、p53 抑癌蛋白(转录因子), 在细胞周期中的作用:参与细胞周期关卡-DNA损伤检查的关键蛋白(通过诱导P21转录使细胞周期停止于G1期)。 三、细胞因子对细胞周期的作用. 1.生长因子在细胞通郧点中的作用 GF→GFR→Ras-MAPK→fos/jun等基因表达→cycD-CDK4等表达→pRB磷酸化→E2F释放→进入细胞增殖周期。 2、生长抑制因子与细胞周期停止 TGF-β使细胞周期停止于G1期。 四、泛有素(Ubiquitin,Ub)介导的蛋白水解作用 周期素,周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(如P27)以及其它细胞周期调节蛋白均可通过泛有素介导的蛋白酶水解作用降解,这些按精确的时间顺序进行的蛋白水解反应在细胞周期的不同阶段起着重要的调节作用。 第七章细胞凋亡 凋亡(apoptosis), 程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD) 生理性细胞死亡。 第一节细胞凋亡概论 一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis) 凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程,凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞吞噬而不泄露胞质内容物,不会引起炎症反应。 坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程,细胞内容物的释放导致局部炎症反应。 二、凋亡的生理功能 1、维持组织稳态平衡(homeostasis),通过干细胞分裂产生新细胞的同时,选择性地除去那些损伤的或老的或多余的细胞。 2、清除不需要的免疫细胞。 3、神经元发育 4、个体发育 三、凋亡细胞的形态学和生化特征 1、细胞皱缩(shrinkage) 2、质膜出泡(blebbing) 3、染色质浓缩 4、DNA裂解:核小体DNA ladder 5、磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧 6、凋亡小体的释放 第二节凋亡的分子机制 一、细胞表面死亡受体 细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白,它们均含有一个与配基结合的胞外结构域;一个跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受体(如Fas、TNF受体)同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。 二、Bcl-2家族 对B细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2是一种抗凋亡基因,进一步研究证明它与ced-9基因同源。 1、由于8:14染色体易位所致的bcl-2过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。 2、与Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等,构成一个大的蛋白家族。 3、这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜,Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保护线粒体膜的完整性。 Bax-促进凋亡的Bcl-2家族成员: 1、与Bcl-2结合的蛋白,包括Bax、Bak、Bik 、Bid、Bim和HRK。 2、当在细胞中过度表达时促进凋亡,其杀细胞活性可被Bcl-2类蛋白拮抗。 3、抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。 4、Bax可被P53上调,这是DNA损伤时P53诱导细胞死亡的一种方式。 5、这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中,在凋亡时移动进入线粒体。 三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶 1、这是一族半胱氨酸(cysteine)催化的在天冬氨酸(aspartic acid)处裂解底物的蛋白酶(半胱天冬酶) 2、所有Caspase先以无活性的酶原(procaspase)的形式合成,其激活过程包括:①二聚体化②caspase自身序列裂解成小亚其和大亚基③除去prodomain。 3、最早发现的caspase 为IL-1β转化酶(ICE=caspase-1) 它将pro-IL-1 前体裂解成其活性形式。ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA抑制。CrmA抑制所有caspase。 4、已知该家族成员超过12个,虽然其中某些caspase参与白细胞介素的成熟,但大多数作用是激活凋亡。通过在特异性caspase裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白,而使蛋白激活或失活,从而影响凋亡。 例如: a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease which cuts the DNA into a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense. b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspases c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cleavage d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing 5、杀伤T-淋巴细胞可释放颗粒酶(granzymes)于靶细胞上而诱导凋亡:granzymes 裂解和激活caspase→诱导凋亡 6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases抑制剂,看它们是否能保护中风、心梗和器官移植中细胞免于因缺血诱导的凋亡 四、Caspases的激活 (一)死亡受体被其配基激活 1、TNF 受体与称为TRADD的蛋白结合,后者再结合FADD;Fas直接与FADD结合。 2、FADD结合caspase-8 (又称为FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性 3、活化的caspase-8激活凋亡途径.; 4、.触发激活的关键是受体的寡聚化。在Fas系统中FasL与Fas 的相互作用导致Fas 受体形成三聚体,从而激活凋亡。 5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞,也可激活细胞自身的Fas而自杀。 (二)Apaf1- caspase活化蛋白 1、Caspase-8裂解Bid 使其C-端域易位至线粒体中。 2、Bid及其它Bcl2家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。. 3、Bcl2抑制cytochrome c释放。 4、Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1结合。Apaf-1/cytochrome c经需能的寡聚化形成大的蛋白复合物(Apoptosome),后者聚集procaspase-9 5、procaspase-9经自身裂解而活化。 6、Caspase-9裂解caspase-3和其它caspases,激活凋亡的效应器期effector phase ),从而使细胞结构被破坏。 第八章基因克隆 基因克隆(gene cloning)或分子克隆,又称为重组DNA技术,是应用酶学方法,在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子,并使之在适当的宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代DNA分子的过程。克隆(clone)一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系,或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。 一个完整的基因克隆过程包括以下: 1、获得待克隆的DNA片段(基因); 2、目的基因与载体在体外连接; 3、重组DNA分子导入宿主细胞; 4、筛选、鉴定阳性重组子; 5、重组子的扩增与/或表达。 第一节重组DNA中常用的工具酶 包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等, 一、限制性内切酶的定义、命名和分类 限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 限制性核酸内切酶的来源:细菌的限制-修饰系统。 分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。 限制性核酸内切酶的命名。 二、限制性核酸内切酶的作用特点 1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称(即具有迥文结构); 2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端; 3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端;而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端,也称钝性末端。 4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点,这些酶称为同切酶,如MboI Ⅰ和Sau3A。 三、其它工具酶 参考“分子克隆”(Sambrook,J et al . molecular cloning) 第二节载体-宿主系统 一、概述 载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。 载体应具备以下条件: 1、能在适当的宿主细胞中复制; 2、具有多种限制酶的单一切点(即所谓多克隆位点)以便外源DNA插入; 3、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子; 4、载体分子较小,以便体外基因操作,同时载体DNA与宿主DNA便于分离; 5、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。 宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所,适当的宿主细胞,必须符以下条件: 1、对载体的复制和扩增没有严格的限制; 2、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA; 3、在重组DNA增殖过程中,不会对它进行修饰; 4、重组缺陷型,不会产生体内重组; 5、容易导入重组DNA分子; 6、符合重组DNA操作的安全。 二、质粒载体 质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子,能自主复制,并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等,通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在,这是筛选重组转化子的基础。 作为载体的质粒一般具有以下特点: 1、分子相对较小(3∽10kb); 2、松驰型复制; 3、具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入; 4、具有插入失活筛选标志,便于从平板上直接筛选阳性重组子; 5、质粒能携带的外源DNA片段一般较小(<15kb). 三、λ噬菌体载体 λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体,基因组约为50kb+。 线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12碱基的互补单链序列,是天然的粘性末端,称为COS位点。 λ噬菌体的生活周期:溶菌(裂解)生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑;溶源性生长。 λ噬菌体的基因组:左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因;中央片段长约12-24kb,对噬菌体为非必需区;右臂长约10kb,含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区,并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标记基因改造而成。 已构建的λ噬菌体载体分为两类: 1、置换型载体:有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点,其间的DNA片段可被外源DNA置换。这类载体适 于克隆5-20kb的外源基因片段,常用于构建基因组DNA文库。 2、插入型载体:只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载体允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如λgt 噬菌体载体。 一般将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌,这样能大大提高转染效率。 四、M13丝状噬菌体载体 M13基因组大小为6407bp,它是一种闭环的单链DNA分子,在感染细菌后呈双链复制型DNA。因此用作克隆载体的双链DNA可从细菌中分离得到。在细菌中,双链DNA复制100-200拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒,分泌到细胞外,而不裂解细菌。 在M13基因组中含507个核苷酸的非必需区,在这个区域插入外源DNA不会影响M13的繁殖和生存,现在使用的M13载体如M13Mp18等均为对此区域进行改造而获得。 M13克隆的最大问题是不能插入较大的外源DNA片段(一般<1000bp),但M13载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA互补的单链,所以最适合于制备DNA测序时用的单链模板,另外也可用于制备单链特异性DNA探针。 五、粘粒载体 粘粒(柯斯质粒)是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒,由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成,在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制,但不表达任何噬菌体的功能。 粘粒的结构特点: 1、含有抗药性标记和质粒复制起始位点; 2、一个或多个单一限制酶切位点; 3、带有λ噬菌体粘性末端; 4、分子小(4-6kb),可容纳大到40-50kb的外源DNA片段,因此适于构建真核生物基因组DNA文库。 六、酵母人工染色体载体 酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段,因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用,是染色体克隆排序的主要工具。 用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似,将DNA大片段与载体的两臂相联,然后将连接混合物转化进酵母细胞中,利用载体上的选择性标记进行筛选。 第三节目的基因的获取 一、通过建立基因文库分离靶基因 基因文库包括两类:基因组文库和cDNA文库,两种文库的建库过程不同,产生的基因结构也不同,因此应用范围也不相同。 (一)、基因组文库 是含有某种生物体(或组织、细胞)全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。 用λ噬菌体载体构建基因组文库的基本步骤: 1、准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体),用适当的限制酶消化并分离得到载体的左右两臂; 2、纯化真核细胞高分子量DNA,并用适当的限制酶部分消化; 3、分离适当大小的基因组DNA片段(20-24kb); 4、连接载体与外源DNA; 5、连接产物体外包装及感染; 6、基因组文库的扩增。 由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA克隆,因此,利用适当的筛选方法,就可以从中找出携带所需目的基因片段的重组克隆。 (二)、cDNA文库 cDNA是指以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下形成的互补DNA. 以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。 从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列(不含内含子),便于表达成蛋白质。 构建cDNA文库的主要步骤: 1、mRNA分离; 2、cDNA第一链合成; 3、cDNA第二链合成; 4、载体与cDNA的连接; 5、噬菌体的包装及转染; 6、cDNA文库的扩增和保存。 二、化学合成法制备DNA片段 主要用于一些小的DNA 片段的合成。 三、聚合酶链反应法扩增基因片段 对于已知全部或部分核苷酸序列的基因,可以通过聚合酶链反应(PCR),以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。 第四节DNA分子的体外连接 DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。 一、DNA连接酶 DNA连接酶催化两年双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。 在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA 连接酶:T4 DNA连接酶,该酶需要ATP作为辅助因子。 T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于: 1、连接具有同源互补粘性末端的DNA片段; 2、连接双链DNA分子间的平端; 3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 二、粘性末端连接 如果载体和插入片段具有相同的粘性末端,则很容易用DNA连接酶连接成环状的重组DNA分子,但是要注意当载体和插入的两个末端均为同源的粘性末端时,连接后可能出现以下问题: 1、载体自身环化,造成假阳性背景克隆,为避免此问题,可在连接前,用碱性磷酸酶将载体DNA 5’- 端去磷酸化,这样只有载体和插入片段之间才能发生连接; 2、插入片段可双向插入; 3、插入片段可多拷贝插入。 当DNA片段两端为非同源的粘性末端时,可实现定向克隆,这时的连接效率非常高,是重组中最有效、简捷的途径。 三、平端连接 平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端,这对不同DNA分子的连接十分有利。因为除了相同或不同限制酶酶切产生的平末端分子外,含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被补齐或削平,实现平端连接。 (一)、5’-突出粘性末端的补齐 限制酶降解产生的5’-端突出的粘性末端,可用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段(klenow片段)补齐。 (二)、3’-突出粘性末端的削平 含3’- 突出的粘性末端可用T4 DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性补平。 平端连接的主要问题是,它的连接效率比粘性末端低,因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度,聚乙二醇(P EG)可促进平端连接反应。 四、人工接头连接 对平端DNA片段,可借助人工合成的接头来方便连接。所谓接头是人工合成的至少8个核苷酸长的一段迥文序列。接头是平端,在磷酸化后通过T4 DNA连接酶可与大多数平端DNA连接。连接后用相应的限制性内切酶切割,可产生所需要的粘性末端。 五、利用适配子连接 适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列,它具有一个平端,可与其它DNA的平端连接,同时它还有某种限制酶的突出端,可与含互补的限制酶突出端的DNA片段连接,连接后,用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。 第五节重组DNA导入宿主菌 体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质,将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。 一、转化 指以细菌质粒为载体,将外源基因导入受体细胞的过程。转化时,细菌必须经过适当的处理使之处于感受态-即容易接受外源DNA的状态,然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。 此外还可用电穿孔法转化细菌,它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。 二、转染和感染 利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染,即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒,然后使其感染受体菌。另一种方式是转染,即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化,再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 第六节重组克隆的筛选与鉴定 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落,并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增,获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能,或表达该基因的产物。 一、抗药性标志的筛选 如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr ,转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落,这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内,该标志基因失活,通过有无抗菌素培养基对比培养,还可区分单纯载体或重组载体(含外源基因)的转化菌落。二、β-半乳糖苷酶系统筛选 很多载体都携带一段细菌的lacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸,称为α-肽,载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型,它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链,当载体与宿主细胞同时表达两个片段时,宿主细胞才有β-半乳糖苷酶活性,使特异的底物X-gal 变为兰色化合物,这就是所谓的α-互补,而重组子由于基因插入使α-肽基因失活,不能形成α-互补,在含X-gal的平板上,含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。 三、菌落快速裂解鉴定法 从平板上直接挑选菌落裂解后,直接电泳检测载体质粒大小,判断有无插入片段存在,该法适于插入片段较大的重组子初筛。 四、内切酶图谱鉴定 经初筛鉴定有重组子的菌落,小量培养后,再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割,释放出插入片断;对于可能存在双向插入的重组子,还要用内切酶消化鉴定插入的方向。 五、通过聚合酶链反应筛选重组子 一些载体的外源DNA插入位点两侧存在特定的序列,如启动子序列等,利用这些特异性序列作为引物,对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应(PCR)分析,不但可迅速扩增插入片断,判断是否阳性重组子,还可直接对插入进行DNA 序列分析。 六、菌落或噬菌斑原位杂交 它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上,再转移至另一膜上,然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交,挑选阳性菌落。该法能进行大规模操作,一次可筛选多达5x105-5x106个菌落或噬菌斑,特别适于从 基因文库中挑选目的基因。 第九章基因诊断 基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的主要技术: 1、核酸分子杂交 2、聚合酶链反应(PCR) 3、基因芯片技术 第一节核酸分子杂交技术 核酸杂交(Nucleic acid hybridization)是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下,按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。 一、核酸杂交的基本原理 DNA的变性和复性: 在一定的条件(如适当的温度、有机溶剂存在等)下,DNA的双链可解开成为单链,这一过程称为DNA的变性(Denaturatioin)。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。 Tm值是反映DNA的热稳定性的一个参数,称为DNA的熔化温度,系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。DNA的热稳定性或Tm值直接与其碱基组成特别是GC碱基对含量有关,GC碱基对含量越高,Tm值也越高。DNA的杂交即复性(Renaturation)是变性的单链DNA在一定的条件下(低于Tm的温度下)与其互补序列退火形成双链的过程,因此杂交与Tm值相关。 影响杂交的主要因素: 温度:一般在低于Tm约15至25度的温度下杂交速率最快。 盐浓度:钠离子增加杂交分子的稳定性,降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M 时,对复性速度和Tm值影响不大。 甲酰胺:有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺,DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺 硫酸葡聚糖:使杂交速率增加,但有时可能增加杂交本底。 二、核酸探针的选择和标记 核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段,它必须具有高度的特异性,并且带有某种适当的标记以便被检测。 (一)核酸探针的类型 1、克隆的DNA片段,常用cDNA探针。 2、RNA探针(Riboprobe) RNA探针的优点是特异性高;杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定,易被降解,另外其制备较困难。 3、寡核苷酸探针可用化学方法人工合成,制备较方便,但灵敏度稍差。 4、聚合酶链反应扩增产物是很好的探针来源,其优点是制备和标记相对容易。 (二)核酸标记的类型 放射性同位素目前应用最广,优点是灵敏度高,特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测,缺点是易造成放射性污染以及半衰期短,使用不便。 核酸探针标记常用的同位素有以下几种: 1、32P:其放射性强,自显影时间短,灵敏度较高,缺点是半衰期短(14.3天),放射线散射较严重,因此对分辩率有影响。 2、35S :放射性较低,半衰期长(87.1天),灵敏度较高;低散射,因此在用X-光片自显影时分辩率高,特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。 3、33P :是一种较理想的同位素,它的放射性较低,灵敏度高,分辩率好,半衰期也较长(25.4天),适用范围较 广。但价格偏高。 非同位素标记:常用地高辛或生物素系统。 优点:无放射性污染,较稳定;缺点:灵敏度、特异性稍差。 (三)核酸探针的标记 1、随机引物法(Random priming) 随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物,因此可以与任何核酸片段杂交,并作为聚合酶反应的引物。 标记酶:大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段-klenow片段。 特点:所得探针的放射性比活较高,适用于大多数杂交。 2、缺刻平移法(Nick translation0 标记酶:大肠杆菌DNaseⅠ(极微量)和DNA聚合酶Ⅰ。 用缺刻平移法制备的探针较短,较适合于原位杂交。 3、RNA探针的制备和标记 RNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高,所得产物大小均一,有较高的比活,特异适合于Northern杂交和原位杂交。 4、聚合酶链反应标记DNA探针 利用Taq DNA聚合酶和标记的dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的c双链或单链DNA探针。 5、寡核苷酸探针的标记 5’-端标记:T4多核苷酸激酶标记法,一般用于制备DNA序列分析时用的5’-标记的寡苷酸引物。 3’-端标记:末端转移酶法,32P-dNTP或ddNTP。 6、非同位素核酸探针标记:地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5’-端进行非同位素标记。 三、常用核酸杂交技术 滤膜杂交 固相杂交 核酸杂交原位杂交 液相杂交 滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上,然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。 滤膜杂交的基本过程为: 1、核酸探针的制备和标记; 2、核酸片段的凝胶电泳分离; 3、将凝胶中的核酸片段通过印迹(blot)转移到某种固相支持物上; 4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交(通过还包括预杂交); 5、洗膜(除去未杂交的游离探针等); 6、检测带标记的杂交分子(放射自显影或酶联反应)。 (一)斑点/狭缝印迹(Dot/slot blot)杂交:DNA或RNA样品经变性后直接点样于尼龙膜上,然后进行杂交和检测。其优点是简单、迅速,可同时做多个样品;缺点是特异性不好,有一定比例的假阳性,此外,靶核酸的分子大小难于判断。 (二)Southern印迹:指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。 Southern印迹杂交的步骤如下: 1、用限制性内切酶消化大分子DNA; 2、用琼脂糖凝胶电泳对DNAa片段按分子量大小分离; 3、将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后,再转移到适当的固相支持物上并与之结合; 4、探针与膜上的DNA杂交; 5、检测。 Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。 (三)Northern印迹:是指RNA经变性凝胶电泳后,将其转移到固相支持物上,以便用杂交反应检测特定的mRNA 分子的含量与大小。是基因表达研究分析的标准方法。 Nothern印迹的基本过程包括: 1、RNA的提取; 2、RNA变性电泳; 3、RNA转移和固定; 4、杂交; 5、检测。 除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外,其余基本与Southern印迹相同,关键是减少实验中的RNA酶污染。 (四)核酸杂交在基因诊断中的应用 通过核酸杂交技术,可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针,去检测未知核酸序列。因此,核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域。 1、限制性片段长度多态性(RFLP)分析 多态性(polymorphism)指基因组中特定基因座位(DNA序列)存在两种或两种以上状态(等位基因),并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于1%。 限制性片段长度多态性(RFLP)是由于DNA变异(产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点)导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。可借助southern blotting或PCR 的方法进行检测 RFLP分析与遗传病基因诊断。 人类染色体VNTR序列的RFLP分析图谱:DNA fingerprinting。 2、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性,因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交,检测点突变。 3、基因表达分析 常用Northern blotting或原位杂交分析。 第二节聚合酶链反应(PCR)技术 一、PCR的基本原理 (一)PCR的基本过程 PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。它包括下列三个基本步骤: 1、变性(Denaturation):待扩增的DNA模板加热变性成单链; 2、退火(Annealing):降低温度,使单链靶序列与寡核苷酸引物退火; 3、延伸(Extension):在适当条件下,利用DNA聚合酶使引物延伸,产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环,导致特异的靶序列的指数扩增。 PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。 (二)PCR体系中的主要成份 1、Taq DNA 聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶,具有5’-3’DNA聚合酶活性,一般有5’-3外切酶活性,有或无3’-5’外切酶活性(校对活性),无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。 PCR中Taq 酶的用量一般为0.5-2.5U,过多易造成非特异性扩增,过少可能灵敏度不够。 2、寡核苷酸引物是决定PCR扩增特异性的关键。 PCR引物时的几条原则: ①引物长度一般15-30 碱基,过短则特异性低; ②避免内部二级结构; ③G/C和A/T碱基均匀分布,G/C含量在45%-55% 之间; ④两个引物(特别是3’端)间不能发生互补,以免形成引物引物二聚体; ⑤引物的3’-端碱基一般应与模板严格配对,并且3’端为G、C或T时引发效率较高; ⑥引物的5’-端可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等) PCR中所用引物浓度一般在0.1-0.5uM太高的引物浓度易造成非特异性扩增,太低会降低合成效率。 3、MgCl2 Mg2+浓度除影响Taq酶活性外,还影响双链DNA的Tm值,因而影响PCR的特异性和扩增效率。PCR中的最适MgCl2浓度一般为1.5-2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA 等的浓度有关。 4、脱氧核苷三磷酸(dNTP)一般采用均衡的dNTP浓度,4 种dNTP各为200umol/L,dNTP可减少游离Mg2+,因此影响聚合酶活性和引物退火。 5、模板单、双链DNA,以及RNA经逆转录合成的cDNA。 PCR样品可以是粗制品,但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰Taq酶活性的抑制剂。 引物/模板的比率影响PCR的特异性。 (三)PCR循环参数 1、预变性(Initial denaturation). 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要,一般95℃加热3-5分钟。 2、引物退火(Primer annealing) 退火温度一般需要凭实验(经验)决定。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 3、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。 延伸时间随扩增片段长短而定。 4、循环中的变性步骤 循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性: 变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。 5、循环数 大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸 在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。 (四)PCR中的污染和假阳性 PCR中污染主要来自 1、样品间交叉污染; 2、先前PCR产物遗留(carry-over) 二、几种常用特殊PCR技术 (一)逆转录PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR) RNA经逆转录后可作为PCR的模板.逆转录PCR(RT-PCR)常用于基因表达研究(定量PCR)和逆病毒检测.设计RT-PCR引物时,应使引物分别位于不同的外显子中,以便区别cDNA和gDNA扩增产物。 (二)多重PCR(Multiple PCR) 在同一PCR反应体系中用多对引物(覆盖不同长度的靶序列)同时扩增。 例如用多重PCR进行DNA缺失筛选 (三) 套式PCR(nested PCR) 用第一次PCR扩增区域内部的第二对(套式)引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。(四)非对称PCR(asymmetric PCR) 在PCR反应体系中,限制引物之一的浓度(50-100:1)进行扩增,可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。 三、PCR与突变检测 通过PCR扩增片段的多态性分析有助于检测各种突变。 PCR扩增产物的多态性可分为三种类型: 1、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism-RFLP); 2、序列多态性(Sequence polymorphism); 3、长度多态性(Length polymorphism) (一)PCR-RFLP分析 设计适当的扩增引物,使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列,在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物,根据电泳后酶切片段长度变化,即可作出诊断,该方法主要用于检测各种已知突变。 (二)PCR结合ASO探针杂交分析 ASO(Allele specific oligonucleotide)探针:等位基因特异性寡核苷酸探针,指针对各种正常和突变靶序列设计的特异性寡核苷酸探针。 1、PCR产物变性后斑点印迹至膜上,用一系列AS0探针杂交,严格控制杂交和洗膜条件、确保正常ASO探针只与正常靶序列条交,而突变ASO只与含相应突变碱基的靶序列杂交。 2、另一种方法是将ASO探针固定在膜上,然后与生物素标记的PCR产物杂交-反向斑点杂交(reverse dot-blot),这样一次杂交可完成多个探针检测。 上述方法适用于基因组中某些固定位点上的已知序列差异的检测,如癌细胞中的ras突变,HLA typing等。 (三)等位基因特异性扩增(A11eles specific amplification,ASA)-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS) 利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,设计等位基因特异性PCR扩增引物,在严格的条件下,只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带,从而检测出突变,该法省去了探针杂交操作。 (四)PCR-SSCP分析 单链DNA在中性条件下,由于碱基配对等分子内相互作用而具有复杂的折叠构象,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,其迁移率除与长度有关外,还与其构象有关。DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同,变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism,SSCP),利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。 PCR一SSCP的步骤:PCR扩增→产物热变性成单链→非变性PAGE→显示(放射自显影或银染等) PCR-SSCP是检测点突变的简便灵敏方法,已用于多种遗传病、肿瘤中原癌基因和抑癌基因的突变分析,对<200bp 片段其灵敏度较好,靶序列增长时其灵敏度下降(一般175-345nt)。 (五)扩增片段长度多态性(Amp-FLP) VNTR、STR等重复序列,因重复单位数目的不同而呈现高度多态。因此利用重复序列两侧的特异性引物进行PCR 扩增,所得扩增片段具有高度多态性,这些不同长度的等位片段可用PAGE分离。 (六)PCR直接测序 DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法,它不仅可确定突变的部位,还可确定突变的性质。PCR直接测序是指对PCR产物直接进行序列分析,而不是先将DNA待测片段克隆于测序载体上,这可大大的简化操作步骤。PCR产物测序常采用循环测序法(cycle sequencing):在PCR反应体系中同时将ddNTP加入,并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增,使模板的扩增与测序同时进行。应用PCR测序有以下优点:模板需要量小;方法简便,易自动化;测序效率高。 四、PCR在基因诊断中的应用 (一)遗传病的基因诊断 目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。 .如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析,进而作出基因诊断。 (二)传染病诊断 PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定 1、病毒:如HBV,HCV,HIV,HPV等。 2、致病菌:如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等; (三)肿瘤基因诊断 1、原癌基因和抑癌基因突变,如ras,p53;癌基因扩增和表达分析。 2、利用微卫星不稳定性,直接诊断肿瘤,如膀胱癌等; 3、分析白血病(如CML)中异常染色体易位,检测微小残留病变(Minimal residual disease,MDR) 4、肿瘤多药耐药性(multi-drug resistance,MDR)检测 5、端粒酶活性检测 第三节基因芯片技术 基因芯片(Gene chip/DNA chip)又称为DNA微矩阵(DNA Microarray),是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。 一、基因芯片的类型: 1、寡核苷酸芯片:采用固相原位合成技术制备的,或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列(Genechip, Affymatrix,Inc)。 2、DNA微矩阵(DNA Microarray):将DNA探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面,然后再与靶序列杂交。 二、基因芯片技术的原理 DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物(如膜、硅片或玻璃片)上,然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交,再通过检测系统对其进行扫描,并用相应软件对信号进行比较和检测,得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。 用DNA微矩阵进行基因表达分析的步骤 1、分离(待比较的)不同组织或细胞的mRNA,逆转录法制备带不同荧光标记的cDNA探针; 2、混合探针,并与microarray杂交,洗涤除去未结合探针。 3、用特有波长的激光扫描芯片,并用共聚焦显微镜检测各探针的荧光,各element的相对荧光强度反映特异mRNA 的相对丰度。 三、基因芯片技术的应用 1、疾病诊断(遗传病、肿瘤和病原体诊断) 2、新药筛选和毒理学研究 3、突变/多态性检测 单核苷酸的多态性( single nucleotide polymorphism, SNP)。 4、基因表达分析 5、发现新基因 四、表达谱基因芯片的特点及其应用 利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析,是基因功能研究的重要手段。对来源于不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段)下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,迅速将某个或几个基因与疾病联系 起来,极大地加快这些基因功能的确立,同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点: 1、检测系统的微型化,对样品等需要量非常小 2、同时研究上万个基因的表达变化,研究效率明显提高 3、能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系,从而研究基因与基因之间内在的作用关系 4、检测基因表达变化的灵敏度高,可检测丰度相差几个数量级的表达情况 5、节约费用和时间