人芽囊原虫生物学特性——形态特征、繁殖方式及与细菌的关系研究

人芽囊原虫生物学特性——形态特征、繁殖方式及与细菌的关系研究 人芽囊原虫生物学特性——形态特征、繁殖 方式及与细菌的关系研究 第35卷第6期 2006年11月 卫生研究 JOURNALOFHYGIENERESEARCH Vo1.35No.6 Nov.20o6739 文章编号:1000—8020(2006)06—0739—04 人芽囊原虫生物学特性 形态特征,繁殖方式及与细菌的关系研究 乔继英张旭魏志超杨蹭华李亚青张荣 西安交通大学医学院环境与基因相关疾病教育部重点实验室,西安710061 ? 论着? 摘要:目的观察人芽囊原虫(Blastocystishominis,B.h)的生殖方式,对B.h与细菌的关系及相互间微 环境的影响进行初步探索.分别对新鲜粪便标本和RPMI1640培养基中B,h,经碘液染色和苏木素 染色观察其形态,对B.h阳性的粘液便,粘液血便进行肠道常见致病茵的培养和鉴定,并通过B.h与大肠 埃希菌共培养实验,观察两者相互作用.结果本研究确证了四种B.h繁殖方式:二分裂生殖,内二芽生 殖,复分裂增殖及出芽生殖.半数B.h阳性标本未检出已知肠道致病菌.B.h对大肠埃希茵有一定抑制作 用.结论B.h存在多种繁殖方式;B.h可能单独致病,其致病机制与微生态改变有关. 关键词:人芽囊原虫形态繁殖方式细菌 中图分类号:R531文献标识码:A StudyonthebiologicalcharacteristicofBlastocystishominis: morphology,modeofreproductionandtherelationtobacteria Qiaoji—ying,ZhangXu,WeiZhi—chao,YangJun—hua,eta1. KeyLaboratoryofEnvironmentandGenesRelatedtoDiseases,MinisteryofEducation,Xi'anJiaotongUniversity, Xi'an710061,China Abstract:ObjectiveToobservethereproductivemodesofBlastocystishominisandstudytherelationbetweenthis protozoaandbacteria.MethodsUsingtheIodineandHaematoxylinstaining,themorphologyofB.hfrompatientsand RPMI1640mediumwereobserved.TheB.hpositivemucousdiarrhealspecimenswereculturedandidentifiedany possibleknownpathogenicintestinalbacteria,B.handcolibacilluswereCO— culturedtoobservetheinteractionbetween them.ResultsFourmodesofreproductionforB.hwereconfirmed:binaryfission,endodyogeny,multiplefissionand budding.ThefactthattherewasnootherintestinalpathogensinhalfoftheB.hpositivespecimenssuggestedB.hmay causediseaseindependently,B.handcolibacilluswererestrainedeachother,ConclusionB.hreproductsinatleast fourmodes.B.hcouldbeapathogenanditspathogenesismayberelatedtomicro-ecologicalchanges. Keywords:Blastocystishominis,morphology,reproductivemodes,bacteria 人芽囊原虫(Blastocystishominis,B,h)是人类肠道中一种 常见的寄生原虫.最初被认为是肠道共生酵母菌等.1967年 Zierdt对其进行系统描述后,引起了寄生虫学家和临床医师 的关注.体外培养是研究其生物学特性的基础,国外B.h的 体外培养经历了经典的LES双相培养基培养,单相培养基培 养等,但培养过程多无详细描述.自对80例腹泻病人粪便 标本中发现的B.h形态进行描述后:(1)在对不同类型的 腹泻便进行观察的基础上,通过对比B.h在RPMI1640培养 基,199培养基,DMEM培养基和LES培养基中最适生长条 件.,以期建立其最佳培养体系,从而为该虫的免疫,生物 基金项目:卫生部科学研究基金资助项目(No.98.1.231) 作者简介:乔继英,女,教授 1西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系 2西安交通大学医学院医学检验中心 化学和分子生物学等研究打下基础.(2)在观察体内B.h形 态的同时,观察了体外培养中其形态特征,繁殖方式等,为研 究B.h生活史提供了依据.(3)对B.h与细菌的关系及相 互间微环境的影响进行初步探索. 1材料和方法 1.1粪便标本选择及虫株来源 59份新鲜B.h阳性粪便标本均采自西安交通大学第一 医院检验科体液标本室.选择粪便性状为粘液便或血粘液 便,淡黄色或红色,透明胶冻状,可见血丝或明显血液,粪渣少 或无.显微镜检查可见大量脓球,白细胞和红细胞.细菌少 见,可伴有霉菌.人芽囊原虫每高倍视野为2—3个,将阳性 新鲜粘液便或血粘液便,用无菌棉签蘸取少许置无菌试管中 密封,即送细菌室进行常规细菌培养.剩余粪便倒人塑料离 心管中密封后带回实验室.标本运送过程中注意保温.在载 740卫生研究第35卷 玻片上滴打口1滴粪便和I旖卢戈氏碘漓.恃染色后于血细胞 计数扳E时B.h进行计数根据实验要求汁算粪便标本用 量进行接种同时涂片固定以备其它染色 大肠埃希菌由西安交通太学医学院触生物学教研室提 供 1.2所用试剂厦药品 青霉素钠(往射用粉针剂8c)万单位批号:@203I521,哈 药集团制药总厂):碗酸链霉豢(注射俐粉针剂lO0万单位批 号:021205华北制药股份有限公司j;灭活小牛血清(200m1.批 号:030620杭州四季青生物1程材料有限公司);RPMIl640 medium(10.4g.618483,GIBCOBRI公日】){MaconkeyAgar(CM908 批号:020427中国进出口商品硷验技术研究所北京罗桥技术 有限责任公司) 1.3人芽囊原虫的体外培养 1.3.1培养摹的制备RPMIl640培养基的制备:将l袋 EPM[]640(10.4g)倒人洁净烧杯巾.用量畸鞋取100Oral双蒸 水,冲洗包装袋内面3次.于磁力搅拌器上溶解均匀.用盐酸 和氢氧化钠调整酸碱宦,经啪滤菌器除菌后于超挣工作台 内分装至具硅胶塞的容量为l6ramx100ram经高压灭菌的玻 璃试管中.每管5m1.于4?保存备用 1.3.2血清的准备及抗生素的使用将小牛清置于55, 56水浴中加热30分钟灭活后丹装为每管It3m1.冷冻备 用.青霉索钠:浓度为600mg/-的青霉素钠100IrJ即100万 IU]ml用0Im1..硫酸链霉索:浓睦为2COmg/m[的硫酸链霉素 ]00/tl即】o0万IU/6.3ml用0Im【.丹装小瓶一加?保存: L_3.3接种B.h期睦粪便标|奉嗣匀计数后.将占氧的培养 基,血清占乏抗生素等用品均置于越带1怍台中觜外线照射30 分钟后进行接种 I.4人芽囊原虫繁殖方式的观察 . h阳性粪使标奉和培养物琦可直搂经啦液染色或燎 片固定后嗣铁苏术索染色法进行染色比较B的形态结 构.观察其繁殖方式井进行数码显微摄片 I.5人芽囊原虫与细菌的关系 1.5.1人芽囊碌虫阳性粪便标奉的细蔺培荐和鉴定性 新鲜牯祧慢或血粘液便送细菌室进托常规细菌培养忭作菌种 鉴定谯经紫外线梢毒30分钟的趟净作台中,用接种爿:取 少量柯;本分刺接种于5s培养基和Mac川kev培养基中,于 37:在CO恒温培养箱中培非24小时,取{lj察看习ll蔺生K情 况.挑取光滑nJ疑菌落涂片后进衍革兰染色光镜下观察.并 根据革兰染色情况进行生化试验以鉴定 碘赣荣色H)x) 1.5.2MankcAE日培养基的制备称取55g溶于100Oral燕 慵水中.加热煮沸溶解.115qL~20分钟高压菌备用 1.5.3接种 1.5.3.1人芽囊原虫接种于RPM1I640培养基人芽囊原虫 阳性粪便标本调匀计数后.将去氧的培养摹m清及抗生索等 用品均置于越挣J:作台中紫补线照射30丹钟后进行接种.加 人抗生索和血清.每24小时去睬缸内氧后置37%温箱培养 1.5.3.2大肠埃希菌接种于RPMI1640培养基将大脑埃希 菌菌种传代至肉瀚培养基中.10倍稀释看按照I:【D比例接种 至M…arkra培养基平板中.24小时汁数平板上菌落数, "确定大肠埃希菌浓度将太肠埃希菌丹别接种于B,C两 瞥RPMI1640培荐基中 丹别于第36,9天用血细胞计数板i十数人芽囊原虫虫体 密度,同时10情稀释后用平扳活菌计数法数太厮埃希菌, 每管接种至3十平扳.取其平均值观察凡芽囊原虫的形态 和太晒埃希菌生长状况 2结果 2.1粪便标本的选择对培养的影响 在2003年7月一2004年7月问所收集柏59份帖液厦牯 液血便标丰巾.发现5—9H为高峰期.分别为10,8,】1,7和8 例.其余月册I一3例.但不同季节所取的标本培养投果无明 显差肄标水性质多淡黄色运明腔诛妆,叮见JI】L壁或明显 血液且粪渣少.镜榆"脓球,自细胞手?虹细胞为主.蜘苗少或 无培养中发现口h以颗粒型为t(>50%-1]f.培养效果较 好.表现娘虫繁磺速度快,培养基r虫件密度太. 2.2^芽囊原虫在培养管中的生长特点 ^培养物常呈絮状于培养营底部一舒别取管底培养 物与卜清液计散观察其虫件密度臂底培荐物中通常为 IO{3O6000/ml,而】'清液中倥由l00—300/ml 2.3人芽囊原虫的态,结构观察 2.3.1嚏泻患者粪便中凡芽囊原虫态通廿在粘液血恒 下的观察.空泡型可种形式.一种为中灾体(叶1央空泡)占 据整十细胞在秘,儿下舒辨不出细胞浆.棱多缺无(lA); 一 种纲咆具典型的r央体技清蜥的』J午形胞浆.胞浆内含有 校.核多3—51,c目IBD)颗粒型虫伴较空泡型少见中 兜充满细牡样物质,其问敖在分布着较太的1幂染颗粒【图 Ic)阿米巴特点虫体伸伪足.冉运动功能.胞浆着色 淡,内禽棱受角形或月:Ji;的拟染也体结卡旬,虫惟内未食 物池等内禽物.此型粪艇r少见 胞浆碘液坐色60()×)f矾涟色600xl悼盟圩形胞浆.I(X~O 圈l粪便中^芽囊原虫形态 Fig.1Morl~olog)"ofB.^inslt~l ?, , 一 一 第6期乔继英,等凡芽囊原虫生物学特I生:形态特征,繁殖方式驶与细菌的关系研 究74I 2.3.2RP/~I]1640培养基巾人芽囊原虫彤态HP'YllI640培养 基中可见B^的空泡型,颗粒型和阿米巴型二种形志空泡 型是培养中最常见的形志.可见虫体呈球形或椭倒形,色淡. 中央为一大宅泡外围一层纤薄fl勺壁.染色较滗的桉桁其边缘 分布,通常为2—4个,有时可无恢虫体直径2—8jJm镜枪 时,常可见成堆聚集的空泡型t捌2A)颗粒型虫体较空泡型 少见其与空泡型不同之处为染色鞍深常单独存在而不成 串聚集中央充满细颗粒样物质其问散在分布着较大的深 染颗粒(圈2B) 2.4人芽囊原虫的繁殖方式 目前为止,在腹筒病人及培养基中发现的Bh繁殖仃式 有:二分裂生殖可见哑铃形正在分裂的虫体.在母细胞中闹出 现凹蹈.细胞两端嘭出,两于细胞已具雏形,由细胞质相连.已 完成或正在完成梭物质的重新分配=内二芽生魑(隔膜生 殖)可见一个大的中央空泡.其内先分裂为2个(两空地间可 见一层膜),横跨两空泡的幢质区尚未丹开在这2个李泡旁 还有2个很小的空泡出芽生殖可见母细胞表面长出一个 指状(枝权杖)芽体,细胞膜连续完整,细咆质相连.母细胞与 芽体大小差异显着.其内均见拔物质:.新鲜粪便标本中观 察发现其中存在大量出芽生殖现象.可见在太的颗粒型虫体 一 侧轻微凸起,HT同时有2—3十凸起.凸起部分透亮,无内 容凸起运渐明显.直至形成一个李泡连在颗粒型虫体上最 后空泡从颗粒型虫率上脱离.形成单独存在的空泡【图3A c)复分裂繁殖在RPMI1640培养基中.发现r太小为空泡 型,颗粒型4—5倍的大型虫体,其内可见里泡状结构的于细 胞.子细胞上有棱此外.虫休内还可见折光性圆形体0 {读液染色600x)(碘液染色600x 围2RPMIIblll培养基中^芽囊原虫骺态 Fig.2Morpholog~ofB.^_nRPMI1640 2.5人芽囊原虫与细菌的关系 2.5.1凡芽囊蟓虫阳性的粪馊标奉中细菌的堵养情况将 . h阳性粪便标本作常规细菌培养结粜为:无致病苗I5份, 志贺菌】O份.致病性大肠埃希苗3份金黄色葡萄球菌和小 肠结脑耶尔森菌各】份 2.5.2几芽囊原虫与太呖埃希菌芪培养的生长情况B.h 和大脑埃希菌在生妊过程中均比对照组减少Bh和大肠 埃希菌共培养时虫体数量比单独培养时减少而大呖埃希菌 在共培养中的计散电鞍单拙培养?减少 3讨论 3.1人芽羹原虫标本来源的选择 在我们K期计/3.h培养过程中发现./3h培养效果取决 于粪便性状,具以下特点:?标车多为粘液便或血牯液便.通 常为淡黄色或红色.透明胶冻状,隐mL阳性或有血丝甚至可见 【『『L渣而以谈黄色粘液中走杂有血塑者培养效果较好◎镜 {盘多见大量脓球,白细咆和红细胞?当Bh以颗粒型为主 【>50%)时.培养效果较好表现为Bh繁殖速度快,培养 基中虫体密度大.?镜下现察可见少量细菌,有时可伴有霉 菌孢子霉菌量少时对培养影响:大B.^对外界的适应 性较强在室内13%放置4小时_及27?放置5—6小时后培 养均成晒将人芽囊原虫同一株接种至条件相同的两营中分 别放置于"?和25:进行培养.发现37?时生长稳定,而 25时虫体密度逐渐减少,48/1,时后消失但是虫体在存活 时形态与37时无明显变化 3.2人芽囊原虫在RPMI1640中培养 窗=I性标本在接种初期呈疏辁网状或大的凝块状卿粒.为 红乜或黄色,可悬浮于培养基表面或沉于管底培养过程中 则逐渐变化.通常培养72小时靖,培养物全部沉于管底,且呈 淡黄色或灰白色致密细颗粒状.取管底培养橱与上清丹别计 数/3.h.发现培葬物中与上清中矧比具有融着优势本实验 证明.接种量2×105细胞,管,pH75,温度37%,20%小牛血 清和青霉素(10万IU),链霉素(I.6万)为h在RPMII640 培养基生长的最适条件 通过本实验证明,RPM1t640培养基制备方便,而且8 h在其内生长稳定,繁殖率高等.是Bh悻外培养长期保种 柏首选培养基;在奉次实验中采用ItPM[1640培养基在上述 实验条件下,保种可逃336天.为进一步研究冻存和复苏提 供r基础 3.3新鲜粪便殛培养基中人芽囊原虫形态比较 关于B.h的形态研究.我们曾舟{;『I报道过肠道原虫合并 感染的铁苏水寨染色下的形志站掏;Bh疆泻株经 LES培养基培养后的形志现察本扶研究观察到的新鲜粪 便标本噜】的.^株形志与上研究结果基本相符 虫体形态"空池为主.占阳性标l半的84%.颗粒型占 128任.阿米巴仪占31%,H阿米巴型日见于急眺腹 泻的病人此结果与L~lritlza的研究结果{{j同:同的是我 们RPMI1640培养基中踪可见以宅沲型,颗粒型补,电可 到似阿米巴在LESII640培养蕻培养中我们虬到了 比一般形态大4,5倍的大细胞型B^.可选8m但尚未 见到像Stenzel报道的且细胞型虫体 拒实验中发现渡血隧巾B.^直往4一I2?n1.[640培 养基巾大小范围魁2,m.1l瞻培养中为620.cII 3.4人芽囊原虫的繁殖方式 在我们对人体肠煎厦培养基}JBh的彤志研究巾发现. {}l殖方式内生}?外生性的,矬繁殖为特点.内生挫包括 二丹裂,内_二芽生殖受复分裂增殖:外削生为出芽生埴有关 禁疃方式Zien[I曾于1973在人类肠道l垃培养基巾观察到的二 分裂;1974年的无菌培养中见到的裂体增殖;此外.1988年叉 报道内芽生殖.怛强调无出芽生殖…'.我f『J在研究中发现未 曾报道过的急性枯液血便中的出芽生殖瑶象,夸虑系Bh在 』,体山寄生时的繁殖方式;出芽生殖在培养巾朱发现.可能是 凼为培养过程中由于外界因素的变化而转变了繁殖方式 当接种标本巾颗粒型为主时c>50%】,培养效果最好,这 提示颗粒型细胞可能处于繁殖阶段,在培养垃程中颗粒型滴 化为空泡型(图4)在培养中发现了太量葡萄串样大小一致 742卫生研究第35卷 的j控堆聚集宅泡型,这说明颗粒型转变为空泡型后.空泡型叉可大量繁殖为子代 空泡型 A出芽生殖 碘{燕染也.6?x) B出芽生殖 磷液染色6呻x) 图3人芽?原虫的繁殖方式 Fig.3ModeofneproduetionorB.h 3.5人芽囊原虫与细菌的美系 在宴验采集标本过程中还发现.有些Bh感染的粪便标 本中,其性状为粘液或血粘渡便时,镜下观察.常表现为除枨 球,白细胞,红细胞和^芽囊原虫.而细菌很少见研究中还 发现有些Bh阳性的粪便标本在光镜下观察不伴有细菌.而 正常粪便中应包含有肠道正常苗群,此现象难以解释.为观 察Bh是否会抑制菌群.因此采用共培养的方法对.h与 大肠埃希菌的数量变化进行了观察.共培养实验发现.^ 和大肠埃希菌在生长过程中均比对照组减少一h和大肠 埃希苗共培养时虫体数量比单独培养时减少提示日.^可 能对大肠埃希菌有一定抑制作用=虽然奉实验并不能培出确 定结果.但I】得出B.h与大晒埃希菌是有}H互作用的:邯幺 这种相互抑制作用征体内是否存在,何种情况下出现,机制姐 何,有何种意义均有待进一步噼决综上所述.本文驻只足由 h阳性粪便中细菌碱少这个现象而埘其进行了初步探讨 4参考文献 IZi~nJLCH.RudeS,BulIBSEtl圳,?lcharm~teristics0fBrf m.^mJClinlLh?.1967.48:495-5t】l c出芽生殖 碘灌染色600x 围4曩粒型转变为空泡型 【碘液染色600×) Fi.4Grln~m"form transformtnginto Imlarr0l1II 2菲继英.薛弘燮.吐尔进_笠凡芽囊琢虫形态学的观察中国寄生 虫学与寄生虫痫杂志,1998,16(2):l'4一l? 3菩嶙,乔继英.王伟,等凡芽囊原虫在RPMiI640培养基中培养 条件的优化热带医学杂志.20o6,6(2):141一l44 4乔继黄.张旭董晓慧,等人芽囊原虫的体外培养带医学杂 志,2001,1t2):l44一L47 5答堞,彝继葵.卢兆辉.等^芽囊原虫在不同培养摹中生长状况 的舰察中国病原生物掌杂志.2t306.1I2):l32一I34 6菩撵.乔继薹.}西瑞华.等人芽囊原虫在蝮泻患者中的感染状况 l艟1等殖方式.中国寄生虫病防治杂志,2004.17(1):9.J0 7张地.乔继英.董小惠,等腹泻患者盟培葬摹中凡芽囊原虫的各 期形态研究中国寄牛虫学与寄生虫病杂志.21~.13.212:116.118 8[anu~M13,C~bajMJA,vHJ.HdDescriplionofar】ivE_d m~hodtbr/s…cuh~eaml~enizationPar~tRes. I997.83:60-63 9Stenzel.BomhamP卜1..M~:I)mtgullRU】lT心nl-L…fBb~srocrs//.* ^?种inh札…IntemJPardit(Il,1991.21(7):807.gI2 0ZierdlcHm?tshomanZ~&hmg-misundemt,mdint~tihalpartite IITody,I988,4{":I5一I7 (2805.I2-30收稿) 本刊对表格和插图的要求 凡用文字能表迭的内客,尽量不用表和图同一数据不宜用囤和表重复表连.也不宜在文中重复描述表和圈的表达应科 学,明扁,简捷,具有自明性图题,表题均应有中英文对照;图,表.内容可以闸中文表示.也可完垒JH英文表示,但不宣中英文混 杂本刊采用三横线表(预线,表头线和底践),表格请用白纸写清.附于相应的正文段落之后表格桉在文中出现的先后J丽序. 用阿拉伯教字连续嫡号每十袁均应冠"简明的表题.证明性贵料最在表注内.表中使用的全部非标准缩写应在表注中说明 表中的参敷应标明量单位符号,若所有栏或太部分栏的单位相同.可将谊单位标注在表的右上角.表中的术语,特号,单位等 应与图噩文字表达所用的一致;表内数字一律用阿拉伯数字.同妻敷据小教点后的取舍位数要一致,数字为零的制敏或百分数 均写"0",采取得敷据者_,』"一"表示,未做音脚空白之,井在需要时于表下分:注明.如f值等,插囤桉在正文中出现的顿序连 续鳊号.计算机佧田井提供激光打印图样,线条应光滑,均匀,图中文字符号单位,数字用6宋提彰照片应闰像清晰,辞比鲜 明在国的背面注明目号,作音姓名厦图的上下方向.线条圈请附上作圈教据 {卫生研究》嫡辑部