药学论文-山慈姑体外抑菌活性的初步研究

药学论文-山慈姑体外抑菌活性的初步研究 作者：郭东贵 王寒 朱晓鹤 周英 目的探讨山慈姑的体外抑菌活性。方法将山慈姑提取物经大孔树脂 （D-101）分离得到4个组分A，B，C和D，用倍比稀释法测定其抑菌活性。 结果金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）对组分D有很强的敏感性，MIC?12.5 mg/ml，对组分B有中等强度的敏感性，MIC为12.5～25 mg/ml；白色念珠菌（Candida albicans，ATCC-10231）对组分B和组分D有中等强度的敏感性， MIC为12.5～25 mg/ml，大肠杆菌（Escherichia coli）对各组分的敏感性都较 低，MIC＞50 mg/ml。结论山慈姑提取物B和D对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌 具有较强的抑菌效果。 山慈姑 体外抑菌 倍比稀释法 最低抑菌浓度 山慈姑为兰科植物杜鹃兰Cremastra appendiculata(D.Don)Makino，独蒜兰Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe或云南独蒜兰Pleione yun-nanensis Rolfe的干燥假鳞茎，前者习称“毛慈姑”，后二者习称“冰球子”［1］ ，主产于贵州、四川、云南等长江以南各省区。作为传统的中药材，山慈姑始载于唐 《本草拾遗》，具有清热解毒、消肿散结的功效。本文旨在探讨山慈姑的体外抑 菌作用，为进一步开发利用山慈姑奠定基础。 1.1 材料 山慈姑由贵州信邦中药发展有限公司GAP种植基地提供。大孔 树脂（D-101，天津化学试剂公司）。 1.2 试剂 氯仿（AR，四川鸿鹤精细化工有限责任公司），醋酸乙酯（AR，四川鸿鹤精细化工有限责任公司），95％乙醇（AR，重庆川江化学试剂厂），蒸 馏水（自制），无菌水（自制）等。 1.3 菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌 （Escherichia coli）由中国微生物菌种保藏中心提供，白色念珠菌（Candida albicans）由广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。 1.4 培养基 营养肉汤固体培养基：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，琼脂 15 g，定容至1 000 ml，pH值调至7.0；沙氏固体培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂15 g，定容至1 000 ml， pH调节5.0。液体培养基组成除了不加琼脂外，与相应的固体培养基相同。 1.5 仪器 高低温恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），旋转蒸发仪 （BUCHIR-200），SHZ-D（III）循环水式真空泵（河南省巩义市予华仪器有限公 司），电子天帄（OHAUS），净化工作台（上海市纯昱科学仪器有限公司），真 空冷冻干燥机（LABCONCO），超低温冰箱(海尔)，双光束紫外可见分光光度计（北 京普析通用仪器有限公司 TU-1901）。 2.1 样品的制备 取粉碎后的山慈姑100 g，用70%乙醇浸提3次，72 h/次，合并提取液，减压浓缩至适量，依次用氯仿、醋酸乙酯萃取后，取水层减压 浓缩，浓缩液用95%乙醇溶解，过滤，滤渣以蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇为流动相，D-101为固定相得到四组分，分别减压浓缩、冷冻干燥后得组分 A（水洗脱物），B（25%乙醇洗脱物），C（50%乙醇洗脱物）和D（75%乙醇洗脱物）。 2.2 菌种培养 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌用营养肉汤培养基（组成成分 见上）活化培养，白色念珠菌采用沙氏培养基（组成成分见上）活化培养，分别 将各菌种浓度调至OD600?1［2］，备用。 2.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定取A、B、C、D四组分各100 mg溶于1 ml无菌水中使其充分溶解后，用细菌过滤器过滤，取滤液0.3 ml，用相应的液体培养基倍比稀释［3］成样品浓度分别为50，25，12.5 mg/ml和6.25 mg/ml。取稀释后的样品各300 μl，分别加入活化的菌悬液30 μl（OD600?1）后培养16 h，培养温度为：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为35?，白色念珠菌为27?。培养后分别取100 μl均匀涂布在相应的固体培养基上，在各自的温度下恒温培 养24 h，并以相应溶剂作对照，测定其最小抑菌浓度（MIC）［4］。 3.1 实验结果 山慈姑不同组分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠 菌的 MIC 结果见表1。 表1 山慈姑不同组分的最低抑菌浓度（略） 3.2 分析目前国内外尚无统一中草药对细菌的MIC，结合本实验结果， 笔者参照同类实验［5］的标准作为判断指标，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白 色念珠菌对山慈姑各组分表现出不同的敏感性： 金黄色葡萄球菌对组分A和C的敏感性较弱，MIC＞50 mg/ml；对组分B有较强的敏感性，12.5 mg/ml＜MIC?25 mg/ml；对组分D有很强的敏感性，MIC?6.25 mg/ml。 大肠杆菌对山慈姑各组分的敏感性都较弱，MIC＞50 mg/ml。 白色念珠菌对组分A和C的敏感性较弱，MIC＞50 mg/ml；对组分B和D有较强的敏感性，12.5 mg/ml＜MIC?25 mg/ml。 中药抗菌药物具有安全性高、不易引起耐药性等特点，使中药抗菌药物的研 究与开发越来越受到人们的重视。山慈姑作为中药抗菌药物之一，由于地理和气 候等条件的影响，其野生资源越来越匮乏，本实验用大孔树脂层析柱将山慈姑提 取物分段，以致病细菌和真菌为测试菌种进行研究，研究发现，山慈姑提取物中 组分B和D对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌表现出较强的抑菌活性，初步确定了 山慈姑的抗菌性能和抗菌活性的有效组分，为进一步完善其抗菌谱、寻找活性成 分以及更合理地开发利用奠定基础。 ［1］ 国家药典委员会.中国药典，?部［S］.北京:化学工业出版社,2005：23. ［2］ 李兆鹏,张 栩,徐 斌.重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达hBLyS［J］.过程工程学报,2005，5（4）：446. ［3］ 徐修礼,杨佩红,孙怡群,等.真菌药敏纸片扩散法实验与应用研究［J］.临床检验杂志,2006,24(4):278. ［4］ 陈枝岚,谢守珍.14种中草药体外抗白念珠菌作用研究［J］.医药导报,2006,25（8）:765. ［5］ 周 英,段 震,李 燕,等.花松萝的体外抑菌活性实验研究［J］.中国民族民间医药杂志,2007,87（4）:230.