胰酶水解猪血蛋白工艺条件的优化

胰酶水解猪血蛋白工艺条件的优化 江 霞，周 成，张 瑜，朱秋劲 (1.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025;2.贵州大学食品科学工程研究 中心，贵州贵阳 550025) 摘 要: 为拓展猪血蛋白利用途径，提高猪血蛋白的水解率，得到更丰富的Maillard 反应底物——小分子肽及氨基酸，采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 菠萝蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶 7 种酶，在固定条件下分别对猪 血进行水解，以水解度为指标筛选出水解度最高的酶，然后再对该酶进行从单素 试验到正交试验的水解工艺参数优化。结果显示:胰酶的水解效果最好，其最佳 的水解条件是酶加量 0.5%、水解时间 5h、温度 55?、初始 pH8.5、底物蛋白 质量分数 7%，通过一次水解，可使水解度达到 38.72%。 关键词:胰酶;猪血;酶解;水解度;Maillard 反应 Optimization of Conditions for the Hydrolysis of Porcine Blood Protein by Trypsin JIANG Xia，ZHOU Cheng，ZHANG Yu，ZHU Qiu-jin (1.College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China ; 2.Food Science and Engineering Research Center, Guizhou University, Guiyang 550025, China) Abstract: Porcine blood is a good cheap source of protein. Enzymatic hydrolysate of porcine blood protein can provide plentyof reaction substrates such as small-chain peptides and amino acids for Maillard reaction. In the present study, papain, alkalineprotease, neutral protease, bromelain, trypsin, flavourzyme and protamex were compared for their effectiveness in hydrolyzingporcine blood protein, and trypsin was found to be the most suitable enzyme for further studies due to the highest degree of hydrolysis (DH). One-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were employed to optimize process parameters for trypsin hydrolysis of porcine blood protein by. The optimal hydrolysis conditions were found to be: enzyme dosage of 0.5%,hydrolysis time of 5 h, temperature of 55 ?, pH 8.5 and substrate concentration 7%, resulting in a DH of 38.72%. Key words: trypsin;porcine blood;enzymolysis; hydrolysis degree;Maillard reaction 猪血是一种高蛋白、低脂肪、低糖且微量元素含量丰富的肉类工业副产品 [1 ]。其蛋白质含量达到 18%,2 2 % ，相当于牛肉的蛋白质含量，固有“液态 肉”之称[2 ]，且蛋白质的氨基酸组成中包含有 8 种人体必需氨基酸及婴幼儿 必需的组氨酸，其赖氨酸含量达 14% 以上。因此，猪血是一种优质而廉价的蛋 白质原料。但由于猪血中的血红蛋白不易被消化吸收、有血腥味、适口性差且带 有较深的颜色，所以，其在食品中的利用受到很大局限，废弃较多，并易造成环 境污染[ 3 ]。 由于酶技术的迅速发展，利用蛋白酶水解猪血制备血红素铁[4-6]、活性肽 [7-9]、氨基酸营养液[10]、水解蛋白[1 1]等研究越来越多，已成为拓展猪血的 1 利用途径的有效技术。经过酶水解把大分子蛋白质水解成小分子肽及氨基酸更有利于 Maillard 反应的进行，并可以提高成品营养价值，同时水解产生的多种呈味氨基酸本身对热反应香精的味感有一定作用。因此，利用酶水解猪血蛋白制备肉味香精不仅能变废为宝，且成本低廉。本实验利用多种酶水解猪血蛋白，选出水解效果最好的一种酶，并探索其最佳水解工艺，以期为后续的Maillard 反应提供参考。 1 材料与 材料与试剂 1.1 新鲜猪血:花溪屠宰场。 444木瓜蛋白酶(40×10U/g)、中性蛋白酶(20 ×10U/g)碱性蛋白酶(20 ×10 4U/g)、菠萝蛋白酶(60 × 10U/g)、胰酶(4000U/g) 广西南宁庞博生物有限公司;复合蛋白酶、风味蛋白酶 丹麦诺维信公司;其他试剂均为分析纯 。 1.2 仪器与设备 HH-S6 型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;TDL-40B 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂;85-2 数显恒温磁力搅拌器 江苏金坛市恒丰仪器制造有限公司;FA2004N 电子天平 上海民桥精密仪器有限公司;PHS-3C 酸度计 上 -7502 PC 紫外 - 可见分光光度计 上海新茂仪器海佑科仪器仪表有限公司;UV 司 。 有限公 1.3 方法 1.3.1 蛋白质含量测定 采用 GB 5009.5 —2010《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定。 1.3.2 蛋白酶活力测定 采用 Folin- 酚法[1 2]测定。 1.3.3 水解度的计算 水解度(DH)是衡量蛋白质水解程度的一个重要指标，它是指水解蛋白质时，水解断裂的肽键数占样品蛋白质中的总肽键数的百分数[1 3]。用甲醛滴定法定水解上清液中的氨基氮含量[14 ]，然后水解度按照下式计算: 1.3.4 酶解工艺流程 采集新鲜猪血?抗凝?过滤除杂?冷冻破胞备用?取样?预处理?加酶?酶解反应?终止反应?离心?水解蛋白液 具体操作:新鲜猪血按 6g/L 的柠檬酸三钠抗凝处理，再用 4 层纱布过滤除杂，取样测定血液中的蛋白质含量，其他立即冷冻破胞得原料血。在一定条件下加酶水解，水解结束后样品立即置于 95?水浴锅中灭酶5min，冷却后于 2770 ×g 条件下离心 15min，上清液即为水解蛋白液。 1.3.5 酶水解实验控制方法 前期实验:固定底物蛋白质在溶液中的质量分数为8% ，结合商品标注最适添加量设定各酶添加量梯度，按照各酶商品标注最适温度、pH 值，水解 6h。以水解度为指标结合实际生产效益得出各酶最适添加量作为后期实验的基础。从前4期实验结果中获得各酶最适添加量:木瓜蛋白酶 1×10U/g pro，碱性蛋白酶 4334×10U/g pro，中性蛋白酶 4×10U/g pro，菠萝蛋白酶 6×10U/g pro，复合 2 蛋白酶0.4%(百分比:100g蛋白质量分数 8% 的血液加入复合蛋白酶 0.4g，下同)，风味蛋白酶 2%，胰酶0.4 % 。 1.3.5.1 酶的选择 实验采用上述7 种酶，并固定底物蛋白质质量分数8% 和时间 6h，在前期实验基础上(确定各酶的最适添加量)，在各酶最适的水解条件下水解，通过水解度确定出最适酶种类。 1.3.5.2 预处理温度对水解效果的影响 固定底物蛋白质质量分数 8%、初始 pH8.5，在不经过预处理即常温以及分别在 40、50、60、80、100?预处理30min 后，固定酶添加量 0.4%，在50?水解6h。探索猪血液加酶水解前进行预处理是否对水解效果有影 响 。 1.3.5.3 水解时间对水解效果的影响 固定水解条件:底物蛋白质质量分数8%、初始pH8.5、酶添加量 0.4%、水解温度 50?，分别水解 2、4、6、8、10、12h，比较水解度随水解时间的变化情况。 1.3.5.4 水解温度对水解效果的影响 固定底物蛋白质质量分数 8%、初始 pH8.5、酶添加量 0.4%，分别在 40、45、50、55、60、65?条件下水解 4h，比较不同水解温度对水解效果的影响。 pH 值对水解效果的影响 1.3.5.5 初始 固定底物蛋白质质量分数8%，分别调节初始pH6.00、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00、10.00，固定酶添加量 0.4%，在 50?条件下水解 4h，比较不同初 pH 值对水解效果的影响。 始 1.3.5.6 酶添加量对水解效果的影响 固定底物蛋白质质量分数8%、初始pH8.00，分别添加0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1%、2% 胰酶在50?条件下水解 4h，比较不同酶添加量对水解效果的影响。 1.3.5.7 底物蛋白质质量分数对水解效果的影响 分别调节底物蛋白质质量分数 4% 、6% 、8% 、10%、12%、14%、16%，固定初始 pH8.00;酶添加量0.4%、水解温度 50?、水解时间 4h，比较不同底物蛋白质质量分数对水解效果的影响。 1.3.5.8 酶解工艺条件的优化 在单因素试验基础上，为获得猪血蛋白最佳水解工艺条件，采用 L18(37)正交表对筛选的酶进行5因素3水平正交试验优化，正交试验见表 1。 1.3.6 数据分析 数据采用Origin 软件处理和SPSS 软件分析，多重比较采用 LSD 法进行分 3 析。 2 结果与分析 2.1 猪血蛋白水解酶类筛选 固定底物蛋白质质量分数8% 和水解时间6h，在前期实验中确定出各酶最适添加量的基础上，参照商品酶标注说明，选择其最佳条件(温度、pH 值)进行猪血蛋白水解实验，图1显示了不同蛋白酶水解效果。 以水解度(DH)为考察指标，由图1可知，各酶水解猪血蛋白的强弱顺序:胰酶(38.54%),风味蛋白酶(26.41%),碱性蛋白酶(24.66%),菠萝蛋白酶(23.20%),木瓜蛋白酶(23.15%),中性蛋白酶(21.44%),复合蛋白酶(17.23%)。其中胰酶对猪血蛋白的水解效果最好，远高于其他几种蛋白酶(P , 0.05)，因此，后续实验选用胰酶作为研究材料。 2.2 胰酶水解猪血蛋白条件优化 2.2.1 预处理温度对水解效果的影响 4 图2表明常温组样品水解效果优于其他组，经过60?处理30min 效果优 ?和100?处理几分钟后血液发生凝固，蛋白质变性程度太于其他处理组，在80 大不利于水解。结果表明不经过预处理水解度会较高，因此，从经济效益等综合因素考虑，后续对水解效果影响研究中，不再设置预处理时间为考察因素。 2.2.2 水解时间对水解效果的影响 图 3 表明，随着水解时间延长，水解度呈增大趋势。在 4h 之前，水解度随着水解时间的延长增加幅度较大。水解 4h 后，随着水解时间延长，水解度增加幅度趋于缓慢。从能耗、生产周期和避免长时间水解等情况考虑，4h为合适的水解时间，水解度可达32.24%。 2.2.3 水解温度对水解效果的影响 5 图 4 表明，在 40,50?范围，温度升高水解度明显上升(P , 0.05)。50?水解效果最好，水解度达到 32.75%。在 50,55?范围内，水解度缓慢下降(P=0.45,0.05)，但水解效果较好。此后，随着温度上升，酶活性受到抑制，且 0.05)。因此，水解温度血中蛋白质变性程度加大，导致水解度急剧下降(P , 应以 50?为宜。 由图5可知，初始pH 值也是影响胰酶水解猪血蛋白的重要因素(P ,0.05)。胰酶属于偏碱性酶类，在偏酸性的环境中胰酶的水解效果远不如偏碱性甚至是强碱性环境。同时胰酶在 pH7.5,8 的范围内，水解效果变化不太明显(P=0.061 ,0.05)，且在pH8 条件下水解效果最好，水解度达到 33.87%。因此，初始 pH 值为8时较好。 2.2.5 酶加量对水解效果的影响 6 图6 表明，水解度随着酶加量的加大不断升高。在0.4% 的添加量下，水解 35.17%，在 0.4% 到 1%的添加量范围内，水解度都在 40% 范围内。度已达到 而当酶加量达到 2% 时，水解度继续上升到49.78%。所以，随着酶加量的增加，水解度会不断升高。因此，综合考虑经济效益及减少酶与酶之间的相互作用带来的影响，酶加量选择0.4%为宜。 2.2.6 底物蛋白质质量分数对水解效果的影响 图 7 表明，随着底物蛋白质质量分数增大，水解液中的氨基酸态氮呈增加趋势，但水解度会越来越低。这是因为质量分数越低，首先酶的溶解性越好;其次蛋白质含量低，酶与底物的相对接触率就越大，被水解的蛋白质就相对较多。当底物蛋白质质量分数增大，酶的利用率增大，水解液中的游离氨基酸态氮虽增多，但酶与底物的相对接触率降低，导致水解度越低。尽管底物蛋白质量分数越低，水解效果越好，但是为了达到为Maillard 反应提供物质基础，底物蛋白质质量分数选择8%为宜。 7 2.3 正交试验结果 根据表1进行L18(37)正交设计试验得表2正交试验结果。 8 如表 2 所示，最佳的试验组合为 ABCDE，水解度达33.13%，由极差分析32131 R值和表3方差分析可知，各因素对胰酶水解猪血蛋白效果均有显著影响(P,0.05)，影响程度强弱顺序为:D,A,B,C,E，即酶加量,水解时间,温度,初 i可判定最佳水解条件为 始 pH 值,底物蛋白质质量分数。同时由均值 k ABCDE。 33331 经验证，ABCDE组水解度为35.36%，ABCDE组水解度为38.72%，因此，3213133331 /水解时间5h、温度55?、初始胰酶水解猪血蛋白的最佳工艺条件是酶加0.5% pH8.5、底物蛋白质质量分数7%。 3 讨 论 本实验利用的胰酶为复合酶，内含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多种酶类，而大多数酶法水解蛋白研究均采用单纯的蛋白酶类。在探讨胰酶添加量对水解效果的影响时与其他研究结果有些区别:利用单纯的蛋白酶水解猪血蛋白时，由于蛋白酶仅作用于蛋白质，当酶添加量到一定程度，水解度增加不再明显，与本实验 室前期采用的单纯蛋白酶作用结果一致;而本项研究中多次实验验证胰酶水解猪血蛋白随着胰酶添加量的加大水解度不断上升，该现象与实验中同属复合酶—风味蛋白酶、复合蛋白酶一致。赵谋明等[15 ]在研究猪血红蛋白酶解及脱苦中以蛋白回收率(NR)为指标，采用胰酶与Protamex 复合水解猪血红蛋白亦发现一个有趣的现象，当酶添加量较低时，随着酶加量的增加，NR 随之增加，但是当加到 2.0g/kg 后，酶加量的继续增加反而导致 NR 下降。对此，他认为可能是由于在复合酶酶解体系中，当两种酶的加量达到一定程度时，酶自身的作用机率增大，从而降低了复合酶系统的活性，导致 NR降低，但研究值得进一步深入。猪血本身是一个复杂的酶体系，在没受到外界足够影响时，这个复杂的酶体系并不表现出完全的生物活性。由此可推测，当胰酶的添加量达到一定程度，导致其中的其他类型酶作用于猪血，猪血从较单一的蛋白酶相变化到多酶相的体系存在，这种多酶相体系促进了蛋白质的水解，因此，水解度不断上升。 4 结 论 通过对木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶7种酶在各自适宜条件下水解猪血蛋白的效果比较，胰酶的水 解效果远优于其他酶类。通过对预处理温度、水解时间、水解温度、初始 pH 值、酶添加量、底物蛋白质质量分数的单因素试验，获得胰酶水解猪血蛋白的条 9 件，即猪血液不经过预处理、底物蛋白质质量分数在8%、初始pH 8.00、胰酶添 加量0.4%、水解温度50?、水解时间4h为宜。通过多重因素分析比较，胰酶水 解猪血蛋白的工艺条件得以优化，调节底物蛋白质质量分数为7%、初始pH8.5、 胰酶添加量0.5%，在 55?条件下水解5h为最佳水解条件。 参考文献 : [1] 邓佳, 刘学文, 邓冕. 猪血血红蛋白酶解的优化研究[J]. 食品科技, 2007(11): 210-213. , 南庆贤. 国内外畜血研究动态[J]. 中国农业科技导报, 2003, [2] 钟耀广 3(5): 26-29. [3] 于美娟, 马美湖, 万佳蓉. 复合酶水解猪血液工艺条件的研究[J]. 食品科 技, 2003(3): 96-101. [4] 李斌, 章梁, 黄泽元. 酶解猪血制备血红素工艺的研究[J]. 生产应用, 2009, 25(6): 153-156. [5] IN M J, CHAE H J, HO N S. Process development for heme-enriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemoglobin[J]. Bioresource Technology, 2002, 84(1): 63-68. [6] LEBRUN F, DHULSTER P, GUILLOCHON D, et al. Solubility of heme in iron enriched bovine hemoglobin hydrolysates[J]. Journal heme of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(12): 5017-5025. [7] 张纯丽. 酶解猪血红蛋白制备小肽粉方法的研究[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2007. [8] PARK K J, HYUN C K Antigenotoxic effects of the peptides derived from bovineblood plasma proteins[J]. Enzyme and Microbial Technology,2002, 30: 633-638. [9] SUN Qian, SHEN Huixing, LUO Yongkang. Antioxidant activity of hydrolysates and peptide fractions derived from porcine hemoglobin[J].Food Sci Technol, 2011, 48(1): 53-60. [10] 张华山. 酶解猪血制取复合氨基酸营养液[J]. 现代科技, 2000(3): 54- 55. [11] 曹杏芝, 于佳雪, 方俊. 不同蛋白酶酶解猪血蛋白效果比较研究[J]. 安徽农业学报, 2009, 15(22): 19-20. [12] 孙君社. 酶与酶工程及其应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2006: 271- 274. [13] 檀志芬, 生庆海, 邱泉若, 等. 蛋白质水解度的测定方法[J]. 分析检 测, 2005(7): 174-178. [14] 吴谋成. 食品分析与感官评定[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2002: 78-79. [15] 赵谋明, 郭善广, 崔春, 等. 猪血血红蛋白酶解及脱苦[J]. 吉林大学 学报, 2006, 36(6): 1034-1040. 10