腘窝淋巴结实验在中药注射剂致敏原筛选中的应用_427

腘窝淋巴结实验在中药注射剂致敏原筛选中的应用_427 腘窝淋巴结实验在中药注射剂致敏原筛选中的应用 1*王宏～刘兆平 (1山东大学药学院，山东 济南250012;2山东大学新药评价中心，山东 济南250012) Application of popliteal lymph node assay in allergen screening of traditional Chinese medicine injection Wang Hong，Liu Zhaoping* 中药注射剂系指中药材经提取、纯化制成的供注入人体内的溶液、乳状液及供临床前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。可分为注射液、注射用无菌粉 [1]末和注射用浓溶液。该剂型是我国独创的新剂型，已广泛应用于危重疾病的急救及感染性、心脑血管和恶性肿瘤等疾病的治疗，是制药产业开拓未来国际市场独具优势的项目之一，存在着巨大的市场需求。但是随着中药注射剂在临床的广 [2][3]泛应用，其不良反应、尤其是过敏反应的报道逐渐增多。方勇对270例中药 [4]注射剂不良反应进行分析发现46.67%为过敏反应;唐双意调研的432例中药注射剂的不良反应中，66.2%为过敏反应。中药注射剂的不良反应既阻碍了新药开发，也制约了已有品种的临床应用, 其发展面临严峻挑战，甚至有被市场淘汰的危险。因此，中药注射剂过敏反应成为当前药物毒理学研究领域的重要课题，急需研究解决。本文就中药注射剂致敏原的筛选，尤其是腘窝淋巴结实验在筛选中的应用进行综述。 1 中药注射剂致敏原筛选的现状 1.1 中药注射剂的可能致敏原 中药注射剂成分复杂，对其致敏成分的推测有以下几种:中药注射剂本身的有效成分;动植物蛋白、多糖、鞣制等物质;制剂中添加剂、增溶剂、稳定剂等;在化学合成中产生的杂质;因药物本身的氧化、还原、分解、聚合等所形成的杂质;等等。其中大部分为小分子化合物(low molecular weight compounds，LWMCs)。 1.2 传统的过敏原筛选 目前我国SFDA发布的《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应) 研究的技术指导原则》中对静脉注射剂I型超敏反应推荐使用主动全身过敏试验(active systemic anaphylaxis，ASA)和被动皮肤过敏试验(passive cutaneous 1作者简介:王宏，女，硕士研究生，研究方向:免疫毒理学 Email:wh19860906@126.com *通讯作者:刘兆平，男，教授，硕士生导师，研究方向:免疫毒理学 anaphylaxis，PCA)进行检测，以及用于?型超敏反应评价的豚鼠最大化试验 [5-6](guinea-pig maximization test)和Buehler试验法。我们实验室对传统的PCA、ASA进行了改进，以高IgE达的BN大鼠替代Wistar大鼠为实验对象进行试验，对致敏途径、致敏次数、佐剂的使用及取血天数进行了进一步的摸索，得到 [7]了更为敏感的用于?型超敏反应检测模型。但是研究表明，ASA、PCA等试验 [8]方法主要用于大分子蛋白类抗原的检测，对于LWMCs易产生假阴性结果。而中药注射剂的潜在致敏原大部分为LWMCs，这就需要寻找一种更为灵敏、有效且适用于LWMCs检测的实验方法。腘窝淋巴结实验(popliteal lymph node assay， [9]PLNA)是目前较为可靠的筛选注射给药的LWMCs的实验方法。 2 腘窝淋巴结实验 2.1 PLNA的发展过程 腘窝淋巴结实验方法最初基于这样的假设:它具有与移植物抗宿主反应相似 [10]的机制，且能解释抗癫痫药苯妥英的部分不良反应。Gleichmann 在1981年证实了该假设，小鼠足跖部注射苯妥英确实引起了PLN重量的显著增加。由此开 [11]始了PLNA在免疫毒理学评价中的应用。后来，PLNA用于大范围地检测诱导 [12]人体产生自主免疫样反应的药物或化学物质。随着局部淋巴结实验的发展，人们又将PLNA的检测对象扩展到能够引起过敏或免疫刺激作用的小分子化合 [13-14]物上。 2.2 PLNA的解剖学基础和原理 大鼠和小鼠后肢足跖部皮下富含疏松结缔组织，提供了足够的给药空间，且鉴于腘窝淋巴结(PLN)所处的特殊解剖位置，足跖部淋巴回流都必须进入PLN，作为唯一的引流淋巴结，进入足跖部皮下的外源性物质如果扩散，将首先进入PLN，而淋巴结和脾脏等外周淋巴器官是发生免疫应答的主要场所，故PLN将 [15]是机体对足跖部注射药物发生免疫反应的第一部位。免疫毒性药物进入PLN，诱发特异性免疫应答，导致PLN肿大，重量增加;淋巴细胞增殖，细胞数量增加，进而分泌细胞因子和抗体。通过检测这些定量的PLN反应的变化可以评价药物诱导免疫应答的潜能。 2.3 PLNA的分类 [15] 到目前为止，用于实验研究的腘窝淋巴结实验模型共有5类:直接法腘窝淋巴结实验(D-PLNA)、间接法腘窝淋巴结实验(S-PLNA)、过继法腘窝淋 巴结实验(A-PLNA)、抗原腘窝淋巴结实验(RA-PLNA)和佐剂腘窝淋巴结实验(Adj-PLNA)。现具体介绍如下: 2.3.1 D-PLNA:第0天，将受试物注射于小鼠右侧后肢足跖部皮下;第7天，处死小鼠，取其两侧腘窝淋巴结，计算其重量指数(WI)和细胞指数(CI)。 WI=给药侧PLN的重量/未给药侧PLN重量 CI=给药侧PLN的细胞数/未给药侧PLN的细胞数 2.3.2 S-PLNA:选一适当途径(腹腔、静脉或皮下)将受试物注射于小鼠体内使其致敏，数星期或数月后(腘窝淋巴结恢复正常后)，第0天，将亚致敏量的受试物注射于小鼠右侧后肢足跖部皮下进行激发，第4-6天，处死小鼠，取其PLN，计算WI和CI。 2.3.3 A-PLNA:将供体小鼠预先致敏，取其脾脏制备单细胞悬液，将制备好的脾细胞悬液注射于受体小鼠后肢足跖部皮下，第二天，用亚致敏量的受试物激发。激发后的4-6天，解剖，取PLN，计算WI和CI。 2.3.4 RA-PLNA:第0天，将受试物分别与报告抗原TNP-OVA(T细胞依赖性抗原)和TNP-Ficoll(T细胞非依赖性抗原)共同注射于小鼠后肢足跖部皮下，第7天，处死小鼠，取其PLN，计算WI、CI和TNP特异性抗体形成细胞。 2.3.5 Adj-PLNA:设立两个平行实验组。第0天，将受试物和佐剂共同注射于小鼠后肢足跖部皮下，第6天，一组解剖，取PLN，计算WI和CI。第21天，另一组小鼠激发，第26天，取血测抗体水平。 2.4 PLNA的应用策略 在腘窝淋巴结现有的五种方法中，我们实验室选择D-PLNA和RA-PLNA联合应用于中药注射剂致敏原的筛选，这是因为D-PLNA操作简单，耗时较少，灵敏度高，可重复性好，且能进行剂量-效应关系的研究，适用于LWMCs免疫 [16]刺激潜能的检测。RA-PLNA可通过结合酶联免疫斑点实验检测TNP特异性抗体形成细胞的数量，对受试物的致敏机制进行研究，从而弥补D-PLNA不能研 [17]究机制的不足。 3 腘窝淋巴结实验在中药注射剂致敏原筛选中的应用 3.1 PLNA用于中药注射剂致敏原筛选的优势 到目前为止，研究者们已用PLNA筛选了130多种LWMCs(其中包括同系物)，且实验结果与临床不良反应发生率具有良好的相关性，并得到了多个实验 室的验证。因此，PLNA是一种较为可靠的用于LWMCs致敏原筛选的实验方法[18]。中药注射剂诱导超敏反应的成分主要是LWMCs，提示PLNA在中药注射剂致敏原筛选中具有很高的应用价值。 3.2 目前的工作 我们实验室在已结题的国家科技支撑计划重点课题“注射用双黄连的安全性评价研究”中利用腘窝淋巴结实验方法对注射用双黄连的致敏原进行筛选。我们 [19]先用D-PLNA检测了高、低剂量的注射用双黄连，组分精制后按药典工艺制备的注射用双黄连，新工艺制备的注射用双黄连有效成分和注射用双黄连有效单体成分(绿原酸、黄芩苷、连翘苷);对可能的致敏原高剂量的注射用双黄连和绿原酸进行RA-PLNA的实验研究，取得了良好的实验结果。此外，在现阶段承担的国家科技重大专项―中药注射剂致敏性检测关键技术的研究‖中，我们实验室将对此实验方法进一步完善，并应用于清开灵注射液和葛根素注射液的致敏原筛选工作中。 3.3 存在的问题 虽然，我们应用腘窝淋巴结实验技术对中药注射剂致敏原检测取得了初步的结果，但是，无论PLNA方法本身，还是其用于中药注射剂的检测都存在着一些问题亟待解决。例如，PLNA的反应机制不清，给药途径不是常规途径，缺乏公认的标准，以及剂量水平和溶媒种类的选择、实验周期的长短和不同PLNA适用范围方面存在一些问题。另外，中药注射剂成分复杂，引起过敏反应的物质不一定为其有效成分，而且这些成分不易分离纯化，不利于检测，等等。 总之，随着人们对药物免疫毒性机制认识的深入，检测方法灵敏度的提高，分离纯化方法的改进，PLNA技术方法在中药注射剂致敏原筛选中的应用一定会不断地完善，从而在中药注射剂的再评价工作中发挥重要的作用，为新药研发提供有力地支持。 REFERENCES: [1] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. (2010th ed.) Vol. 1. Beijing, China: People’s Medical Pub. House, 2010. [2] MO B B，JIAN W. Statistical analysis of traditional Chinese medicine injection adverse reactions[J].Central South Pharmacy(中南药学)，2003，3(4):184-184 [3] FANG Y. Analysis and prevention of 270 cases traditional Chinese medicine injection adverse reactions[J]. Chin J Misdiagn(中国误诊学杂志)，2010， 10(9):2157-2158 [4] TANG S Y，CHEN L Y，LIU T T，et al. Analysis of 432 cases of adverse reactions of traditional Chinese medicine injection，China Medical Herald(中国 医药导报), 2009，6(29):122-124 [5] State Food and Drug Administration，P.R. China. Guideline for the immunotoxicity(allergy and photoallergy) study on Chinese traditional medicine and naturally occurring drugs[S/OL].(2005) [6] State Food and Drug Administration，P.R. China. Guideline for irritation，allergy and haemolysis study on chemicals[S/OL].(2005) [7] LI Z G，QIN H D，WANG H S，et al. Sensitivity in type? hypersensitivity compared between BN rats andW istar rats， Chin J Pharm acol Toxicol (中国 药理学与毒理学杂志). 2010，24(1):30-34 [8] FDA :Guidance for Industry Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs[S].2002，1-38 [9] TUSCHL H，LANDSTEINER HT，KOVAC R. Application of the popliteal lymph node assay in immunotoxicity testing: complementation of the direct popliteal lymph node assay with flow cytometric analyses[J].Toxicology，2002， 172(1):35-48 [10] GLEICHMAN E and GLEICHMANN H. Graft-versus-host reaction:a pathogenetic principle for the development of drug allergy，autoimmunity and malignant lymphoma in non-chimeric-individuals[J]. Hypothesis. Z. Krebsforsch，1976 ，5, 91-109. [11] GLEICHMANN H. Studies on the mechanism of drug sensitization: T-cell dependent popliteal lymph node reaction to diphenylhydantoin[J]. Clin. Immunol. Immunopathol，1981，18 :203–211. [12] KAMMULLER ME，THOMAS C，DE BAKKER JM, et al. The popliteal lymph node assay in mice to screen for the immune disregulating potential of chemicals — a preliminary study[J]. Int. J. Immunopharmacol，1989，11: 293-300. [13] KRZYSTYNIAK K，KOZLOWSKA E，DESJARDINS R，et al. Different T-cell activation by streptozotocin and Freund’s adjuvant in popliteal lymph node (PLN)[J]. Int. J. Immunopharmacol，1995，17:189-196. [14] GOEBEL C，GRIEM P，SACHS B，et al. The popliteal lymph node assay in mice: screening of drugs and other chemicals for immunotoxic hazard[J]. Inflamm. Res，1996，45:85-90. [15] LфVIL M，ALBERG T，NYGAARD UC, et al.Popliteal lymph node(PLN)assay to study adjuvant effects on respiratory allergy[J].Methods，2007，41(1):72-79 [16] BLOKSMA N，KUBICHA-MURANYI M，SCHUPPE H-C，et al. Predictive immunotoxicological test systems: suitability of the popliteal lymph node assay in mice and rats[J]. Crit. Rev. Toxicol，1995，25:369–396. [17] FRIEDRICH K，DELGADO IF，SANTOS LM，et al.Assessment of sensitization potential of monoterpenes using the rat popliteal lymph node assay[J].Food Chem Toxicol，2007，45(8):1516-1522. [18] LфVIL M，HфGSETH AK，GAARDER PI，et al. Diesel exhaust particles and carbon black have adjuvant activity on the local lymph node response and systemic IgE production to ovalbumin[J].Toxicology，1997，121(2):165-178 [19] LIU Z H，CHENG F，ZHOU G Y，et al. Study on the sensitizing potential of shuanghuanlian injection using popliteal lymph node assay in C57BL/6J mice[J]. Chinese Journal of integrated traditional and western medicine(中国中西医结 合杂志)，2010,30(1):64-67