哈茨木霉突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆及其插入序列分析

哈茨木霉突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆及其插入序列 哈茨木霉突变体T-DNA插入位点侧翼序列 的克隆及其插入序列分析 i绚镰蟾2010,36(5):33—37PlantProtection 哈茨木霉突变体T-DNA插入位点侧翼序列的 克隆及其插入序列分析 黄亚丽,蒋细良.,田云龙,朱昌雄 (L河北省生物研究所,石家庄050081;2.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所,北京100081; 3.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193) 摘要利用分子生物学技术扩增T-DNA插入突变体中T-DNA侧翼未知序列是克隆突变相关基因,研究T-DNA 整合方式的基础,TAIL-PCR是扩增已知序列侧翼未知序列的有效,本研究根据哈茨木霉的基因组特点,引用 和了l2条随机AD引物,用这些引物分别与3条右边界嵌套特异引物进行组合对哈茨木霉突变子的T-DNA 侧翼未知序列进行扩增,发现不同的随机引物的扩增效率差异很大,以AD5的扩增效率最高,能扩增出80的T- DNA插入位点的侧翼序列.随机挑取哈茨木霉rr_DNA插入突变子52个,选用引物AD5对DNA插入位点的 侧翼序列进行TAIL-PCR扩增并分析扩增序列发现,在获得的42条侧翼序列中7条只含有质粒序列,33条对应着 单一的侧翼序列T-DNA,另外2条序列相同.34条T-DNA侧翼边界序列中13条保存着完整的右边界序列,21 条T-DNA边界序列存在一定程度的缺失现象,说明农杆菌转化哈茨木霉的过程中T_DNA右边界存在一定程度的 剪切.该研究的进行对明确农杆菌介导的木霉遗传转化过程中 T-DNA的整合方式具有一定意义,为研究农杆菌 转化木霉的机理奠定了实验基础.研究也精细确定了33个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研 究奠定基础. 关键词木霉;T-DNA插入突变体;TAIL-PCR;序列分析 中图分类号:Q933文献标识 码:ADOI:10.3969/j.issn.0529—1542.2010.05.007 Cloningandanalysisoftheright genomeofTrichoderma flankingsequenceofT-DNAinthe harziunmtransformants HuangYali,JiangXiliang.,TianYunlong2,ZhuChangxiongz (1.BiologicalInstituteofHebeiProvince,Shijiazhuang050081,China;2.Ins tituteofAgriculturalEnvironmentaland SustainableDevelopment,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beiji ng100081,China; 3.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection, ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China) PCR)iSaneffective AbstractThermalasymmetricinterlacedPCR(TAIL— methodforcloningtheflanking sequenceofknownsequence.Inthispaper,weused12arbitraryprimerstoamplifytheflankingsequencefrom randomlychosenmutantsandfoundthearbitraryprimerADSwastheoptimalprimerforT.harziunmT-DNA mutants.UsingAD5asarbitraryprimer,42specificfragmentsofT.harziunmgenomicDNAflankingT—DNA weresuccessfullyamplifiedfrom52mutantsrandomlyselectedfromtheT.DNAinsertionmutantlibraryofT. harziunm.Thesefragmentswerethensequencedandanalyzed.Throughthesequenceanalysisof42specifically amplifiedfragments,itwasshownthatthe33sequencesweredifferentfromeachother,only7ofwhichcon— tainedthevectorbackboneand2hadidentica1sequences.Thirteensequencesfromthe34T.harziunmgenomic DNAfragmentshadintactidenticalT-DNArightbordersequences.However,theT-DNArightborderofthe 收稿日期:2009—08-03修订日期:2009—12—06 蓦盒县:国家自然科学基金项目(30671400);”十一五”国家科技支撑项目(2006BAD08A02);国家”863”项目(2006AA10A211) *通信作者E-mail:zhucxl20@126.corn ? 34?扛扬铱2OlO other21sequenceshaddifferentnicks.ThespottedpositionsofT—DNAontheT.harziunmgenomelaidafoun— dationforfurtherfunctionalgenomicresearch.ThespottedpositionsofT—DNAinthegenomeofT.harziunm transformantsprovidedasolidbasisforfurtherfunctionalgenomicresearcho fT.harziunm. KeywordsTrichodermaharziunm;T—DNAinsertmutant;TAIL—PCR;sequenceanalysis 木霉是重要的生防真菌,可以防治包括立枯病, 黄萎病,疫病在内的多种植物病害,在植物病害生物 防治中占有极为重要的地位.迄今为止,已在世界 上30多个国家应用,但木霉制剂的田问应用效果由 于受自身和环境因素的限制还不太理想.利用功能 基因组学的方法从全基因组水平分析该菌的生防相 关基因对提高和稳定木霉的田间防效是非常必要 的.通过基因插人失活的方法获得能够覆盖全基因 组的突变体库是功能基因组学研究的基础性工作, 在真菌中农杆菌介导的转化系统(agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)因 操作方便,转化效率高及重复性好而被广泛使 用[1j.接下来从T_DNA插入突变子中克隆T_ DNA标签的侧翼序列对功能基因的研究也是至关 重要的,TAIPCR技术是克隆已知序列的侧翼未 知序列的有效方法,该方法是1995年由Liu等首创 并发展[6],利用该方法已经完成了包括拟南芥,水 稻,玉米,炭疽菌等T_DNA侧翼序列的克隆,取得 了良好的应用效果[4-5,7]. 目前木霉的分子生物学研究迅速发展,木霉T_ DNA插入突变库的构建及相关基因克隆方面的研 究也逐渐起步,为了使ATMT转化系统更好地应用 于木霉并快速准确地克隆出突变体中相关功能基 因,明确农杆菌转化木霉过程中T_DNA转移,整合 机制和整合情况是必需的,这需要进行T_DNA插 入位点侧翼序列的克隆和插人模式的分析.本研究 以本研究小组建立的哈茨木霉rr_DNA插入突变库 为材料,利用TAIPCR进行了哈茨木霉突变体 T_DNA插入侧翼序列的克隆,筛选出了针对哈茨木 霉使用的最优随机引物,并利用该引物对随机挑选 的52株突变体的T_DNA插入位点的右边界侧翼 序列进行扩增,测序及序列分析.通过对扩增产物 进行测序分析,确定了T_DNA在哈茨木霉中的插 入以单拷贝,随机插人为主,明确了T_DNA在插入 过程中存在一定程度的剪切问题,这对明确农杆菌 介导的木霉遗传转化过程中T-DNA的整合机制具 有一定意义.该方法的成功应用为进一步研究哈茨 木霉的功能基因提供了分析平台,为在分子水平深 人研究农杆菌介导的哈茨木霉转化机制奠定了 基础. 1材料与方法 1.1材料 试验用哈茨木霉突变子来自本实验室构建的哈 茨木霉Th-33的T_DNA插入突变体库;大肠杆菌 DH5a感受态细胞,购自北京博大泰克生物基因技 术有限公司;PCR产物胶回收试剂盒,购自北京全 式金生物技术有限公司.X-Gal,氨苄青霉素,异丙 基硫代一—D-半乳糖苷均购自北京博大泰克生物基 因技术有限公司.DNAMarker,TaqDNA聚合酶 购自TaKaRa公司;T载体系统pGEM-TEasy VectorSystems购自Promega公司;本试验采用的 随机引物序列AD1~AD12和特异引物SP-I,SP-2, SP一3(表1),由北京三博远志生物技术公司合成. 其中简并引物中R代表A/G,Y代表C/T,M代表 A/C,S代表C/G,W代表A/T,N代表A/C/G/T. 1.2方法 1.2.1TAIL厂PCR过程中AD引物的优化 随机挑选10个T-DNA插人突变体,利用北京 36卷第5期黄亚丽等:哈茨木霉突变体rr-DNA插入位点侧翼序列的 克隆及其插入序列分析?35? 天根生物公司的对应的碱基试剂盒进行基因组 DNA的提取,以此为第1轮TAILPCR反应模板, 分别以AD1,AD12为随机引物,以SPl,SP2,SP3 为特异引物进行TAIL-PCR反应.反应体系和反 应条件见表2,其中第2轮TAIL-PCR的DNA模 板为第1轮PCR产物的5O倍稀释液,第3轮 TAIL-PCR的DlNA模板为第2轮PCR产物的5O 倍稀释液.取第1轮,第2轮和第3轮PCR的扩 增产物2txL,进行1的琼脂糖凝胶电泳,观察 结果. 1.2.2T-DNA插入位点的侧翼序列克隆 随机挑选52个T_DNA插入突变体进行基因 组DNA的提取,以其为TAIL-PCR反应的模板,以 AD5为随机引物,按1.2.1的试验方法进行突变体 T-DNA插入侧翼序列的TAIL-PCR扩增,取第2 轮,第3轮PCR的扩增产物2/.tL,进行1的琼脂糖 凝胶电泳并对带型合理的第3轮PCR产物进行 测序. 表2TAIL-PCR的反应条件和反应体系 反应循环数薯0..?一.一扩增条件曩_l奠0孰量fL |2.0’__’-_’___—一 2.0|毫 虢5. 0一 0j. 0.3一 一 12.2.|誊---| 第l轮 94?imini95?n|||10PCRbuffel” ?0s6?黾??s2.5mmol/LdNTPs 94?;ZO?30驻nac435s--ISP-1 3mi~NNiN匀至他???2.试n|10#mol/LD牺 13_9贮2OS;68?j.5S.宰j?;3os?《譬DNA模板. 9”Ci68~C;30S|..j2.5U/p.LTaq 一一 g??毽??蘸?每毪鞋赣毫|誊30害-?.|ddH2O. 114cQsmia|I|.-|._0. 1.2.3扩增产物序列分析 用DNAman软件分析取得的测序资料:分析 T-DNA边界剪切位点. 2结果与分析 2.1哈茨木霉T-DNA插入位点右边界序列最适扩 增随机引物的筛选 利用12条随机引物与相应的右边界特异引物 组成引物对,对1O株突变子进行了TAIPCR.对 3轮TAIL-PCR产物进行1电泳观察发现,随机 引物对应的第1轮PCR扩增结果不能得到特异性 条带,第2轮和第3轮则有的出现特异条带.不同 随机引物扩增效果不同,其中随机引物AD5对哈茨 木霉T-DNA侧翼序列的扩增效率最高,达到80%, 且重复性好,杂带少;其次为AD1,AD2,扩增效率约 为5O;再次为AD3和AD4,扩增效率约为3O, 4o,而AD6一AD12对10株转化子都没有扩增出 任何合理条带(电泳图略). 2.2TAIL-PCR扩增结果分析 2.2.1哈茨木霉突变体DNA侧翼序列的 TAIL_PCR扩增 以AD5为随机引物对52株突变子的T_DNA 侧翼序列进行扩增,电泳检测显示,在52株转化子 中有45株经过3轮PCR后产物有1条(4个突变体 有2条)清晰的主扩增带,而且第3轮的条带比第2 轮略小,与两轮特异引物在T-DNA上结合位点的 序列差异相对应(电泳图略),说明扩增出的为特异 目的片段. ? 36?素敦绚镰妇2010 2.2.2哈茨木霉T_DNA侧翼序列的TAIDPCR 扩增产物序列分析 将第3轮特异条带进行测序,对测序结果分析 显示,在45个测序结果中有42个为可分析的序列, 其中7个只含有质粒序列,33个对应着单一序列, 另外2个序列相同.对单一T-DNA侧翼序列进行 了比较,发现它们之间没有同源性;该试验说明,农 杆菌介导的哈茨木霉的遗传转化过程中T-DNA的 插入主要以单拷贝,随机插入为主.另外3个不可 分析的序列中不含有SP-3引物序列和T-DNA边 界,可能是随机引物扩增的非特异带,而其带型正好 与所要求带型合适. 2.2.3T-DNA右边界序列剪切位点的精确定位 经序列分析表明,34个序列中,有25个含有 SP-3序列,T载体区域,T—DNA边界序列和相连的 侧翼基因组序列,表明这25个序列是相关突变子 T-DNA右边界的侧翼序列,另外9个T-DNA右边 界序列缺失的碱基数目超过10个,有5个序列的右 边界完全切除. 对测出的34条T-DNA右边界侧翼序列进行 分析(表3列出几种不同的剪切状况),其中13条保 存着完整的右边界序列,占总数的38;8条有1 或2个碱基的缺失;4条约有8个碱基的缺失;其余 9条序列右边界序列缺失10个以上,占总测序条数 的26左右.这表明在农杆菌介导哈茨木霉转化 的过程中其右边界存在不同程度的剪切现象,这种 现象对T-DNA右边界侧翼序列的分析带来一些 困难. 表3部分T-DNA右边界连接序列 1)着重号标注的序列为T_DNA右边界序列,*代表完全没有右边界 序列的碱基. 3讨论 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化技术已经 在真菌功能基因组学研究上得到了广泛的应用,木 霉作为一种重要的生防菌株,其功能基因研究更是 研究人员关注的焦点.目前,研究者已经利用农杆 菌介导的遗传转化技术完成了包括瑞氏木霉l_1],哈 茨木霉_3等多种木霉属真菌的转化,对转化系统优 化,转化子性质,突变体库的构建,突变体的筛选及 相关基因克隆等进行了大量的研究,得到了一定数 量的瑞氏木霉,哈茨木霉,绿色木霉的T-DNA插入 突变体库,获得了有关纤维素酶,几丁质酶等相关基 因序列.总之,农杆菌介导的遗传转化体系在木霉 上的应用对加快木霉功能基因组学的研究具有重要 的意义.然而,对农杆菌转化过程中T-DNA插入 模式方面的相关研究还很少,这不利于农杆菌转化 系统在木霉中更为广泛和深入的应用.因此,克隆 了哈茨木霉T-DNA插入突变体的T_DNA侧翼序 列,并对克隆序列进行分析以明确T_DNA在哈茨 木霉中的插入模式具有重要意义. 稳定高效地分离T-DNA插入突变体侧翼序列 是完成该工作的关键.为了鉴定因T_DNA插人失 活的基因,研究人员通常采用热不对称交错PCR (TAIL厂PCR)技术.TAIL-PCR的基本原理是利用 目标序列的已知序列设计3个镶嵌的特异性引物 (specialprimer,简称Spl,Sp2和Sp3,约20bp),用 它们分别和1个具有较低Tm值的短的随机简并引 物(arbitrarydegenerateprime,简称AD,约14bp) 相结合,以基因组DNA作为模版,根据引物的长短 和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过3次 分级反应来扩增特异产物【8].其中随机序列的选 择是决定TAIL-PCR成功的关键因素之一,本研究 选用了12个随机引物对1O个哈茨木霉突变子T_ DNA侧翼序列进行扩增试验,发现不同引物扩增效 率存在很大的差异,其中AD5是最适引物,扩增效 率8O,而有一些引物则不具备扩增哈茨木霉T_ 36卷第5期黄亚丽等:哈茨木霉突变体T-DNA插入位点侧翼序列的 克隆及其插入序列分析?37? DNA侧翼序列的能力,所以只有采用尽可能多的引 物组合才能扩增出尽可能多的侧翼序列,然而AD 引物由于存在有限的结合位点,对一些转化子的侧 翼序列即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性 结果. T-DNA整合是在一系列毒性蛋白的作用下,将 左边界和右边界之间的T-DNA序列插入到目标基 因组上.以往对T-DNA在植物中的整合模式研究 较多,发起T-DNA在植物基因组整合过程中右边 界往往都在同一个位点剪切,而左边界具有不同程 度的剪切,然而在对T—DNA整合是否具有一定的 偏好性,一直存在争论.农杆菌介导的丝状真菌 DNA整合机制是否与植物相同还没有定论,初步研 究表明农杆菌在整合真菌时,左右边界往往也存在 不同的剪切机制,其中右边界往往都在一个位点剪 切,而左边界具有不同程度的缺刻和剪切l5.本 研究小组利用农杆菌为介导将T-DNA插入哈茨木 霉菌株基因组中,建立起T-DNA突变体库.并从 该库中随机挑选部分突变体,利用TAIL-PCR法扩 增插入位点的侧翼序列,对扩增产物进行测序分析, 分析结果发现了TDNA在木霉基因组的整合过程 中右边界存在一定程度的剪切,所测序列中38T— DNA右边界序列不存在剪切现象,剩余62的在 rr_DNA整合过程中右边界存在不同程度的剪切现 象,这与前人对炭疽菌l5],瑞氏木霉_】._T-DNA整合 过程中右边界的研究有一定的差异,这种不同是源 于菌株的差异还是由于农杆菌或者是质粒差异而引 起的有待进一步研究. 参考文献 E1]deGrootMJA,BundockP,HooykaasPJJ,eta1.Agrobac— terimtumefaciensmediatedtransformationoffilamentous fungi[J].NatureBiotechnology,1998,16:839—842. [2]CovertSF,Kapoorp,LeeMH,eta1.Agrobacteriumtume— faciensmediatedtransformationofFusariumcircinatum[J]. MycologicalResearch,2001,105:259—264. [3]黄亚丽,蒋细良,田云龙,等.根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌 遗传转化的研究[J].中国生物工程杂志,2008,28(3):38 — 43. 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