胞核胞浆蛋白制备试剂盒

胞核胞浆蛋白制备试剂盒技术咨询电话:400-607-9999胞核胞浆蛋白制备试剂盒Nuclear-CytosolExtractionKit货号:P060090一、描述本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gelshiftassay)、免疫共沉淀、WesternBlotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。二、试剂盒组份组份100TCEB-A50mLCEB-B3mLNEB20mL三、保存条件:4?四、实验条件和参数1.所有的操作都应在冰浴中进行，所有的试剂在实验前都要预冷;2.PCV:细胞离心后的体积，该体积用于估计试剂加入的量，PCV因细胞类型不同而有所差异;3.下表是细胞数、PCV和加入试剂的对应关系，根据细胞类型的不同可根据实际情况进行相应的调整。5665×10细胞数量1×105×10PCV(,l)510-2060-10025CEB-A(,l)300-50050-1001.2-1.5CEB-B(,l)3-63-65-10NEB(,l)20100五、实验步骤1.材料的获得:(1)当贴壁细胞生长到70-90,时弃去培养基，用预冷的PBS洗涤两遍，然后用1mL预冷的PBS刮下细胞转移至预冷的1.5mL微量离心管中，4?离心，800×g,5min收集细胞，用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞PCV(离心后的细胞体积);(2)若是悬浮细胞则转入合适的预冷的离心管中，800×g,5min收集细胞，用预冷的PBS重悬洗涤细胞两次，4?离心，800×g,5min收集细胞，用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞PCV;(3)如果是组织样本，将组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS洗涤两次，800×g，5min，弃上清，估计离心后的体积。注意:本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途技术咨询电话:400-607-99992.加入5倍PCV体积的CEB-A(即50-100,l的细胞加入250-500,l的CEB-A)【可选步骤:使用前每mLCEB-A加入1μlDTT，5μLPMSF(用户自配:浓度100mM，溶于异丙醇)，5μL蛋白酶抑制剂】，涡旋混合仪剧烈振荡30s，放置冰上10,15min，并每隔5分钟在漩涡混合仪上振荡15秒;3.加入1/20体积的CEB-B，涡旋混合仪振荡10秒，放置冰上1min(此步可选:此步适宜于制备高纯度的核蛋白，但该步可能使少量的膜蛋白出现在胞浆蛋白中);4.1000g4?离心5分钟，沉淀即是核粗提物，上清则是胞浆蛋白;5.尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，12000g4?离心取上清，即得胞质蛋白，加入20,的甘油于-20?或-70?保存;100μlCEB-A洗涤沉淀，1000g5min弃上清,6.用7.在离心沉淀物(细胞核)中加入100μL预冷的NEB(可选:使用前每mlNEB加入1μLDTT，5μLPMSF，5μl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上30min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15seconds;8.4?离心，12000×g,,5min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白;9.上述提取的胞质蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法)后分装并保存于-70?，避免反复冻融。说明,61.按照操作,每10个细胞可得到50-75μg蛋白，2.该实验中裂解的时间是重要的,裂解时间过短则细胞裂解不完全,导致低的蛋白产率,裂解时间长则可能导致胞浆蛋白中有核蛋白的污染，3.细胞裂解因细胞类型而异。如果细胞难以裂解则可选用第3步,或者可以使细胞通过22号针头,重复三次,使得90,以上的细胞破碎，4.在得到的核蛋白中含有25,的甘油和420mM的NaCl，5.在该试剂盒中未加入蛋白酶抑制剂,用户在使用时可自行加入,本试剂盒在不加入蛋白酶抑制剂时仍可得到高浓度的蛋白。注意:本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途