甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定

甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定 甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定 第29卷第2期 2O00年3月 卫生研究 JOURNALOFHYG1ENERESEARCH VoI_29No.2 Mar200069 文章编号:1000—8020(2000)02006902 '7甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定 摘要:为了合成甲基对硫磷(M16Ofi)人工抗原,用醋酸一辞将一盐酸还原甲基对硫磷,制奋真基甲基对硫 BSA)厦中国鲎血蓝蛋白(TTH)偶磷.重氮化法使真基甲基对硫礴与牛血清白蛋白( 合,合成人工抗原 M160fi—BSA,M1605一TTH.M1605一BsA免疫新西兰免10周后,双向琼脂扩散试验扣间接ELISA检测,证明 得到丁高价且具有较好特异性的多抗血清,成功地合成丁甲基对硫磷人工抗原,曲其免疫分析方法的建立提 供丁务件. 关-词:墨苎苎! 中围分类号:R139.3 翟垫堡 T$2o7.53 惶乏 SynthesisandidentificationofmethylparathiOnartificialantigen WangGangduo,MaZhaoyang,YuTao,HeFengsheng InstituteofOccupationalMedicine.ChineseAcademyofPreventiveMedicine,Beijing1000 50,China Abstract,Inordertosynthesizetheartificialantigenmethy1parathion(M1605),methy1para thionWaSre- dutedintoamino—methy1parathionbyusingaceticacid—zincpowder— hydrochloricacid.Artificialantigens (M1605一BSAtM1605一TTH)weresynthesizedbyCOniugatingamino— methy1parathiontobovineserumalbu— min(BSA)andtachypleustdentatushemocyanin(TTH)directlyafterdiazotization.Rabbits wereilflamu nizedwithM1605一 BSAfor10weeks,andthehightiterandhighspecificityantJ.~erumfromthoserabbitsWaS testifiedbydoubteagargetdiffusionandindirectELISA.Theresultsshowedthatanartificiala ntigenwas obtainedsuccessfullyandthismadeitpossibletoestablishtheimmunoassayofM1605. KeywordstmethyIparathion,artificialantigen.antiserum 甲基对硫磷(M16o5)是常见的有机磷农药,近年来它不 仅被单独使用,还常常与氨基甲酸醇类和拟除虫菊醇类农药 混配使用口],造成环境枵染和职业危害,甚至引起急性中毒. 既往捡测多用液相色谱法,仪器昂贵,纯化费时,且需要专门 人员撮作.为探讨简便,快速,特异的免疫分析方法0],我们合 成了甲基对硫碑的人工抗原,并得到了高价多抗血清.为其免 疫分析方法的建立提供了必要的条件. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试剂甲基对硫磷为市售农药,本实验室纯化,纯度 98以上.对氧磷和甲基对氧磷均为本实验室合成,纯度大于 08.对硫磷为中外合资绿色特种化学品有限公司产品,音量 大于99.牛血清白蛋白(BSA)为Sigma产品,国内分装.中 国鲎血蓝蛋白(TTH)由军事医学科学院毒物药物研究所荣 康泰研究员惠赠.Freund氏完全和不完全佐剂为Gibco产 品.冻千卡介苗为北京生物制品研究所产品.HRP标记羊抗 兔lgG抗体购自北京中山生物技术有限公司.琼脂粉为日本 基金=哽目:国家"九五攻关基金(No.96—906—04-11) 作者简介,王刚蝽,男,博士生 生产,国内分装.其它化学试剂均为国产,分析纯. 1.1.2仪器550塑酶标仪系美国?o—Rad公司生产.96孔 酶标板为Nunc产品.冷冻干燥器系Bio—Rad公司产品. 1-1-动物新西兰纯种雌性白兔购自中国药品生物制品 鉴定所动物繁殖场.兔1I孥3个月t体重2.2,2.5kg. 1.2方法 1.2.1氨基甲基对硫磷的制备称甲基对硫礴4g溶人40ml 乙醚中t用0.1mol/L玲Na{COa溶液20ml洗涤,共3次.洗水 为黄色,弃去.在上述乙醚相中加人4Oral乙酸一浓盐酸 (9:1+V),分次加人锌粉8g,加毕升温搅拌50rain.玲却乙醚 层用25ml蒸馏水捷2次,无水硫酸钠干燥,过夜回收乙醚,得 掾黄色油状物.将此油状物溶人0.5mol/L盐酸,使pH1,2. 滤去不溶物,该溶液用己烷萃取+弃去己烷层.水层用2.5mol/ LNaOH溶液碱化,调pH至lo,11时,有橙黄色油状物析 出,再用cHc1s萃取3次,合并,用无木硫酸钠干燥过夜,减压 蒸馏,得到棕色油状物然后用硅胶GF254薄板层析(TLC)法 点样鉴定(Rf一0.32). 1.2.2人工抗原的合成称取氨基甲基对硫碑100rag,用 50ml舍2mmol盐酸的蒸馏木将其溶解,投人150mi三颈瓶 中+在冰浴中玲却,逐滴加人玲的0.1mol/L的NaN0.溶液, 直至使无色淀粉碘化钾试纸变蓝+再继续搅拌30rain后,加^ 胜 何 涛栅 童靴 榉嚣 咽 卫生研究第29卷 适量尿紊除去过量的HNO 称取BSA400rag,溶入100mlpH9的硼酸盐酸缓冲藏中, 加入上述三颈瓶,冰浴里搅拌2h,反应藏逐渐呈棕红色透明 状,即得到人工抗原粗品.将其反应藏置蒸馏水中透析5d,透 析产物经冷冻,干燥得橡黄色片状物,即为M1605一BSA^工 抗原,置干燥器内低温保存. 用同样的方法制备M1605一TTH人工抗原,作为ELISA 方法检测时的包被抗原. 通过检测人工抗原中磷的含量计算甲基对硫磷与载体的 结合比… 1.2.3多抗血清的制备新西兰白兔皮内注射冻干卡介苗 致敏,2周后M1605一BSA的生理盐水溶液与等容积的Freund 氏完全佐剂制成乳刺,给2只白兔背部皮下多点注射作为基础 免疫(每只兔lmgM1605一BSA).45l后同剂量的M1605?BSA 与Freund氏不完全佐荆乳化始白兔背部皮下多点注射加强 免疫,以后每2周同剂量不加Freund氏佐剂的MI605一BsA 再次加强免疫,第4扶经耳缘静脉注射免疫,2周后取血即可得 到所需要的多抗血清. 1.2.4双向琼脂扩散试验第4次免疫后10天,耳缘静脉取 血,双向琼脂扩散法检多抗血清 1.2.5多抗血清鼓价检滑I第4次免疫后2周(共免疫】0N) 间接ELISA法检测所得多抗血清的效价. 1.2.6抗体的特异性检测采用ELISA法就甲基对碗磷 甲基对氧磷,对硫磷和对氧磷对所得多抗血清进行抑制试 验],探讨该多抗血清的特异性 2结果 2.1根据人工抗原中磷的含量,计算出甲基对硫磷与载体的 结合比分别是;甲基对硫磷与BSA为(8,1O)t1,甲基对硫礴 与TTH为(630,690)t1. 2.2第4tk免疫后lO天,用所得的血清与M1605一TTH做双 向琼脂扩散试验,12h后观察到沉淀线.说明多抗血清中含有 抗半抗原甲基对硫磷的抗体. 2.3第4次免疫后2周,2只被免疫兔多抗血清的抗体滴度见 附图. 2.4EL1sA法检测甲基对硫磷甲基对氧磷对硫磷和对氧 磷对获得的多抗血清抑制情况的结果显示,当抗血清的抑制 率为5O时.甲基对硫磷为30ng,甲基对氧磷为120rig,对硫磷 为1000ng,对氧磷大于1000rig.可见多抗血清对甲基对硫磷 具有较高的特异性. 0 ll舻l06 抗体囊度 附啊2只兔免吱后多抗血iI抗体漓麈 3讨论 自从Hammok等人发现了免疫检技术可用于小分子 农药分析以后,国外已硅续开发了鼓十种农药的ELISA分析 方法].在国内,ELISA技术虽早已用于医学临床实验检测, 但在职业医学中小分子物质检测顿域尚少应用. 甲基对硫磷稳定性较差,其甲基比较活跃,在合成人工抗 原时需要应用温和的反应条件.给合成带来一定困难.本研究 中合成了甲基对碗磷的人工抗原,并用于免疫家兔得到了高 价多抗血清,且该多抗血清对半抗原甲基对硫磷具有较高的 特异性,说明我们合成的人工抗原具有较好的免疫原性.因 此,甲基对硫磷人工抗原和多克隆抗体制备的成功,为其单克 隆抗体的进一步研制,免疫分析方法的建立以及对甲基对硫 磷急性中毒的快速特异性诊断和环境,食品中残留农药的快 速检等提供了具有一定价值的研究基础和技术储备. 4参考文献 l杨东仁,何凤生,付桂平我国农药使用品种现状分析.中华劳动卫 生职业病杂志,1999,16(6):34835O 2王剐螺,何风生,荣康泰.农药免疫分析方法进展.国外医学卫生学 分册,1998,25(5)30l一304 3荣康搴,龚堆簟.对氧礴一血蓝蛋白免疫家兔的抗毒试验.中华预防 医学杂志,I980,l4(3)l33—196 4MarcoMP,GeesJ,ChengHM,eta1.Development0fnetlzme linkedimmuno~rbenta~sayforearhary1.JAgmFoodChem, 1993,41:423--430 5SheramJ.Current$Latu$pesticideresidueanalysis.JA0AC Int,1997.80:283287 —30收藉) (1999—05 邮炭代号t28—238 科学大众化大众科学化 《科学大众》——影响几代人的科普杂志 科学大众]937年创千U,是面向国内外发行的名牌科普杂志.科学大众融科学性,知识性新颖性,普及性于一体,潦受广大青少年 挠爱好者和科普工作者喜爱.科学大众为月刊,全年订价36元.订户可直接与该千u联系办理订阅手缨. 科学走众杂志社地址:南京扳台街55号邮?:210042电话t(025)5413295传真(025)5407549 联幂人:何晕业羹?孟?秆