食烷菌和烟曲霉酯酶的酶学性质及定点突变研究.pdf.doc

食烷菌和烟曲霉酯酶的酶学性质及定点突变研究.pdf.doc , 刘子 铎 教 授 刘子 铎 教 授 罗美 中 教 授 洪 玉 枝副 教 授 吴 高 兵 讲 师 如需 保 密， 口 并 表 示 了 谢 意。 签 名誉襄 : 扩 ， , 穓 一 舞’砑 譬 ,,( ,窖 е瘟 啤, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, , , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 ,,酯 酶, ,酶学性质 研究? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ( , ,,,金 属离 子 及 其 他 化 学物 质 对 酯 酶活 性的 影 响 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? , ,, ,,突 变 体 的 构建 ????????????????????????。, ,,( ,,蜃 镈 ,的 提 取 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 , 结构模 拟 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 一 , 有 机溶 剂 能力: 在 浓度高 达,,的 有 机溶 剂 中 保温 , 以 烟曲 霉 为 目标菌 株 ， 得 到 一 酯 酶蛋 白, ,。, , 的 最 适 温 度为 ,,， 最 适 ,为 ,,。为 了 提 高 酶的 热稳 定 性， 以 理 性设 计 为 基 础 ， 通 过 定 点突 变 技 术 构建 了 三 个 突 变 体 ， 分 别 为 ,,,琕 ,,和 ,,,疺 ,,， 并 对 其 酶学性质 进 行研究。 研究结果 显示 ， , , , 蚔 , , 与, 具 有 相 似 的 温 度变 化 曲 线 ， 最 适 温 度均为 ,,， ,,,疺 ,,的 最 适 温 度则 提 高 至 ,,。突 变 体 与, 均具 有 相 似 的 最 适 关 键词: 酯 酶: 冷活 性: 耐 有 机溶 剂 : 热稳 定 性; 定 点突 变 ; 结构模 拟 , , , , , , , 瓸 , , , , , , , , ,,,,,甒 ,,， , , ,, , , , , , , , , ,,,,,甌 , ,,,,,,。產 , ,, , , , , , , , , ,,,,, , ,,,,,, ,,,,, ,, ,,, , , ， , , , , , ,,,,— ,,,,— , , , , ,,, , , ,, , , ,,, ,,, , , ,,,,,,,筩 , , , , ,,,,， ,,,, ,, ， ,,,,,,( , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,,,( , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ( , , , , ,,,,, ,,,,, , , , , , , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 , , , , , , , , , , , , ,,,, , , , , ,, , ,,, , , , ,,,,,,,,甌 ,, 酶与脂肪酶是 在 工 业上 最 具 有 应 用前 景的 两类酶。 ,,, ,,以 及 保守 的 组氨酸 残 基 组成的 催 化 三 联 体 结构。存 在 于 催 化 三 联 体 结构中 华 中 农业人学, ,届 硕士 研究生学位 论文 动 物 中 ， 脂肪酶多存 在 于 脂肪、胰 脏 等 组织; 植 物 中 ， 则 主要 存 在 于 油 料 作物 的 种子 ， 其 功 能 是 为 种子 发芽贡献营 养 物 质 , 豕 , , , 。 从 ,,年 至 今 ， 人们对 于 脂肪酶的 研究历 史 持 续了 一 百 八 十余 年 。而 微 生物 脂 ,,， 并 且 很快 被 广泛 应 用于 商 业生产， ,,脂肪酶的 应 用 , 还 可 利用一 定 的 技 术 来 提 高 酶的 重 复应 用率 、稳 定 性， 例如 固 定 化 技 术 ,, , , 删洲 方法， 其 中 脂肪酶的 作用可 以 有 效地 提 高 其 合 成的 效率 。 , , 应 用价值外 ， 脂肪酶还 可 以 被 用于 改 善奶 制 品 天 然 的 不 良 味 道 ， 使其 具 有 诱人的 香 定 性检测 主要 用于 筛选能 够产脂肪酶的 菌 株 ， 此方法选 择 性强、快 速、准确 、 方便。平 板 筛选是 定 性检测 中 最 常 用的 方法， 实验 原 理 为 : 以 甘油 三 酯 为 碳源， 以 经 微 生物 代谢 产生的 透 明 圈 为 判 断标准， 以 此来 确 定 是 否 具 有 脂肪酶活 性。 在 实际 操 作中 ， 为 了 能够更清 晰 地 观察水解圈 的 大 小 ， 常 常 在 筛选培养 基 中 加 , , , 酸 碱 滴定 法, 我 ,康 ,,,: 定 量检测 脂肪酶活 力的 方法有 很多， 最 经 典 的 是 酸 碱 滴定 法。在 一 定 条件下， 乳化 的 橄 榄 油 能够被 脂肪酶催 化 酯 解成脂肪酸 。以 ,,溶 液为 标准液 ， 通 过 酸 碱 滴定 ， 使酸 性的 脂肪酸 得 到 中 和 ， 同时以 酚 酞 为 指 示 剂 显示 终 点。反应 结束 后 ， 以 消 耗 的 ,,的 量为 依 据 ， 以 此来 定 量检测 酶活 力。 此法实际 操 作简单， 但是 干 扰性因 素 太 多， 以 至 于 准确 性不 高 。 其 他 方法: 除 了 上 述 方法之 外 ， 测 定 脂肪酶活 力的 方 法还 有 很多， 例如 荧 光法、 , 华 中 农业人学, ,届 硕士 研究生学位 论文 , , 隙 嗟腉 , 、, , 约 癕 , ; 离 子 问 相 互 作用 减 少 等 。 , ,,在 有 关 嗜冷脂肪酶冷活 性机制 的 研 , , 左 右 ， 因 此造 就 了 ,,,, 诤 , 蠡 肪持 校 ,咏, ,サ乃, 海 洋 菌 特有 逦露染 ,, 的 嗜冷性?,, ,( 还 具 有 特殊 的 生长需 求: ,。只能 利用 ,( 在 不 被 污 染 的 海 水区 域 里 一 几 乎检测 不 到 ， 但 是 在 经 石油 污 染 后 能 够迅 速繁 殖并 且 成为 这 片 海 域 的 主要 微 生物 。特殊 的 碳 源和 能 右 ， 但其 在 低 温 条件下的 催 化 效率 却 是 中 温 酶的 数 倍 。到 目前 为 止， 低 温 酶已 被 广 , , , , ,,， ,, ,篕 ,,,ǎ篕 ,,,ǎ,碠 ,,引物 介 导 的 定 点突 变 改 进 后 的 方法， 原 理 但是 此法在 运 用时突 变 效率 较低 ， 原 因 是 : 大肠杆 菌 体 内 有 修 复系 统， 该系 统由 甲 基 介 导 ， 并 能 自 动 修 复错配的 碱 基 。因 此， ,,年 ， ,,,对 此问 题 提 出 了 改 善方 法， 即 用尿嘧 啶替换 ,,械 男叵 汆 奏ぃ ,源死唇档 虳, 的 选择 作用达 到 提 高 突 , 变 效率 的 目的 。此法在 研究蛋 白质 的 结构与功 能 相 互 关 系 中 被 广泛 应 用， 例如 ,,,,曾 用此技 术 开辟了 获 得 抗体 酶的 新 途 径 ， 即 通 过 替换 掉, ,抗体 中 的 组氨 食 烷 嚣 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 , 在 ,( , , 范 围 内 均可 良 好 成长， 此外 ， 在 肥料 发酵 过 程 中 还 可 抵 御 高 达 , ,,,,,,,,,,, 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,,,海,痺 ,( ,,,畁,, ,豢,, , , , , , ， , 寺 【 ,闑 , , ,, ,, , , , , , , , , ,,,,— ,一 , ,, , , , , ,、 , 染 , 郝 蛴 诖罅 , ι,镉 邢 薰 , 尽 , , 聚 合 酶则 分 别 购买 于 济 南 庄 盟 生物 技 术 有 限 公司 和 北 京 全 式 金 生物 技 术 有 限 公司 。 ,,,, , , 虯 , , , ,,,,琧 ,， 对 硝 基 苯 丁 酸 酯 ,,,,,,, ,,,,,琧 ,， 对 硝 基 苯 葵 酸 酯 ,,,,,,, , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 , , 疞 ， , , ,, ,,， ,, ,,。 ,， 加 ,,, , , ， , , , , , ,,疞 ,,,峙湎 钟 ,; ,,。 ,贮存 备 用， 无 菌 混 合 均匀 后 ， 操 作。 定 容 至 , ,, , 置于 , , 灭菌 水， 混 匀 后 定 容 至 , ,贮存 备 用。 ,烧 杯 中 ， 加 入约, ,, ,,疞 食 儡 目和 烟曲 霉 醑 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 , ,保存 备 ,,过 硫 酸 铵 : 用， 最 称 取 ,, , 悸 硭沽晾 禦 , , 溶 于 其 中 。 , ， 加 入去 离 子 水, , ,,。 比 例混 匀 ， 调 至 所 需 的 ,范 围 。 , , 疞 , , ， 将 这 两 种溶 液 按 , 生化 培养 箱， 中 国 哈 尔滨 东明 医 疗仪器 ,,,,; , , , ,, ,,,， ,,,占, ,濉 ,沟 羯锨 澹,诔 恋 碇屑 尤, ,此, , 重 悬， 混 匀 后 加入,皿溶 菌 酶， 将 混 合 体 系 放 入,,恒 温 培养 箱反应 , ,,疞 ,痬 ,离 心 , ,,辉 俅 谓 ,锨 逦, , , 痬 , 离 心, 丙 醇 ， 混 匀 后 ， 放 置在 一 ,,,,,, ,。,,淠诶涠, 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 进 行, 个 循 环 ; , ,,,,反应 结束 后 ， , 延 伸 , 用, ,,琼 脂糖 凝 胶 电 泳 检测 扩 增产物 。 ,, , , , , , , , , ,,, , , , ,此 , , , , , , , , , , , ,,， 将 酶切 体 系 置于 ,, 反应 过 夜 。 将 经 双酶切 处 理 过 的 ,,基 因 片 段 和 ,,一 ,( ,, 畏 直 鹩 肈,凝 胶 回 收 试 ， ,產 ,,, , ,,,,, , , , , , 表 ,,酶连体 系 , , , , , , , , , , , , ,,电 转 感 受态 细胞 的 制 备 : , , , 嘌 , , , , 、 , , , 嘌 , , 校 , , , , , 用适 量的 灭过 菌 冷却 的 ,,甘油 重 悬菌 体 ， ,, 食 烷 酉 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 分 析 则 提 ,,,,,: , , ,,,畁,,畁交 , , ,( , 行分 析 比 较。 ,, , , , , 兰主奎兰兰奎兰,,旦堡主竺窒竺兰些 笙 兰 诱 导 结束 后 ， 用低 温 高 速离 心 机收 集菌 体 ， ,, , , , 重 悬菌 体 ， ， ,, , ,的 柱 材料 加 入洗净 , 含 有 , , 缀团浠 鵖 , , , 的 柱 子 中 ， , ,,,,,( ,洗涤 柱 材料 ， 平 衡 柱 床 ; , 倾倒 掉上 层 水， 并 用滤 纸 吸 取 残 留 的 水和 未凝 聚 的 丙 烯 酰胺 。 , ,,, ,,,, 加 入量, , ,, ,, ,, ,』 , ? ,? ,? ,艇 , , , 友, 撼 逡 捍 , 砉 , 难 , 罚, , 条件下电 泳 ， 将 稀 释 后 的 样 品 再依 次稀 释 为 ,,， ,， ,， ,， ,， ,， ,， ,,,, 浓度梯 度; 酯 酶酶活 力测 定 的 标准反应 体 系 ,, ,,,的 ,,瓾 ,缓 冲溶 液; ,,,疞 ,,浓度和 吸 光值绘 制 标 准曲 线 。 以 , , , , , 煌, 剂 闯 ざ 鹊 亩 韵 趸 , 锦ィ 憾 韵 趸 , 揭宜 狨, , , , ， 对 硝 基 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 最 适 温 度: 先 将 底物 与缓 冲液 的 混 合 体 系 在 不 同 温 度, , , , 的 水浴 锅中 预 热 ,,， 计 算 相 对 酶活 ， 每 个 温 度 做三 组平 行试 验 。 温 ， 每 , 算 相 对 酶活 ， 每 个 时问 段 做 三 组平 行实验 。 ,,( ,, ,, ,,疞 柠 檬 酸 ( 柠 檬 配置不 同, 的 缓 冲液 酸 钠缓 冲液 以 及 体 系 : , ,,, ,,舛 ,傅牟 杏嗷 盍 Γ ,圆 患 尤魏 挝镏实脑, 富 盍 ξ,,,， 计 算 相 对 活 性。 ,,, ,为 底物 ， 参 照 酶标准反 , , , , , ッ 富 , 虻腄 , 序 列 ,,, ,, , ,,,,疞 、 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 , , , , , , , , , ,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,, ,此 ,,,惺 芴 ,旌 虾蠼, ,, 凶 ;,,,,、 有 ,,秅 , ,,,囊 禾錖 ,嘌 ,,,,,,恒 温 摇 床 过 夜 培养 。待培养 结束 后 ， 照 ， 将 大小 正确 的 质 粒 送 去 测 序 。将 测 序 正确 的 克 隆 子 菌 液保存 备 用。 竺主奎些 ,罄 ,,,? ぁ 览镒 ,竺兰堡丝 苎 白在 此位 点均为 , , , 范 , , 位 为 突 变 位 点的 另 一 个 参 考依 据 是 ， , , , 位 于 , , 催 化 残 基 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,上 游 很近的 地 方。由 于 考虑到 , , , , , ,,, ; , , , , , , , , , , , ,,, ,,,迪 ,,,,坠? , ,,,,,坐 ,,欤 海, , , , , , , , 图 ,籰与, ,具 有 高 同源性的 氨基 酸 序 列比 对 , ,,,进 行序 列比 对 ， 比 对 的 氨基 酸 序 列分 别 是 ,,, , , , , , , , , ,,,, ,,,, , , , , , , , ,, , , , , , , ,, , , , , , ,,,,琇 , , , , , , , , , , 杈 , , , , , , , , , , , , , ( ( ( ( ( , , , , , , , , ,,与具 有 良 好 热稳 定 性的 蛋 白质 氨基 酸 序 列的 比 对 , , , , ,,,,,,, , 延 伸 区 的 长度则 最 少 不 低 于 ,个 碱 基 ; 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,,瓵 ,,,,瑿 ,瓿 ,,獭 ,,,,,稴 ’ ,,ǖ阃槐 湟 ,锷 杓 频姆 椒 ǎ,,定 点突 变 流程 ; ,硎疽 吧 ,椭 柿, , 澹籅 表 示 扩 增后 含 有 突 变 位 点的 质 ,,,,,,,,: ,,,, , , , , , , , , , ,,,( 以 野生型重 组质 粒 , , 一 , ( , 籩, , D , 澹, , 貌 糠 种氐 , 由 霵 , 技 术 ， 扩 , , , , 由 , , 个 循 环 ; ,,延 伸 , 表 ,,,,反应 体 系 , , , , ,,, ,,,夯厥 帐约梁 薪 玃 ,产物 回 收 、纯 化 。将 纯 化 得 到 的 ,,,镉 胠此限 制 , 是 所用引物 对 为 ,,,,疪。 是 在 构建 ,,,疺 ,,突 变 体 时， 用到 的 质 粒 模 板 是 ,,( ,一 ,籚 , ,,引物 是 ,, 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,, ,氨苄 青霉 素 的 液 体 ,培养 基 ,,, ,,,,,阄 乱 〈 仓 ,, ,,匦 ,,澹, 糜诒 ,希, 哐蛊扑橄 赴 ,,,, 将 收 集得 到 的 上 清 液用于 亲 和 层 析 纯 化 ,,霾僮 鞑街 柙 ,。, ,淠诮 ,,: ,的 柱 材料 加 入洗净 的 柱 子 中 ， ,,,,,( ,洗涤 柱 材料 ， 平 衡 柱 床 ; ,,狿 ,,治龇椒 ㄍ ,( ,,。 ,， ,， ,,,,， ,,,,， ,,甮 , ,浓度梯 度。标准曲 线的 绘 制 : 取 不 同浓 坐 标， 吸 收 值为 纵 坐 标， 绘 制 标准曲 线。相 同体 系 以 及 反应 条件下测 定 纯 化 的 目的 ,,的 ,值， 根据 标准曲 线 计 算 其 浓度。 , , 定 其 在 ,,,的 吸 收 值。 ,, , ,,疞 磷 酸 氢 二 钠, ,, ,,疞 ,,,,幕 盍 Γ ,宰 罡 呋 盍 ξ,,,， 计 算 相 对 活 性。 不 同,的 缓冲液配制 体 系 如表 ,,,,( ,所示 : 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,,,,疞 磷 酸 ,,,,疞 , 柠 檬 液为 ,( ,,疞 ; 在 配置硼, 穑 疦 ,,撼 逡 禾逑凳保, ,秸 呋 旌 虾蠹 铀 ,?椭 ,, 因 此将 此确 定 为 构建 同源模 型的 最 佳 模 板 。 先 将 其 浓度稀 释 。 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 图 ,,,蜃 镈 ,的 电 泳 检测 , , , , ,,— — — — ,,— — ,,— — 图 ,, , 篏 , , , , , , , , , , , , ,,(((((((((((— (((((((((((( — ,篋 ,标记; ,嚎 赵 刂 柿, ,,,,; ,,: 重 组质 粒 , ,,序 列分 析 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 , , 挥 , 篙螺 ,,, ,, ,脖芑 ,玩眨 ,鲤,祧 枸张趟苊 恕靗 : ,恕煲 铗 桑 ,; ?凌嫩盎篷, ,, ( 塑 翅 ( 签 签 ,钅 劳 ,握菪 ,蛰 , 鎏 ? 豳 ?堕,甶 魏 ,,丽 瑚 隅 孙 撼 ,睿 甶 ,,璺(: ,? 弧 ,笠,,圹 ,,錳 壁 鲨 量塑 塑 篁: ? 基 星,欺,: 塑 燮,礽煎 釜 ,疲 ,婆盎塞 篓堡鲨 ,,髦 髑 ,簦 ,,的 氨基 酸 序 列同 源性分 析 , , , , , , , 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 虹二 : : 垦 ? ,爨坊 事,皇剩 海 ,,睾 皇 ,? ,市 突 生: , , ,, 甇 , , 札 , , , , , , ,， 皇 ,,,坠, 创 皇 ,,鱼,,,,,,,,壁 ,,旎驶 ,鱼? ,: ,( , ,,璺皇 皇 皇 皇 ,,,,蔾 , , 氨基 酸 序 列 比 对 ,( ,,， , , , , ， , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,, , , , , , , , 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 , 枣 , ，?、 ?町 琶 兰 三 图 ,,,: 最 适温 度; ,,: 热失 活 研究 , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 为 ,,。 葛 毒 , , , , ,,,— , , ,,( ,有 机溶 剂 以 及 去 污 剂 对 ,,活 性的 影 响 , , , ， , , , , , , 珹 , , , ， , 産 , , ,,,, , , , , , , 华 中 农业大学, ,届 硕十研究生学位 论文 , 旦望 丝 ,,蚷,鹒 竺坐 ,ǎ , ,,, , , , , , 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 ,,( ,冷活 性比 较 与分 析 为 了 进 一 步 研究, , 的 冷活 性， 将 其 与近十年 来 报道 的 具 有 冷活 性的 酯 酶或 者 , , , , , , , ,,,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ( , , , , , , , , , , , ,,,籈 ,,, , ,,,籈,,琍 ,,,,,,,, ,,,,, , , , , ， , , , , , , , , , , , , , , , , 被 , 嶙槌 山 , 蟹治龊 捅 冉蟖 结果 表 , , 所 ,,的 氨基 酸 组 成分 析 ,,酯 酶, ,定 点 突 变 ,,( ,刈 橹柿,,,,,,( ,, 的 构建 — ,篋 ,标记; ,篜 ,产物 将 双酶切 处 理 后 纯 化 的 基 因 ,,,作用下， ,,酶连片 段 以 及 载 体 于 , 过 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 , ,,— — 一 — — — 一 ,,— — ,,— , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,,序 列分 析 ,， ,含 量, ( ,,， 编 码 ,,霭被 ,幔 ,悦 苈 胱覣 ,起 始 ， ,,进 行预 测 ， 结果 显示 ， ,,中 不 存 在 信 号肽序 列。利用, ,数 据 库中 在 线 工 — — — — 狶— — — — — — — — — — — — — — — — — ,猄( — — — — — — — — — — — — — — — , , , , , , ? , , ; 二 : : ,坠,,: ,,坠,,,,,? ,海,,,,闑 ,,, , , , , ,,,, , , , , , , , , , , ,,, , , ,, ,,, , 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 ,,,,,,,海,痺 ,( ,,( ,,,,( ,,,,: ,,,, ,,,,,,,,,, ,,— — ,,— — ,,— — ,,— — ,,— — ,,— — — 围 图 ,,,サ阃槐 銹 ,扩 增产物 分 析 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 — ,,ξ,,,,,ξ—— — , , — — — — , , 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 ,, ,,:嶙, 辏 ,韵 嘤 Φ 腛 ,,为 纵 坐 标， 绘 制 标准 ,, , ,, , ,及 其 突 变 体 的 蛋 白浓度 , 华 中 农业大学, ,屈 硕, 研究生学位 论文 , , , , , , , , , , , 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 表 现为 : 随 着, 的 增加 ， 酶活 性呈递增趋势， 在 碱 性溶 液中 具 有 较高 的 稳 定 性。 , , , , , , , , , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 琶 星 。 , 图 ,, ,极其 突 变 体 在 ,?条件下 的 热失 活 研究 程 式 计 算 ,极其 突 变 体 的 动 力学常 数 ， 结果 如 表 ,, 所 示 。对 结果 分 析 可 知， 与 表 ,, ,及 其 突 变 体 的 动 力学常 数 , , , , , , , , , 立 , , , , 罗 : 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 , , , 残 基 位 于 蛋 白质 分 子 内 部 ， 其 所 在 区 域 ， 一 面 为 亲 水区 域 ， 另 一 面 为 疏 水区 域 。 食 烷 菌 和 烟曲 霉 酯 酶的 酶学性质 及 定 点突 变 研究 , , ,,,— , , 图 , , , , , , , , , , , , 华 中 农业人学, ,届 硕士 研究生学位 论文 酸 序 列进 行分 析 可 知， , , 如 ,,珻 ,则 没 有 活 性。与此相 比 ， 来 自 于 食 烷 菌 的 ,,则 具 有 更宽 的 作用范 围 ， ,。。的 酯 酶， 该酯 酶最 适 温 度为 ,,， 在 , , ,,的 耐 有 机溶 剂 脂 肪酶, , 和 乙腈 分 别 处 理 后 ， 失 去 ,,,,,,的 活 力。, ,良 好 的 耐 有 机溶 剂 能 力使它 可 作 , 竺? 奎些 查 兰,,旦堡主至, 竺兰堡笙 兰 我 们进 行了 热失 活 实验 研究， 测 定 ,及 其 突 变 体 在 ,。, 跫 ,碌 腡 ,,,( ,,,。 ,,,疺 ,,的 ,， ,虺 ,,耸 笛 槭 奔 ,, , 相 似 的 实验 结果 也 可 在 突 变 体 , , , , , , 可 能 使, , 原 有 的 催 化 结 构受到 影 响 。 ,,,,,— ,,,,位 ,,( ,,,的 氨基 酸 构象 进 行分 析 可 知: 氨基 酸 的 替换 后 ， 可 解除 其 对 熵值的 限 制 作用， 与溶 液之 问 的 相 互 作用有 助于 提 高 ,,的 稳 定 性。 , , 总 而 言之 ， 本 研究通 过 理 性设 计 与定 点突 变 相 结合 的 技 术 ， 成功 构建 了 三 个 热 稳 定 性提 高 的 突 变 体 ， 实验 结果 进 一 步 证 明 点突 变 技 术 是 一 种可 行的 方法， 用于 改 善酶的 热稳 定 性或 其 它 性质 来 达 到 满足工 业应 用要 求的 目的 。本 研究中 涉 及 到 的 两 个 突 变 位 点在 之 前 均没 有 被 报道 过 ， 因 此被 认 为 是 在 研究蛋 白的 结构与功 能 中 一 个 新 的 发现， 并 且 为 其 它 酶的 酶学性质 的 研究提 供 了 有 力的 参 考依 据 。 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 化 酶基 因 的 克 隆 ( 台 湾海 峡 ， ,,， ,: ,,,, 进 化 研究( 微 生物 学报， ,,， ,: ,,,, ,( 王 小 花 ， 洪 枫 ， 陆大年 ， 朱 利民 ( 脂肪酶在 纺 织工 业中 的 应 用( 毛 纺 科 技 ， ,,， , 位 论文 】 ( 上 海 : 华 东理 工 大 学图 书 馆 ， ,, , ,( 张晋卿， 刘伟 ， 谭 静 文 ， 万 拮 ， 李 若瑜 ( 烟曲 霉 在 不 同温 度和 营养 条件下的 生长 , , , , , , , , , , , ,,,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 琇 , , ,( ,,,, , 琇 , 甆 , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,,,,,, , , , , 琂 , , , , , , , , , , , , , , , , 华 中 农业大学, ,届 硕士 研究生学位 论文 ,， ,,, ,,,,, , , , , , 琑 , , , , , , , , , , , , ,,,,,,,， ,: ,,— ,, ,琇 , , ( , , , , , , , , , , , , ,,,,, , , , ， , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,, , , , , , , , , , , : , , , , , , ,,, , , , 珺 , , , , , , , ,,, ,, , , , , ,瓻 ,,,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,,,: , ,,,,,,,, ,,,,, , , , , , , , 瓹 , , , , , , , , 巧 , , , , , , , , , , , , ( , , , : , , , , , ,, ,,, ,,,,,瓸 ,,, , , ,,,, , , , , , ,甁 ， ,,,, ,瓼, ,, , , , , ， , : , , , , , ,， ,,,, ,,琀 ,, ,,,,,,,,,,,,,,， ,: ,,— ,, , , , , , ,,,,,,,,簍 ,瓻 ,,,,, , , , , , , ,,, ,,,, ,: ,,,, 华 中 农业大学, ,届 硕上 研究生学位 论文 , , , , , , , , , , , , , , ， , , , , , , , 琇 , , ,,, , , , , , , , , , , , ,,,,,, , , , , 琇 , , , , , , , ,,( ,, , , 琘 , , , , , ,,,,,,, , ( , , , , ,,,, , ,— ,,,,,( ,,,,,,,,， ,: , ,— ,猉 ， , , 狧 ( , , , , , , ,( ,,,, , , , , , , , , ,,,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,琣 , ,,,,,瓸 ,,,,,,,,， ,: , , , , , , , , , ,( ,, ,， ,,, , , , , , , , , , , , , , ( , ,琎 , , , , , , , , ,琓 ,,, ,， ,,,, ,,畁, ( ， ,( ,,,琣 , ,( ,,,: ,,,,,,,,( ,, ,,