分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素

分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素 分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因 素 2002年3月 第lO卷第期 中国实验动物 AcTAL^BORATORlI】MANIM^IlISSCIENTIA甄NICA Mar.2OO2 分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素 周欣王太一时伟红张梅英董婉维 (中国医科大学实验动物部,沈阳I10001) 【摘要】目的研究不同培养条件分离和克隆小鼠Es细胞集落的效率.方法以 PMEF饲养层,NI}L3T3细 胞饲养层或培养液中加人LIF为培养条件,分离和克隆昆明小鼠Es细胞集落,比较 其效率.结果饲养层的培养 条件明显优于堵养渡中加人L1F的培养条件;有饲养层的培养条件下,粟椹胚的Es 细胞集落出现率显着低于囊胚; 两种饲养层培养囊胚.其ES细胞集落的出现率差异无显着性.结论PMEF或 NIH3T3细胞作饲养层,培养昆明 小鼠的囊胚,适时离散ICM.是比较理想的分离Es细胞集落的方法. 【美羹词】昆明小鼠;ES细胞;集落形成 【中圈分类号】Q9525【文献标识码IA【文章编号I1005-4847(2002)01-0005-05 TheEfficientDerivationofEmbryonicStemCellColoniesinKunmingMouse ZHOUXin,WANGTaiyi,SHIWeihong,ZHANGMeiyingtDONGWanwei (DepaRmemofLaboratoryAnimal,cllinaMedieMUniversity,Shenyang110001,Cl~na) 【Abstract】 ObjectiveToinvestigateIheefficiencyofisolalionandcloningofEScellcoloaie~inKmmain gm~use.Mefla- odThreecultureconditionswereated,namely,PMEFfeederer,NIH3T3~edererandLIFwith outfeederer.Re- suitsAccordingtotheformationrateofEScellcolonies,thetwokindsof~ederlayerarebetrtha nLIFonly,thebJ%ns [irehottermjnforEScellsthanmorulaeandtherearertodifferencesbetweenthetwokindsoffe ederlayer.CendmItisa m0meffiemmwaytoisolateanddoneEScellcoloniesfromKunmingnlou~blastocystsbyP MEForNIH3T3feederlayer. 【Keywords】Kunmingmouse;EScells;Formationofcolony 小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)是从早期胚胎中 分离得到的未分化细胞系.它在体外可分化为各个 胚层的衍生细胞,在形成嵌台体时可以分化为包括 生殖细胞在内的各种类型的细胞,进而形成有功能 的配子.由于它的这些特点,小鼠的Es细胞已成 关于小鼠Es 为生命科学研究中最重要的工具之一, 细胞的研究与应用已成为目前的热点课题. 目前,大多数小鼠的Es细胞系都是从129品系 小鼠中建立的.129小鼠是一个比较独特的品系. 【墓盍项目1国家九五"攻关项目(9gA23-~432) 【作者筒舟】周欣(197I一),女,讲师,博士研究生,研究方向为 旺胎千细胞的建系及定向分化 .中国医科大学第二临床学院妇产科,沈阳I10004 在解剖,生理及行为方面都与其他品系的小鼠有所 不同.所以在用129小鼠的Es细胞进行遗传学研究 时,很难排除其遗传背景造成的突变小鼠的性状改 变.另外,和其他细胞系一样,随着体外培养时间的 延长,Es细胞的核型会发生变化,组织嵌台能力也 明显下降,不易形成嵌台体.所以,建立在科研中广 泛应用的其他品系小鼠的Es细胞系.并在传代早 期大量冻存,是解决问题的关键.建立小鼠Es细 胞系的方法很多.本研究分别比较了以小鼠原代成 纤维细胞(PMEF)饲养层,NIH-3T3细胞饲养层或白 血病抑制因子(LIF)为分化抑制物,由桑椹胚或囊胚 分离和克隆小鼠Es细胞集落的效率,以期为建立 其他品系小鼠Es细胞系奠定基础. 中国实验动物2002午3月第】O卷第】期AclnLabAnitaSciSin.M盯2002,Voi10No7 图3NIH3T3饲养层x100 Fig.3NII~T3feederlayer×100 图4昆明小鼠囊胚及脱掉的透明带x4o0 Fig-4Blastoeyst{】fKunmlngtnnHseanddetachedpellucid z0rx4OO 图5贴壁囊肛,滋养层细胞铺展,ICM开始增殖x500 隐-5Attachedhlastoeystwithtrophoblastcellsand1CM x50() 细胞集落的出现率明显低于有饲养层的培养条件. 在有饲养层的两种培养条件下,桑椹胚的贴壁率, ICM增殖率及Es细胞集落出现率均显着低于囊胚 图6ICM已增殖戚圆柱状,边界清晰x4OO rig-6Cylinder-shapedICMwithclearmanx4OO 圈7ICM面覆盖内胚层样细胞,边界不清x4OO 隐.7ICMcoveredwithendoderm—hkecellsandunclea~ marginx4OO 图8干细胞样集落x4OO rig-8Stemcell-likeers]onyx400 (P<0O1).以PMEF和NIH一33"3为饲养层由囊胚 分离和克隆Es细胞集落,在胚胎贴壁率,ICM增殖 率及Es细胞集落出现率3方面差异均无显着性 (P>0.05). 8中国实验动物2OO2年3月第l0卷第1期^山LabA~fim$ci 口,March2OO2.Vd10No 圈9ES细胞集落x4OO Fig.9EScellcolonyx4OO 圈10Es细胞集落的碱性磷酸酶染色x4OO F艳-10AlkaIirIe~osphatasestaining.f瞄cellcoloayx400 裹13种培养条件下分离和克隆Es细胞集落的结果 Tab-1Thee~ficiencyisolationandclottingESceilcoloniesindifferentways 3讨论 3.1胚胎的获得 分离和克隆Es细胞集落的前提是得到高质量 的小鼠早期胚胎.根据文献报道,小鼠交配可采用 超排卵或自然交配的方法,冲胚时间一般在见栓后 的第3天(E3).为确定要采用的交配方式和冲胚 的具体时间,我们曾用40只小鼠进行了预实验.结 果发现,在昆明小鼠中,同一孕鼠体内的胚胎发育时 相存在一定的差异性,超排卵小鼠更为明显.所以, 很难确定一个准确的时间,既保证所有胚胎都已发 育到了囊胚期,又保证所有胚胎都尚未着床.在E3 下午4.00时冲胚,可获得相对较多的囊胚,但其中 也混有少量桑椹胚甚至卵裂期胚.由于不同品系小 鼠的解剖,生理条件不同,再加上不同的饲养条件, 其胚胎发育的时相也不尽相同,若要建立其他品系 小鼠的Es细胞系,尚需重新摸索冲胚的具体时间. 在本研究中,我们采用小鼠自然交配的方式,选 择所有囊胚和桑椹胚进行培养.结果,尽管部分桑 椹胚在体外培养一段时间以后可发育成囊胚.其中 少部分也可贴壁,但其ICM的增殖率和Es细胞集 落的出现率均明显低于囊胚;在无饲养层的条件下, 其发育到囊胚期的比例更低.所以,在建立小鼠Es 细胞系时,应仅选择囊胚进行培养,获得Es细胞集 落的机率也较高. 3.2贴壁囊胚的生长行为和ES蛔臆集落的获得 囊胚贴壁后1—3d后ICM长成圆柱状,此时若 不及时离散ICM,ICM表面部分细胞将分化为内胚 层样细胞.有研究表明,未分化的小鼠Es细胞与 内胚层细胞共同培养,会导致Es细胞的迅速丢 失.所以,选择ICM离散的时机非常重要.离散 过早,ICM数量过少,离散过晚,ICM细胞已发生分 化.由于不同胚胎的ICM增殖进程并非完全一致, 所以不能简单地在何时离散ICM,而应根据 ICM的形态具体分析.判断的标准是ICM生长得较 饱满,但边界清晰,表面亦无其他细胞覆盖. 将ICM离散后培养2—3d,可以观察到出现各 种细胞集落.其中,干细胞样集落呈多层,巢状生 长,与Es细胞集落类似,有时会被误判为Es细胞 集落.二者的区0是:干细胞样集落边界不规整,常 .硅羲疆盘l豁蠹鐾l;..I瓣? 中国实验动物2002年3月第10卷第1期AclaLabAnitaSciSin,M眦h2OO2,v0 【_l0No.19 有单个细胞,KS细胞集落边界清晰,折光性强;干细 胞样集落传代后细胞会逐渐消失,而Es细胞集落 挑出后传代培养,可形成多个集落,且生长极为旺 盛,经碱性磷酸酶染色,集落呈紫红色,证明确为Es 细胞. 3.33种培养条件的比较 自1981年Evans和Kaufman首次从小鼠囊胚的 ICM中建立了第一株Es细胞系以来l,人们又先后 成功地从小鼠的8.细胞期胚胎,桑椹胚及延迟着床 囊胚的原始外胚层细胞中建立了Es细胞系.建 系常用的饲养层细胞为PMEF,小鼠胚胎成纤维细 胞系STO,Buffalo大鼠肝细胞系等等.这些饲养细 胞可产生LIF,抑制Es细胞分化.在培养基中加 入重组的LIF,亦可抑制Es细胞分化,并获得ES细 胞系.但是上述方法多采用129小鼠作为胚胎供 体,在其他品系小鼠情况如何,还缺乏系统的研究. 我们以昆明小鼠为胚胎供体.系统比较了 PMEF饲养层,NIH一313细胞饲养层及以LIF为分 化抑制物的无饲养层培养条件,由小鼠囊胚分离和 克隆Es细胞集落的效率.其中,以NIH3T3细胞作 饲养层分离小鼠Es细胞国内外未见报道.结果表 明,以PMEF和NIH一313为饲养层,在胚胎贴壁率, ICM增殖率及Es细胞集落出现率3方面均无显着 性差异,而在加入LIF的无饲养层培养条件下,胚胎 贴壁率和ICM增殖率均显着降低,Es细胞集落的出 现率更是下降为0. 早期胚胎的发育是一个复杂的过程,需要多种 细胞因子的参与,在体外培养时,提供与体内环境类 似的培养条件,是促进胚胎发育的关键.PMEF和 NIH3T3细胞除可产生LIF外,还分泌其他细胞因 子,这些细胞因子对昆明小鼠囊胚的发育显然有促 进作用,而单独LIF尚不足以维持昆明小鼠囊胚发 育到出现高质量的ICM进而形成Es细胞集落. 制备PMEF饲养层是非常繁琐,费时的工作,且 不易排除微生物污染的可能性,一旦发生隐匿污染, 不仅影响建系工作的进行,而且即使建成了Es细 胞系,也不可避免地带有微生物污染,干扰后续实验 的结果.以STO等小鼠胚胎成纤维细胞系作饲养 层,省时省力,且可保证无微生物污染.但有研究表 明,以STO细胞系作饲养层分离小鼠Es细胞集落 时,其Es细胞集落的出现率明显低于PMEF饲养 层.我们在国内外首次提出采用另外一种小鼠胚 胎成纤维细胞系——NIH3T3细胞作饲养层分离小 鼠Es细胞,结果其Es细胞集落的形成率与PMEF 相比无显着性差异,提示NIH3T3细胞是一种较为 理想的分离Es细胞集落的饲养层. 以NIH3T3细胞或PMEF细胞作饲养 综上所述, 层,培养昆明小鼠的E3囊胚,适时离散ICM继续培 养,是比较理想和高教的分离Es细胞集落的方法. 参考文蘸 [1]高舒平,时伟红,辜英,等用于胚胎干细胞分离培养 的饲养层的制作.中国实验动物学杂志.2000,10:78 — 81 [2]Evansm,KaufnmnMF1.Establishn~mincultureof山— potentialceilsfrommb.s.?tH,1981.292:154 — 156 [3:叶鑫生.许田,汤锡芳,等干细胞和发育生物学.北 京}军事医学科学出版社,2000,189—190 [4JKatjaP,IvanM.SvetlanaG,eta1.Establishmentofpluri? 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