强力脑心康胶囊分析方法验证方案

强力脑心康胶囊方法验证 采用薄层色谱分析法对强力脑心康胶囊的主要成分进行分析方法的研究 密环菌提取物中的肽进行鉴别分析实验，实验结果表明此方法专属性高、重现性、耐用性好，实验结果准确。 强力脑心康胶囊分析方法验证方案 通化吉通药业有限公司 一、 药材 1、丹参:本品为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根及根茎。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。本品应符合《中国药典》2010年版一部70页“丹参”项下的有关规定,并以此作为鉴定依据。 2、密环菌(提取物):本品为白蘑科真菌蜜环菌 Armillaria mellea(vane. ex. Fr.)Quel.经液体发酵培养，经分离提取制得的干燥菌粉。本品含多糖以无水葡萄糖(CHO)6126计，不得低于5.0%，含肽不得低于5.0%。本品应符合化学药品地方标准上升国家标准(第十三册)WS-10001-(HD-1224)-2002 “密环菌”项下的有关规定,并以此作为鉴定依据。 3、蜂王浆(冻干粉):本品工蜂咽下腺和上腭腺分泌的，主要用于饲喂蜂王和蜂已为幼虫的乳白色、淡黄色或浅橙色浆状物质。本品应符合《中华人民共和国国家标准》GB 9697—2008 “蜂王浆Royal jelly”和《中华人民共和国国家标准》GB 21532—2008 “蜂王浆冻干粉Lyophilized royal jelly powder” 项下的有关规定,并以此作为鉴定依据。 第 1 页 共 15 页 二、强力脑心康胶囊药品质量标准草案 强 力 脑 心 康 胶 囊 Qiangli Naoxinkang Jiaonang 本品每粒物中含丹参以原儿茶醛(C7H6o3)计，不得少于90µg; 【处方】 丹参1500g 蜜环菌提取液1500g 蜂王浆125g 制成 1000粒 【制法】 以上三味，取丹参75g，粉碎成细粉;剩余丹参粉碎成粗粉，加水煎煮三次，第一、二次各2小时，第三次3小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.30,1.32(70?)的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉;蜜环菌提取液减压浓缩至相对密度为1.30,1.32(70?)的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，与上述细粉混匀，制成颗粒，干燥;蜂王浆冷冻干燥成细粉后，与上述颗粒混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。 【性状】 本品为胶囊剂，内容物为棕色或棕褐色的颗粒及粉末;味微苦涩。 【鉴别】 (1)取本品内容物1g，加水30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液加醋酸乙酯20ml、乙醇20ml，振摇提取20分钟，静置,分取上清液，浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取10-羟基-2-葵烯酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录? B)试验，吸取上供试品溶液5µl、对照品溶液2µl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以三氯甲烷—甲醇(8:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.2%高锰酸钾溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 (2)取本品内容物1.2g，加乙醚20ml，冷浸1小时，时时振摇，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮?A对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照 第 2 页 共 15 页 品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯—乙酸乙酯(19?1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，分别在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 (3)取本品1.5g，加石油醚(60?,90?)10ml，密塞，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液5μl，点样于硅胶G薄层板上，以石油醚(60?,90?)-乙酸乙酯(9?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110? 10分钟，立即检视，应有紫色斑点。 (4)取本品1.5g，加甲醇10ml，密塞，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，照薄层色谱法(中国药典2000年版二部附录V B)试验，吸取上述溶液5μl，点样于硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(4?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%磷钼酸乙醇溶液，在110? 10分钟，立即检视，应有蓝色斑点。 【检查】 应符合胶囊剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版一部附录? L)。 铅、镉、砷、汞、铜 取本品1g，照铅、镉、砷、汞、铜测定法(中国药典2010年版一部附录? B原子吸收分光光度法或电感耦盒等离子体质谱法)测定，铅不得过百万分之五，镉不得过千万分之三、砷不得过百万分之二、汞不得过千万分之二、铜不得过百万分之二十。 重金属 取本品1g，照重金属检查法(中国药典2010年版一部附录? E重金属检查法)测定，含重金属不得过百万分之二十。 【含量测定】 (1) 丹参 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录? D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇—水—甲酸(18?81.5?0.5)为流动相;波长为280nm。理论板数按原儿茶醛峰计算应不低于1000。 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶醛对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含30µg的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，研细，混匀，取1g，精密称定， 第 3 页 共 15 页 精密加入水25ml，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液10ml，蒸干，残渣加50,甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加50,甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品每粒含丹参以原儿茶醛(CHO)计，不得少于90µg。 763 【功能主治】 改善循环，活血化瘀，安神宁心。用于冠心病、心绞痛、头痛眩晕、神经衰弱。 【用法用量】 口服，一次2粒，一日2次。 【规格】 每粒装0.3g 贮藏】 密封。 【 注:系白蘑科真菌蜜环菌Armillaria millea(Vahl.ex Fr.)Quel，人工液蜜环菌提取液 体发酵的培养液，经浓缩滤过的液体。 培养条件:将60,体积的培养基汁发酵罐中，隔水加热灭菌30分钟，用压差法接三级种子与种子罐中，26,28?培养4,6天，转入发酵罐中，26,28?继续培养6,7天，带发酵液变为紫褐色，由稠变稀，部分菌丝开始自溶，菌丝颗粒变碎，pH值降至5.6,5.2，管内亮度开始减弱，即可出罐。 发酵液处理:将发酵液滤过，收集滤液至贮罐，即得蜜环菌发酵液培养液，浓缩至相对密度1.030,1.035(20?)，即得蜜环菌提取液。 第 4 页 共 15 页 强力脑心康胶囊质量标准分析方法验证 [摘要] 概述:强力脑心康胶囊质量标准为“国家药品标准[WS-10947(ZD-0947)-2002-2012Z]”。为满足产品出口的质量检验标准，增加对密环菌中有效成份多糖与肽进行薄层色谱【鉴别】测定项，并依据中华人民共和国药典标准2010版一部附录??A《中药质量标准分析方法验证指导原则》要求，对质量标准中所增加的密环菌多糖与肽的检测项进行分析方法验证。 [关键词] 强力脑心康胶囊成品方法学验证;蜜环菌提取物多糖的鉴别;蜜环菌提取物肽的鉴别。 [验证目的] 采用薄层色谱法对密环菌提取物中的多糖与多肽的鉴别，并确定该检测方法的重现性、专属性、耐用性 [方法依据]中华人民共和国药典标准2010版一部附录??A《中药质量标准分析方法验证指导原则》 [实验设备、仪器与试剂] 1.1 DHG202型电热干燥箱1台、WS2-133-85-2型电热恒温水浴锅1台、202-0型台式干燥箱1台、HHB11-42型电热恒温培养箱1台(上海嘉展仪器设备有限公司);DT-100型带光分析天平、TG-328A电光分析天平、AG135型电子天平、JD-200多功能电子天平(上海发瑞仪器科技公司);SK3200HP型超声清洗器DS10260超声波清洗器(上海易净超声波清洗机器厂)UV-1型三用紫外分析仪(山东华鹏环保科技有限公司)WFZ800-D3A型单光束紫外可见分光光度计、QY-20三用紫外分析仪(上海美普达仪器有限公司)XS-810生物显微镜(宁波永新光学仪器厂)ZH-2自动漩涡混合器、YXQ、SG46.280手提式煤电两用消毒器(北京金时速仪器设备经营部)Agilent 1100高效液相色谱仪(上海伍丰科技有限公司) 第 5 页 共 15 页 1.2 所用试剂:石油醚、醋酸乙酯、苯、磷鉬酸(天津市欣宽福利化工厂)、香草醛(山东安伯化工有限公司) 【药材标准】 2.1丹参:本品为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根及根茎。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。本品应符合《中国药典》2010年版一部70页“丹参”项下的有关规定,并以此作为鉴定依据。 2.2密环菌(提取物):本品为白蘑科真菌蜜环菌 Armillaria mellea(vane. ex. Fr.)Quel.经液体发酵培养，经分离提取制得的干燥菌粉。本品含多糖以无水葡萄糖(CHO)计，不得低于5.0%，含肽不得低于5.0%。本品应符合化学药品地方标准上升6126 国家标准(第十三册)WS-10001-(HD-1224)-2002 “密环菌”项下的有关规定,并以此作为鉴定依据。 2.3、蜂王浆(冻干粉):本品工蜂咽下腺和上腭腺分泌的，主要用于饲喂蜂王和蜂已为幼虫的乳白色、淡黄色或浅橙色浆状物质。本品应符合《中华人民共和国国家标准》GB 9697—2008 “蜂王浆Royal jelly”和《中华人民共和国国家标准》GB 21532—2008 “蜂王浆冻干粉Lyophilized royal jelly powder” 项下的有关规定,并以此作为鉴定依据。 【制法】 以上三味，取丹参75g，粉碎成细粉;剩余丹参粉碎成粗粉，加水煎煮三次，第一、二次各2小时，第三次3小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.30,1.32(70?)的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉;蜜环菌提取液减压浓缩至相对密度为1.30,1.32(70?)的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，与上述细粉混匀，制成颗粒，干燥;蜂王浆冷冻干燥成细粉后，与上述颗粒混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。 3 密环菌提取物中多糖的(鉴别) 3.1 材料与方法 3.1.1 材料 3.1.1.1 对照溶液(密环菌提取物); 3.1.1.2 空白溶液(石油醚); 第 6 页 共 15 页 3.1.1.3 阴性样品(以密环菌提取物为空白制得样品); 3.1.1.4 成品:样品1( )、样品2( )、样品3( ); 3.1.1.5 硅胶,薄层板，(分别为自制、厂牌1、厂牌2) 3.2 样品制备 3.2.1 对照溶液:取密环菌提取物1g，加石油醚(60?,90?)10ml，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照溶液。 3.2.2 空白溶液:取石油醚(60?,90?)溶液为空白溶液。 3.2.3 阴性样品溶液:取阴性样品1.5g，加石油醚(60?,90?)10ml，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为阴性供试品溶液。 3.2.4 成品样品溶液:取三个批号的成品样品颗粒适量，研细，分别精密称取1.5g，加石油醚(60?,90?)10ml，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为成品供试品溶液。 3.3 结果判定 3.3.1 对照溶液:照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录?B)试验吸取上述溶液5μl，点样于羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60?,90?)-醋酸乙酯(9?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110?10分钟，立即检视，应有紫色斑点。 3.3.2 空白:在与对照溶液色谱相应的位置上，无斑点呈现; 3.3.3 阴性样品: 在与对照溶液色谱相应的位置上，无相同的紫斑点 3.3.4 三批成品样品:在与对照溶液色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点; 3.4 方法学验证内容 3.4.1 专属性 定义 在其他成分可能存在下，如杂质、降解物、添加物(如缓冲液、赋形剂、稳定剂)等存在时，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。不含被测成份的供试品均不得干扰。 在本试验中，采用标准品溶液、空白溶液、阴性样品一供试品溶液、成品样品供 第 7 页 共 15 页 试品溶液在同一硅胶G薄层板上做斑点颜色对比，其他成份的存在应对其检测结果无干扰。 具体方案 取“3.2样品制备”的各样品溶液各5μl，点样于羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60?,90?)-醋酸乙酯(9?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110?10分钟，立即检视。 判定标准 成品样品的供试品色谱中，在与对照溶液色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点;空白与阴性样品一的供试品色谱中，在与对照溶液色谱相应的位置上，则无上述斑点呈现; 图谱(照片) 标准品 空白 阴样一 成品1 标准品 空白 阴样一 成品2 标准品 空白 阴样一 成品3 3.4.2 重复性 定义 分析方法的重复性是指在同样的操作条件下，在较短时间间隔的精密度。 本试验中的重复性是对不同批号的样品进行连续多次测定，比较测定结果的精密度。 具体方案 取“3.2样品制备”的标准品溶液、三批成品供试品溶液各5μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60?,90?)-醋酸乙酯(9?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110?10分钟，立即检视，应有紫色斑点。 以此法，对3批强力脑心康胶囊样品连续重复测定3次，比较3次的结果，考察该 第 8 页 共 15 页 检测方法的重复性。 判定标准 对三个批号的强力脑心康胶囊样品连续重复测定3次，测定结果应一致，无明显差异。 图谱 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 三次测定 二次测定 1次测定 3.5.1 耐用性 定义 在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据。 本实验中的耐用性是对不同厂家的硅胶G薄层板进行连续多次测定，比较测定结果的耐用性。 具体方案 取“3.2样品制备”的标准品溶液、三批成品供试品溶液各5μl分别点于同一个不同厂牌的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60?,90?)-醋酸乙酯(9?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110?10分钟，立即检视，比较3个厂牌的结果，考察该检测方法的耐用性。 判定标准 对三个批号的强力脑心康胶囊样品样品采用三个厂牌的硅胶G薄层板重复测定3次，测定结果应一致，无明显差异。 图谱(照片) 第 9 页 共 15 页 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 厂牌2 厂牌1 自制 3.6 方法学验证结果 专属性实验 在本试验中，采用标准品溶液空白溶液与阴性样品一供试品溶液、成品样品供试品溶液在同一硅胶G薄层板上做斑点颜色对比，其他成份的存在，对其检测结果无干扰，空白样品与阴性样品没有相同斑点呈现，其专属性较高。 重复性实验 对3批强力脑心康胶囊样品连续重复测定3次，比较3次的结果。试验结果表明，3次的测定结果一致，无明显差异。 耐用实验 对3批强力脑心康胶囊样品采用三个厂牌的硅胶G薄层板连续重复测定3次，比较3次的结果。试验结果表明，采用三个厂牌的硅胶G薄层板的测定结果无明显差异。 3.7 结论 采用薄层色谱分析法对强力脑心康胶囊的主要成分密环菌提取物中的多糖进行鉴别分析实验，实验结果表明此方法专属性高、重现性、耐用性好，实验结果准确。 3 密环菌提取物中肽的【鉴别】 3.1 材料与方法 3.1.1 材料 第 10 页 共 15 页 3.1.1.1 对照溶液(密环菌提取物); 3.1.1.2 空白溶液(甲醇); 3.1.1.3 阴性样品(以密环菌提取物为空白制得样品); 3.1.1.4 成品:样品1( )、样品2( )、样品3( ); 3.1.1.5 硅胶,薄层板，(分别为自制、厂牌1、厂牌2) 3.2 样品制备 3.2.1 对照溶液:取密环菌提取物1g，加甲醇10ml，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照溶液。 3.2.2 空白溶液:取甲醇溶液为空白溶液。 3.2.3 阴性样品溶液:取阴性样品1.5g，加甲醇10ml，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为阴性供试品溶液。 3.2.4 成品样品溶液:取三个批号的成品样品颗粒适量，研细，分别精密称取1.5g，甲醇10ml，时时振摇，浸渍1小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为成品供试品溶液。 3.3 结果判定 照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录?B)试验吸取上述3.3.1 对照溶液: 溶液5μl，点样于羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(4?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%磷钼酸乙醇溶液，在110?10分钟，立即检视，应有蓝色斑点。 3.3.2 空白:在与对照溶液色谱相应的位置上，无斑点呈现; 3.3.3 阴性样品: 在与对照溶液色谱相应的位置上，无相同的蓝斑点 3.3.4 三批成品样品:在与对照溶液色谱相应的位置上，显相同的蓝色斑点; 3.4 方法学验证内容 3.4.1 专属性 定义 在其他成分可能存在下，如杂质、降解物、添加物(如缓冲液、赋形剂、稳定剂)等存在时，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。不含被测成份的供试品均不得干扰。 第 11 页 共 15 页 在本试验中，采用标准品溶液、空白溶液、阴性样品一供试品溶液、成品样品供试品溶液在同一硅胶G薄层板上做斑点颜色对比，其他成份的存在应对其检测结果无干扰。 具体方案 取“3.2样品制备”的各样品溶液各5μl，点样于羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(4?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%磷钼酸乙醇溶液，在110?10分钟，立即检视。 判定标准 成品样品的供试品色谱中，在与对照溶液色谱相应的位置上，显相同的蓝色斑点;空白与阴性样品一的供试品色谱中，在与对照溶液色谱相应的位置上，则无上述斑点呈现; 图谱(照片) 标准品 空白 阴样一 成品1 标准品 空白 阴样一 成品2 标准品 空白 阴样一 成品3 3.4.2 重复性 定义 分析方法的重复性是指在同样的操作条件下，在较短时间间隔的精密度。 本试验中的重复性是对不同批号的样品进行连续多次测定，比较测定结果的精密度。 具体方案 取“3.2样品制备”的标准品溶液、三批成品供试品溶液各5μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(4?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%磷钼酸乙醇溶液，在110?10分钟，立即检视，应有蓝色斑点。 第 12 页 共 15 页 以此法，对3批强力脑心康胶囊样品连续重复测定3次，比较3次的结果，考察该检测方法的重复性。 判定标准 对三个批号的强力脑心康胶囊样品连续重复测定3次，测定结果应一致，无明显差异。 图谱 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 三次测定 二次测定 1次测定 3.5.1 耐用性 定义 在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据。 本实验中的耐用性是对不同厂家的硅胶G薄层板进行连续多次测定，比较测定结果的耐用性。 具体方案 取“3.2样品制备”的标准品溶液、三批成品供试品溶液各5μl分别点于同一个不同厂牌的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(4?1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%磷钼酸乙醇溶液，在110?10分钟，立即检视，比较3个厂牌的结果，考察该检测方法的耐用性。 判定标准 对三个批号的强力脑心康胶囊样品样品采用三个厂牌的硅胶G薄层板重复测定3次，测定结果应一致，无明显差异。 第 13 页 共 15 页 图谱(照片) 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 标准品 成品1 成品2 成品3 厂牌2 厂牌1 自制 3.6 方法学验证结果 专属性实验 在本试验中，采用标准品溶液空白溶液与阴性样品一供试品溶液、成品样品供试品溶液在同一硅胶G薄层板上做斑点颜色对比，其他成份的存在，对其检测结果无干扰，空白样品与阴性样品没有相同斑点呈现，其专属性较高。 重复性实验 对3批强力脑心康胶囊样品连续重复测定3次，比较3次的结果。试验结果表明，3次的测定结果一致，无明显差异。 耐用实验 对3批强力脑心康胶囊样品采用三个厂牌的硅胶G薄层板连续重复测定3次，比较3次的结果。试验结果表明，采用三个厂牌的硅胶G薄层板的测定结果无明显差异。 3.7 结论 采用薄层色谱分析法对强力脑心康胶囊的主要成分密环菌提取物中的肽进行鉴别分析实验，实验结果表明此方法专属性高、重现性、耐用性好，实验结果准确。 第 14 页 共 15 页