尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因突变的研究现状

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因突变的研究现状 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因突变 的研究现状 l临床儿科杂志第25卷第5期2007年5月JClinPediatrVo1.25No.5May.2007 [J].Gastroenterology,1996,111(2):279—288. [28]张海兰,王练英.先天性肥厚性幽门狭窄卡哈尔间质细胞和突 触的免疫组织化学研究[J].中华小儿外科杂志.2003,24(1): 2O一22 [29]DielerR,SchroderJM,SkopnikH,el.Infantilehypertrophic pyloricstenosis:myopathictype[J].ActaNeuropatho1.1990,80 (3):295-306. [3O] [31] VanderxindenJM,LiuH,MenuR.et.Thepathologyofin— fantilehypertrophicpyloriestenosisafterheMing[J].JPediatr Surg,l996.31(11):l530—1534. SunWM,DoranSM,JonesKL,et.Long—termeffectsofpy— loromyotomyonpyloricmotilityandgastricemptyinginhumans [J].AmJGastroenterol,2000,95(1):92—100. (收稿日期:2006一l0一l8) ? 文献综述? 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因突变的研究现状 陈光榆吴建新李定国陆汉明综述 上海交通大学医学院附属新华医院消化科(上海200092) 摘要:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)基因突变可引起先天性高非结合胆 红素血症.现就UGT基 因突变研究现状进行综述,包括UGT基因的定位及结构,UGT突变与 Crigler-Najjar综合征I(CNI),Crigler— Najjar综合征?(CNII)和Gilbert综合征(GS)以及UGT基因治疗研究进展等.UGT 基因突变研究,将有助于先 天性高非结合胆红素血症的临床诊断和治疗.雎床JL科杂岙,嬲,:4?-_4J4J 关键词:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶;基因;高非结合胆红素血症 中图分类号:R394文献标志码:A文章编号:l000—3606(2007)05—4l1—04 NewconceptonUDP-glucuronosyltransferasegenemutationCHENGuang-yu,WUJian-xin,LIDing-guo, LUHart— ming(DepartmentofGastroenterology,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiflaotongUnlversitySchoolof Medwine,Shanghai200092,China) Abstract:Uridinediphosphoglucuronate— glucuronosyhransferase(UGT)genemutationisoneofthefactorscausing unconjugatedhyperbilirubinemiaThispaperreviewsthecurrentconceptandnewadvancesonUGTgenemutation,in— eludingUGTgenelocationandstructure,mutations;itsassociationwithCrigler— NajjarsyndrometypeI,Crigler—Najjar syndrometypeIIandGilbertsyndrome;andUGTgenetherapyNewconceptsrelatedtoUGTgenemutationmayimprove diagnosisandtreatmentofunconjugatedhyperbilirubinemia(_,C//nPtd/atr,2007,25(5):JJ卅) Keywords:Uridinediphosphoglucuronateglucuronosyhransferase;gene;Unconjugatedhyperbilirubinemia 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP.glucuronosyl— transferase,UGT)是非结合胆红素代谢的关键酶,它是一 个酶家族,存在于肝细胞,并与微粒体膜相结合.根据 UGT多肽链的氨基酸序列,可将UGT分为两大类,即 UGTI与UGT2t21.UGT1催化的底物有胆红素,酚等,其 中转化非结合胆红素为结合胆红素的酶称为胆红素-UGT (bilirubinUGT,B.UGT),UGT1基因突变可导致胆红素代 谢异常,在人类表现为先天性高非结合胆红素血症,如 Crigler—Najjar综合征和Gilbert综合征.Gunn大鼠也会出现 类似的高非结合胆红素血症.近几年,分子克隆技术的发 展推进了UGT1基因结构异常与功能改变的研究,人们已 开始利用现代分子学技术进行基因治疗的尝试. 1UGT1基因的定位及结构 人类UGT1基因定位于2q37.人类肝脏UGT1基因的 cDNA(HUG—Brl及HUG—Br2)长l469bp.UGT1基因的5' 端为UGT1第l外显子区域,有l3个可替换的第l外显 子(UGT1A)即UGTlAl,UGT!Al3【.其中,UGT1Al, UGT1A6序列已明确,分散于85kb左右的区域内,而另 外7个第1外显子,即UGT1A7,UGT1A13是通过基因文 库发现[31.在UGT1基因的3'端,有4个共同外显子 (commonexons,CE),即第2,5外显子,集中分布在 6kb的区域内.UGTl基因可以表示为:5'_UGTlAl3一 UGTlAl2……一UGTlA2一UGTlAl—CE2一CE3一CE4一CE5—3'. 启动子区域紧靠每个第l外显子转录起始点上游,即5'端 方向,包括TATA盒序列.在UGT1Al转录起始点ATG上 游一23,一38bD之间,为启动子的TATA盒序列,即 一 ATATATATATATATAA一,简写为A(TA)6TAA.正常野生 型纯合子为A(TA)6TAA/A(TA)6TAA,简写为6/6;而纯 合子患者为A(TA)7TAA/A(TA)7TAA,简写为7/7;杂合 ? 412?临床儿科杂志第25卷第5期2007年5月JClinPediatrVo1.25%.542007 子为A(TA)6TAA/A(TA)7TAA,简写为6/7[41.在特异性 内,外源性物质诱导下,转录因子与启动子结合而启动转 录.转录后通过剪接形成mRNA,其方式为每1种第1外 显子可与第2,5共同外显子总体分别相连接,形成多种 特异的mRNA,进而翻译成多种UGT1同工酶.第1外显 子编码UGT1氨基端功能区的286个氨基酸,决定UGTI 所催化底物的特异性,而第2,5共同外显子编码的是 UGT1羧基端246个氨基酸【.在第l外显子中,UGT1A2, UGT1Al1,UGT1A12是假基因,其功能尚未了解清楚. UGT1A1编码以胆红素为底物的UGT1(B—UGT);UGT1A2 , UGT1A5编码以胆红素样物质为底物的UGT1;而 UGT1A6,UGTIA9则编码以酚类物质为底物的UGT1. 大鼠的UGT1基因位于9q35一q36区带,小鼠的UGT1 基因位于1号染色体,两者与人类的UGT1基因结构具有高 度同源性.Emi等从野生型Wistar大鼠中分离克隆了UGT1 基因,他们的研究表明,UGT1基因结构大于120kb,内含 9个特异外显子和4个恒定外显子.特异外显子之间有近 lOkh长的间隔,可分为A,B两族,A1至A44个外显子 属酚族,Bl至B55个外显子属胆红素族. 2UGTl突变与先天性高非结合胆红素血症 迄今的研究发现,UGT1A1突变位点多达30多个,它 们分别位于启动子和5个外显子序列.外显子2,5出现 突变,将严重影响UGT1AI的转录和翻译,其UGT1A1产 物葡葡糖醛酸基转移酶严重减少或完全缺乏,患者表现为 Crigler—Najjar综合征I.外显子l出现突变后,UGT1Al的 转录和翻译水平虽有下降,但仍然具有一定量的UGT1A1 产物表达.此时,患者表现为Crigler—Najjar综合征?. Gilbert综合征(GS)的突变位点与上述两种不同,表现为正 常启动子重复序列A(TA)6TAA突变成A(TA)7TAA甚至 A(TA)8TAA,从而导致UGT1A1基因的转录,翻译水平下 降,产物减少.但也有研究发现,位于启动子和外显子3 的两个位点突变也可引起Crigler—Najjar综合征l.然而, 外显子1的突变,或外显子1和启动子两个位点突变均可 表现为Gilbert综合征.目前还未发现上述各种疾病存在固 定的相对应的特有突变位点.由此可见,这三种疾病在基 因水平上的变异有一定程度的共性,只是最终表达产物的 水平高低才决定了胆红素代谢异常的严重程度.因此,可 认为它们是同一个疾病不同的表现程度[51. 2.1UGT1与Crigler.Najjar综合征l(CN1)CNl为常染 色体隐性遗传,其特点表现为B—UGT活性表达完全丧失. 患者血清非结合胆红素>340p,mol/L,苯巴比妥诱导治疗 无效161.患者即使经过光照,输血制品等积极治疗,仍有大 量非结合胆红素进入脑组织,造成脑组织不可逆转的严重 损害,即核黄疸.患儿通常在出生后2年内死亡.CNI的 基因突变可以发生在第l外显子(UGT1A1),也可在第2, 5外显子.突变方式有以下类型:?错义突变,此种方式占 CNI的48%.突变发生的位点有:UGTIAl中第529位核 苷酸T—C(Cys177Arg),第826位G—C(Gly276Arg)【=;l;第 2外显子中第872位核苷酸C—T(Ala291Va1),第923位 G—A(Gly308Glu);第3外显子中第1070位A—G (Gln357Arg);第4外显子中第1102位G—A(Ala368Thr), 第l124位C—T(Ser375Phe),第1143位C—G(Ser381Arg), 第l166位CC—GT(Pro387Arg)I,第1201位G—C (Ala401Pro),第1282位A—G(Lys426Glu)等?无义突 变,发生的位点有:UGTIAl中第840化核苷酸C—A (Cys280X);第2外显子中第991位C—T(Gln331X);第 3外显子中第1005位G—A(Trp335X),第1021传C—T (Arg341X),第1069位C—T(Gln357X)16';第5外显子中 第1309位A—T(Lys437X)等"I:上述佗点突变后形成终止 密码子而中止UGT1的合成,产生无功能的,截短的蛋白 质.?移码突变,发生的位点有:UGT1A1中第80化氨 基酸密码子中插入4hp,第508位核苷酸缺失13bpI, 第470位氨基酸密码子中插入;缺失整个第2外显子; 第2外显子中第879位核苷酸缺失13bpt'1;第4外显子 中第1223位核苷酸插入GJ,第40,41位氨基酸密码子处 缺失CT等[61.?影响剪接位点突变,据Gantla等II的CNI 病家族遗传分析,人类有UGT1A1基因非编码的内含子区 域突变.例如在第1与第2外显子之间的内含子剪接供体 (splicedonor)位点G—C突变;在第3内含子的剪接受体 (splice.aeeeptor)位点A—G突变等:剪接位点的突变使 mRNA加工中剪接错误,从而使转录产物只能利用隐性剪 接部位,合成缺失片段的mRNA,不能正确指导合成有功 能的蛋白质[91. 2.2UGT1与Crigler—Najjar综合征II(CN?)CN?也属 于常染色体隐性遗传疾病,但患者无核黄疸,无智力障碍一 但也会发展为肝硬化.CN?患者体内B.UGT表达虽有明 显减少,但不消失(低于正常的10%),血清非结合胆红素 为60,340p,mol/L,苯巴比妥诱导治疗有一定效果llol— CNII的基因突变的部位在UGT1的第1,2,4,5外显子, 其突变类型有:?错义突变,发生的位点有:UGT1A1中第44 位核苷酸T—G(Leul5Arg),第524位T—A(Leu157Gln),第 625位C—T(Arg209Trp)I,第2l1位G—A(Gly71Arg)第686 位C—A(Pro229Gln)";第2外显子中第992位A—G (Gln331Arg),和Arg336Trp突变[31;第4外显子Arg367GlyI3l;第 5外显子中第1456位核苷酸T--*G(Tyr486Asp)等…其中最常 见的Gly7lArg和Tyr486Asp突变:研究认为,UGT1基因错 义突变类型为纯合子.(无义突变,位于第2外显子的 Gln331X突变 2-3UGT1与Gilbert综合征Gilbert综合征属常染色体隐 性遗传疾病,普通人群的发病率可达2%,19%l这类患 者的B.UGT活性轻度降低,血清中的非结合胆红素水平明 显低于CNl和CN?,一般在17,50p.mol/L,低于 60I~mol/L.虽然GS发病率较高,但由于血中非结合胆红 素水平在饥饿状态下仅高出正常人2倍多,并且肝脏的结 构和功能基本正常,因而患者生长发育和生理功能不受影 响.GS的UGT1基因缺陷有两种类型:?TATA盒TA插 入型.其遗传方式为常染色体隐性遗传,表现为UGT1AJ 临床儿科杂志第25卷第5期2007年5月JClinPediatrVo1.25No.5May.2007 的启动子TATA盒中有TA插入,从而使A(TA)6TAA成为 A(TA)7TAA=TATA盒因有TA插入而I芋列延长,其与转 录因子的结合能力下降,UGT1转录减少,从而使血清非 结合胆红素升高而发病I"I:UGT1Al的7/7基因型在白种人 多见一据调查,意大利,苏格兰及加拿大的人群中7/7基 因型约占l0%,l9%;6/7基因型占39%,5l%,其余为 6/6基因型一非洲黑人尚有6/5,7/5,6/8,8/8,7/8基 因型上述这些基因型在白种人及东方黄种人中极少II. 东方人7/7或6/7基因型少见,仅占人群的3%,5%.( 基因突变型.其遗传方式为常染色体显性遗传,为UGT1 基因错义突变杂合子,东方人GS多为此类型?日本,韩 国及中国CS患者主要表现为UGT1Al的第2ll位核苷酸 C—A突变,使7l位甘氨酸变为精氨酸(Gly71Arg)?I.其 他错义突变有UGT1Al的Pro229Gln,第4外显子的 Arg367Gly,第5外显子的Tyr486Asp突变等II. 3UGT1突变的基因治疗研究 3.1重组病毒导向性基因治疗除人类以外,啮齿类动物 中也存在UGT突变的情况,Gunn大鼠就是一例.Gunn大 鼠是Wistar大鼠突变的一个特殊品系.lyanagi经实验发 现,Gunn鼠UGT存在结构和功能异常,UGT末端150个 氨基酸缺失,UGT1Al基因第1206位单个尿苷酸突变,导 致终止信号过早出现.Gunn大鼠表现与人类CN同样的高 非结合胆红素血症,胆汁中无结合胆红素排出:Takahashi 等I『将携带人UGT1A1的重组腺病毒注入新生的Gunn大 鼠,第2天肝脏UGT活性就出现明显升高,其水平与正常 Wistar大鼠相近治疗l周,Gunn大鼠血清非结合胆红素 水平比对照组减少70%,76%,胆汁中测出结合胆红素. Toietta等『将经过改进的腺病毒运载人类UGT1A1DNA, 并将该腺病毒注射到成年Gunn大鼠.结果显示,只要一 次注射腺病毒剂量达到3×10/kg,Gunn大鼠结合胆红 素水平即可达到正常范围,并且至少可以维持2年.他们 对转基因后高非结合胆红素血症消失的大鼠作验证后发现, 原先缺失的葡萄糖醛酸转移酶基因已经出现于肝细胞中. 3-2肝细胞移植Matas在缺乏UGT的纯合子Gunn大鼠, 经门静脉注入杂合Gunn鼠肝细胞,结果显示,纯合子 Gunn大鼠血浆中胆红素水平降低50%Fox等I对l例 CNI患儿经超声引导穿刺门静脉输注同种肝细胞(7.5× 109),约占受体肝细胞5%.移植后7d,患儿肝脏出现B— UDP活性增高,达到移植前的l4倍.在此后4周的连续 观察期问,血胆红素降至l7l,256.5tzmol/L,胆汁中出 现结合胆红素同时,光疗也从移植前每天l2h减少至每 天6h:1年后该患儿血胆红素仍维持较低水平.另外,尚 有数例类似的研究报道.但是,这些研究出现的移植物抗 宿主反直,费用昂贵以及长期疗效不确定等问,使得肝 细胞移植治疗高非结合胆红素血症难于进入临床. 33定向基因修复Minnesota大学医学院的Kren等I1对 Gunn大鼠作了定向基因修复的研究,目标是在Gunn大鼠 UGT1Al的第1206位插入单个鸟苷酸(G),修复突变.他 ? 413? 们分别在体外和体内,将嵌合的DNA/RNA寡核苷酸导人 Gunn大鼠的肝细胞嵌合的DNA/RNA寡核苷酸中,DNA 片断长度为9个核苷酸,其中包含需修补的鸟苷酸,两端 各连接长度为l0个核苷酸的RNA片断,RNA片断与待修 复的DNA链互补配对相结合,保证基因修复定位的精确= 具体方法为将化学合成的该寡核苷酸与聚乙烯相结合或包 裹在阴离子的脂质体中注入静脉,使之与肝脏特异性的糖 蛋白结合.用PCR,DNA测I芋和Southen印迹等验证缺失 的鸟苷酸定向修复的结果.他们的研究显示,DNA修复是 特异和有效的,而且在6个月的观察期间始终呈现较好的 稳定性,所研究的Gunn大鼠血中非结合胆红素降低至实 验前的50%以下. 4小结 近几年的研究已经将UGT基因的结构和功能了解得比 较清楚.UGT基因突变类型较多,现在还不能确定哪些结 构异常决定了高非结合胆红素血症的临床类型:UGT结构 异常与功能改变之间关系的研究还需作更多的工作,以促 进实验性基因治疗真正逐步成功地走向临床: 参考文献: [1]PassonRG,HowardTA,ZimmermanSA,eto1.Influenceofbiliru— rubinuridinediphosphate—glucumn0syllransferase1Apromoter polymorphismsonserumbilirubinlevelsandcholelithiasisin childrenwithsickleeellanemiafJ1.JPediatrHematolOntol, 2001,23(7):448—451. [2]It0M,YamamotoK,MamoY,eto1.Effectofaconservedmuta— lioninuridinediphosphateglucuronosyhransferaseIAIand1A6 onglucuronidationofametaboliteofflutamide[J.EurJClin Pharmacol,2002,58(1):11—14. [3]ClarkeDJ,MoghrabiN,MonaghanG,eto1.Geneticdefectsofthe UDP—glucuronosyhransferase一1(UGTI)genethatcausefamilial non—haemolyticunconjugatedhyperbilirubinemias[J].ClinChim Acta,1997,266(1):63—74. [4]RaijmakersMT,JansenPL,SteegersEA,eto1.Associationofhu— manliverbilirubinUDP—glucuronosyhransferaseactivitywitha polymorphisminthepromoterregionoftheUGT1A1gene[J].J Hepatol,2000,33(3):348—351. [5]KraemerD,ScheurlenM.GilbertdiseaseandtypeIand?Crig— lerNajjarsyndromeduetomutationsinthesameUGT1A1gene locus[J].MedKlin(Munich),2002,97(9):528—532. [6]CiottiM,WerlinSL,OwensIS.Delayedresponsetophenobarbi— taltreatmentofaCrigler-Najjartype1Ipatientwithpartiallyin— activatingmissensemutationsinthebilirubinUDP--glucuronosyl?- transferasegene[J].JPediatrGastroenterolNutr,1999,28(2): 21O一213. [7]SappalBS,GhoshSS,ShneiderB,eto1.Anovelintronicmutation resultsintheuseofacrypticspliceacceptorsitewithinthecod— ingregionofUGT1A1,causingCrigler—Najjarsyndrometype1 [J].MolGenetMetab,2002,75(2):134—142. [8]RosatelliMC,MeloniA,FaaV,eto1.Molecularanalysisofpa— tientsofSardiniandescentwithCrigler-NajjarsyndrometypeI [J].JMedGenet,1997,34(2):122-125. ? 414? [9] [1O] [12] [I3] [14] 临床儿科杂志第25卷第5期2007年5月JClinPediatrVo1.25Nn.5May.2007 GantlaS,BakkerCT.DeocharanB,eta1.Splice—sitemutations:a novelgeneticmechanismofCrigler—Najjarsyndrometype1[J]. AmJHumGenet.1998,62(3):585—592. YamamotoK,SoedaY,KamisakoT,etlzf.Analysisofthebiliru— binuridine5'一diphosphate(UDP)glucuronosyhransferasegene mutationsinsevenpatientswithCrigler—NajjarsyndrometypeII [J].JHumGenet,1998,43(2):111—114. KadakolA,SappalBS,GhoshSS,eta1.Interactionofcodingre一 onmutationsandtheGilbert—typepromoterabnormalityofthe UGT1A1genecausesmoderatedegreesofunconjugatedhyper- bilirubinemiaandmayleadtoneonatalkernicterus『J].JMed Genet,2001,38(4):244—249. BeutlerE,GelbartT,DeminaA.RacialvariabilityintheUDP- glucuronosyltransferase1(UGT1A1)promoter:abalancedpoly— morphismforregulationofbilirubinmetabolism?[J].ProcNatl AcadSci.1998.95(14):8170—8174. MaruoY,NishizawaK,SatoH,eta1.Associationofneonatalhy— perbilirubinemiawithbilirubinUDP-glucuronosyltransferasepoly— morphism[J].Pediatrics,1999,103(6):1224—1227. AkabaK.KimuraT.SasakiA,et.Neonatalhyperbilirubinemia andmutationofthebilirubinuridinediphosphate??glucuronosyl?? [15] [16] [17] [18] transfer&segene:acommonmissensemutationamongJapanese, KoreansandChinese[J].BiochemMolBiolInt,1998,46(1): 21—26. TakeuchiK,KobayashiY,TamakiS,eta1.Geneticpolymorphisms smsofbilirubinuridinediphosphate—glucur0n0syllransrasegene inJapanesepatientswithCrigler—NajjarsyndromeorGilbert's syndromeaswellasinheahhyJapanesesubjects[J].JGas— troenterolHepato1.2004.19(9):1023一1028. ToiettaG.ManeVP,NoronaWS,eto-I.Lifelongeliminationofhy— perbilirubinemiaintheGunnratwithasingleinjectionof helper—dependentadenoviralvector[J].PNAS,2005,102(11): 3930—3935. FoxIJ.Chowdhu~JR,KaufmanSS,eta1.TreatmentofCrigler- Najjarsyndrometype1withhepatocytetransplantation[J].N EnglJMed,1998,338(20):1422—1426. KrenBT,ParasharB,ParamitaB,eta1.CorrectionoftheUDP一 glucuronosyhransferasegenedefectintheGunnratmodelof Crigler—Najjarsyndrometype1withachimericoligonuclertide [J].ProcNatlAcadSci,1999,96(18):10349—10354. (收稿日期:2006—05—22) . +??+一-t----t--一+一-t--一-t---+一-t--一+一+一-t----t--一+一+一+一+一+一+—卜一 +"+一—卜+一+一—卜一—卜"+一—卜一—卜*+一—卜一—卜"—卜一—卜一,- 卜"+一+一—卜—卜"+"—卜n—卜"+一—-卜一—'卜 《临床儿科杂志》征订启事 《临床儿科杂志》创刊于1983年,由上海市儿科医学研究所及上海交通大学医学 院附属新华医院主办,编委会由近200名 全国各地的着名儿科专家教授组成.本刊遵循面向临床,面向基层,面向全国,普及 与提高相结合的办刊宗旨,反映本学科学术水 平和发展动向.主要读者为全国二,三级医院的医务人员.除每期设一个系统疾病 专栏(包括呼吸,消化,神经,血液,心血管,.肾 脏,免疫,遗传,代谢,内分泌等系统),另设综合报道,儿童保健,实验研究,临床病理(例)讨论,疑难病例分析,文献综述,讲座,临 床经验点滴,误诊教iJll,临床用药,诊治技术,循证医学,继续医学教育等十余个专栏.附英文目录,主要论着附有英文摘要:本刊 自创刊以来,深受读者欢迎,自90年代起连续被评为临床医学类及生物医学类核心期刊,2000年起又被纳入国家科学技术部中 国科技论文统计源期刊,并被国际着名检索机构美国《化学文摘》,波兰《哥白尼索引》,俄罗斯《文摘杂志》收录. 本刊为月刊,2007年起改为每月15日出版,公开发行,每册定价7.8元,全年定价93.6元.邮发代号:国内刊号4-426,国外 代号M5788.本刊地址:上海市控江路1665号,邮编:200092,电话:(021)65790000—3406. 热诚欢迎新,老读者踊跃订阅.