铌_铬天青S与牛血清白蛋白结合反应及其应用

铌_铬天青S与牛血清白蛋白结合反应及其应用 铌2铬天青 S 与牛血清白蛋白结合反应及其应用 Ξ 陶慧林 , 朱仕毅 , 梁昊东 () 桂林工学院材料不化学工程系 , 桂林 541004 () 摘 要 : 探讨了铌2铬天青 S 配合物不牛血清白蛋白 BSA结合反应体系 。在 ( ) p H 4 . 6的邻苯二甲酸氢钾2NaOH Clark2Lubs缓冲溶液中 , 在 OP 存在下 , 铌2铬 天青 S 配合物不牛血清白蛋白进一步形成复合物 , 其最大吸收峰位于 595 nm , 且随着 BSA 量的增加 , 体系在 595 nm 波长处吸收峰也随着增大 。据此建立以铌 2铬天青 S 配合物为光谱探针 , 分光光度法测定蛋白质含量的新方法 。牛血清白 ε 蛋白含量在 0～0 . 32 mgΠmL 的范围内符合比尔定律 , 摩尔吸光系数为 4 . 4 ×595 5 - 1 - 1 γ10Lm?ol c?m , 相关系数为 = 0 . 9996 , 生物体内的常见物质基本上不干扰 测定 , 方法可用于人血清蛋白中蛋白质的测定 。 ( ) () 关键词 : 铌2铬天青 S CAS配合物 ; 牛血清白蛋白 BSA; 光谱探针 () 中图分类号 : O657. 3 文献标识码 : A 文章编号 : 100020720 2009102053203 ( )蛋白质是生物体内一切组织的基础物质 , 幵晶 体 , 用 011250 g 牛 血 清 白 蛋 白 BSA 叏 (在生命现象和生命过程中起着决定性的作用 。随 0105 molΠL NaCl 溶液溶解幵稀释至 250 mL 置 1～ 着人类基因组项目的完成 , 蛋白质的分离和测定 ) ( ) 4 ?保 存 ; 铌 ?标 准 溶 液 : 100 mgΠL 。称 叏 方法的研究也逐渐增多 , 测定蛋白质的主要方法 ( ) 0 . 1431 g NbO光 谱 纯 于 铂 坩 埚 中 , 加 入 4 g2 5 1 有 : 分光 光 度 法 、荧 光 法 、电 化 学 方 法 等。目 K S O , 于 730～750 ?马弗炉中熔融 30～40 min , 2 2 7 前 , 金属配合物作为蛋白质光谱探针的研究因其 () 叏出稍冷 , 以 40 gΠL 热的 NHCO溶液浸叏 , 4 2 2 4 2 ～6 具有灵敏度高 , 抗干扰力强已引起关注。而铌幵转 移 到1 L 容 量 瓶 中 , 冷 却 后 以 40 gΠL 2铬天青 S 配合物不蛋白质作用至今未见报道 , 本 ) (NH C O 溶 液 稀 至 刻 度 , 摇 匀 , 此 液 含 Nb4 2 2 4文収现 , 在 p H 4 . 6 的邻苯二甲酸氢钾2NaOH 缓冲 ) (100 mgΠL 。分叏储备液用 40 gΠL NHCO逐级 4 2 2 4 介质中 , 在 OP 存在下 , 配合物随着 BSA 加入量的 μ( ) 稀释成 2gΠmL 的工作液 ; 铬天青 S CAS: 210 ×增加其吸光度呈线性增大 , 据此建立了以铌2铬天 - 3 ( )10 molΠL 水溶液 ; 邻苯二甲酸氢钾2NaOH C2L 青 S 配合物为光谱探针 , 分光光度法测定蛋白质 缓冲液 : p H 416 ; 乳化剂 OP : 2 gΠL的水溶液 。含量的新方法 , 该方法灵敏度高 , 选择性好 。 1 . 2 实验方法 1 实验部分 在 25 mL 的 比 色 管 中 , 依 次 加 入 115 mL 的 1 . 1 仪器与试剂- 3 μ) ( 210gΠmL Nb ?标 准 溶 液 , 415 mL 210 ×10 ( TU21901 双光束紫外可见分光光度计 北京普 molΠL CAS 溶液 , 610 mL p H 416 的 C2L 缓冲溶液 , ) ( 析通用仪器公司; 电子天平 上海精密科学仪器 410 mL 的 OP 溶液及一定量的蛋白质溶液 , 用 ) ( 公司; PHS23C 型 酸 度 计 上 海 精 密 科 学 仪 器 公 蒸馏水稀释至刻度 , 摇匀 。5 min 后以相应试剂空 ) 司。 白作参比 , 于分光光度计上的 595 nm 处 , 用 1 cm(蛋白质标准溶液 : 牛血清白蛋白 BSA , 分子 ) 比色皿 , 测定铌2铬天青 S2蛋白质结合物的吸光度量以 67000 计 , 上海化学试剂公司, 0150 gΠL 。称 Ξ 收稿日期 : 2008210229 ; 修订日期 : 2009201220 () 基金项目 : 广西教育厅科研 桂教科研 2007 34 号项目资助 () 作者简介 : 陶慧林 1961 - , 女 , 副教授 ; E2mail : taohuilin @glite . edu. cn 第 28 卷第 10 期 Vol . 28. No . 10 分析试验室 2009 年 10 月2009 - 10 Chinese Journal of Analysis Laboratory 值 。, 同时 BSA 在一定范围内有体系有较高的灵敏度 2 结果和讨论良好的线性 , 所以必须同时考虑 Nb 和 CAS 的影 - 3 2 . 1 吸收光谱响 。实验表明 , 当浓度为 210 ×10 molΠL CAS 溶 μ 按实验方法操作 , 绘制吸收光谱 , 结果如图 1液用量在 410 ～ 610 mL , 2 gΠmL Nb 溶 液 用 量 在 ) ( 110～210 mL 时体系的 A 值最大且基本不变 , 幵且 所示 。在 p H 4 . 6 C2L 缓冲溶液中 , Nb ?2CAS 配 合物最大吸收峰为 530 nm 。当往配合物溶液中加 体系具有良好的线性 , 同时収现铌标准溶液用量 入 BSA 后 , 最大吸收峰为 595 nm , 红移 65 nm , 说大于 310 mL 时体系易产生沉淀 , 而 CAS 溶液用量 ) ( 明 Nb ?2CAS 配合物进一步不 BSA 结合形成复 大于 610 mL 时 , 体系的 A 值会下降 。因此分别选 ) ( 合物 , 且吸光度随 BSA 浓度的增大而呈线性增加 。 叏上述 CAS 溶液 415 mL 、Nb ?溶液 115 mL 。 因此实验选择测定波长为 595 nm 。 2 . 2 . 3 反应温度和时间 在不同温度下进行显色 反应 。结果表明 , 在 15～35 ?范围内 , 体系的吸 光度值基本保持不变 , 故选择在室温下进行 , 配 合物不 BSA 的结合反应在 5 min 内反应完全 , 体系 吸光度至少稳定 115 h 以上 , 说明该体系反应较快 且有很好的稳定性 。 2 . 3 工作曲线及方法的灵敏度 实验表明 , BSA 的含量在 0～0132 mgΠmL 范围 ε内符合 比 尔 定 律 , 方 法 的 摩 尔 吸 光 系 数 = 595 5 - 1 - 1 414 ×10Lm?ol c?m , 相关系数 r = 019996 , 检 出图 1 吸收光谱曲线 7 限为 0107457 mgΠL 。 Fig. 1 Absorption spectra ( ) 1 - Nb2CSAΠCAS 溶 液 ; 2 - Nb2CAS2BSA 110 mg2OPΠNb2 2 . 4 共存离子的影响 ( ) CAS2OP 溶 液 ; 3 - Nb2CAS2BSA 210 mg2OPΠNb2CAS2OP 溶 () 在实验条件下 BSA : 210 mg, 考察了常见离 () 液 ; 4 - Nb2CAS2BSA 410 mg2OPΠNb2CAS2OP 溶液 子和有机物对体系的影响 。结果表明 , 下述离子 ( ) 或有机物对应质量浓度 mgΠ25 mL 下不干扰测定2 . 2 反应条件的选择+ 2 + (( ) ( ) )K相 对 误 差 ? ?5 %: 150 、Mg01080 2 + 2 . 2 . 1 介质酸度 实验了各种不同酸度的缓冲溶 3 + 2 + ( ( ( ) ) )Ca715 、 Fe01025 、 Pb01065 液对体系的影响 , 包括六次甲基四铵2HCl 、柠檬酸 2 + 2 + (() ) () Mn0106、Zn210、维生素 C 112、葡萄糖 2磷 酸 氢 二 钠 、醋 酸2醋 酸 钠 、邻 苯 二 甲 酸 氢 钾2(( ( ( ) ) ) ) 115、尿素 110、淀粉 115、柠檬酸 210, 氨 NaOH 等 , 实验结果表明在 p H 415～418 的 C2L 缓 基酸对测定基本没有影响 。 冲溶液中体系的吸光度值较大 。进一步的试验还 2 . 5 样品分析 表明 , C2L 缓冲溶液的用量在 510～615 mL 时 , 体( ) 叏人血清样品 桂林医学院附属医院提供用 系的 A 值较大且基本不变 。实验选用 p H 416 的 C2蒸馏水稀释 250 倍 , 摇匀后即为待测溶液 。叏适量 L 缓冲溶液 610 mL 。待测液于比色管中 , 按实验方法操作 。样品分析 ) ( 2 . 2 . 2 铬天青 S 和铌用量的影响 Nb ?不 CAS结果列于表 1 。同时对样品进行标准加入回收实 ( ) 在 OP 存 在 下 形 成 配 合 物 图 1 。本 研 究 以( ) 验 , 其回收率在 9513 %～10610 % n = 6之间 。 ) ( Nb ?2CAS配合物作为蛋白质的光谱探针 , 为使 表 1 样品分析结果 Ta b. 1 Analytical results of sa mples 本方法测定结果 推荐值 样品 Π% RSDρ()ΠgΠL ρ(()ρ)测定值 ΠgΠL 平均值 ΠgΠL 66. 02 63. 02 63. 55 65. 76 65. 45 66. 85 68. 18 65. 47 3. 0 血清 1 72. 12 69. 45 72. 20 74. 00 74. 85 75. 25 75. 85 73. 60 3. 3 血清 2 注 : 推荐值为桂林医学院附属医院检验科提供 () 23 6: 1197 参考文献 石 展 望 , 赵 林 , 李 舒 婷.5 分 析 测 试 学 报 , 2006 , 1 () 杨 睿 , 刘绍璞. 分析化学 , 2001 , 29 2: 232 () 25 1: 61 ( ) 2 刘典梅 , 李舒婷 , 赵书林. 分析化学 , 2004 , 33 2: () 6 陶慧林 , 徐金明 , 周红霞. 分析试验室 , 2007 , 26 7: 187 116 ( 3 林秋月 , 冯 洁 , 巩菊芳. 浙江师范大学学报 自然 罗庆尧 , 邓延倬 , 蔡汝秀等. 分光光度分析. 北京 :7 ) () 科学版, 2003 , 26 2: 53 科学出版社 , 1992. 167 4 李 卓 , 曹 建 明 , 连 国 军 等. 光 谱 实 验 室 , 2006 , ) ( Determination of serum protein by chrome azurol S2Nb complex spectral probe? 3 (TAO Hui2lin , ZHU S hi2yi and L IANG Hao2dong Department of Material and Chemical Engineering , Guilin Univer2 ) () sity of Technology , Guilin 541004, Fenxi Shiyanshi , 2009 , 28 10: 53～55 ) () ( Abstract : The interaction between chrome azurol S2Nb ?and bovine serum albumin BSAwas investigated. In a ( ) p H 4 . 6 C2Lbuffer solution , with the increase in BSA concentration , the absorption peak at 595 nm increase strik2 5 - 1 - 1 ingly. The molar absorptivity is 4 . 40 ×10Lm?ol c?m . Beer′s law was obeyed in a range from 0 to 32 mgΠmL . A ) ( spectrophotometric method for the determination of protein was established by using CAS2Nb ?complex as a spectral probe . The proposed method was applied to the determination of albumin in human serum albumin , and the results were in agreement with certified values. Recoveries of the standard addition for BSA were 95 . 3 %～106 . 0 % with ( ) RSD less than 3 . 3 % n = 6. Key words : BSA ; CAS2Nb Complex ; Spectral probe