抗心磷脂抗体的检测

抗心磷脂抗体的检测 7O(总230)《釜础医学与临床》l994年第”卷第3蛐 7D~1(P抗心磷脂抗体的检测 .z 燃” (首都医学院附属北京友谊医院北京市临床医学研究所病理生理研究室,北京100050) ,摘要-本文介绍一种检测ACA的ELISA方法.该法重复性好.特异巨强敏感性高,方法简 便.144份正常人血清BI的x+2SD作为正常值上限,其~IgG-ACABI为2.36.IgA—ACA为2.06, IgM-ACA为2.6SLE和RA患者ACA阳性率(46和36牺)明显高于正常人群(3.5牺.P< 0o06).SLE患者申各类ACA检出阳性率为IgG44~.IsM3G,IgA22牺.因此,ACA值可作为 SLE和RA的辅助诊断指标和抗磷脂综台征的诊断依据}也可作为临床上预涮血栓形成趋势的危 险标志. 关键词.抗磷脂抗体抗心磷脂抗体系统性红斑狼疮 近年发现,抗磷脂抗体(antiphospho— lipidantibodies,APA)是一种针对血小 板和内皮细胞膜上阴电荷磷脂的自身抗体, 其中主要包括抗心磷脂抗体(anticardioli— plnantibody,ACA)和狼疮抗凝物(1u— pusanticoagulaat,LAC)c,4].该抗体 在系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节 炎(RA)等结缔组织病中有较高的检?率, 更因其与血栓形成的密切关系而受到医学界 的关注.1983年以来,检侧AcA的放射免疫 法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)的桷继 建立促进了对该抗体的研究c.鉴于国 内相关的研究工作刚起步,检测工作的报道 较少,本文介绍一种检测ACA的问接ELISA. 材料和方法 一 ,观察对象 结缔组织病患者64名,为本院确诊病 人.其中sLE50例,均符台1982年ARA诊断 标准,年龄17~60岁}RA14例,符台1987 年ARA修订的诊断标准.正常人144名,男 女备半,年龄20~50岁, ?北黻谊医院血{羲室 ??北京医院老年医学研宽所免疫宣 酶联免疫吸附法LEELJs4 二,ACA的ELISA检测c.,T 心磷脂(cardiolipinJCLISigma) 以无水乙醇稀释至50Pg/ml,用30l/孔包被 96孔聚苯乙烯板(简称微孔板ILinbro), 4~C无盖过夜蒸发干燥.每次包三块微孔板, 分别检测IgG,IgM,和IgA三类ACA.洗 液(0.O1MPBS,pH7.2)洗板(4次,3分 钟/次,下同).每孔200~110新生牛血 清N~S/o.01MPBS(封闭液),置25?,2 小时,洗板.每孔100~1用封闭液1;l00稀 释的待测血清,每份样本均傲2复孔}每块板 均设空白,阴性,阳性及参考血清对照.置 25?,1/1,时,洗板.用封闭液分别稀释辣 根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1:2000), Igh(1I1000),IgM(1lGO00),每孔 100Pl,置2YC,1/b时,洗板.每孔100Pl 邻苯=胺一H-Ol底物溶液,避光,25?, 10分k2M硫酸(50l/孔)终止反应.在 492nm波长下用酶标测读仪(Bio—Rad)测 定OD值. 三,重复性试验 组内重复,印同一样本在同一微孔板上 ? ? I 《釜础医学与临床》1994~第l4卷第3螭 进行多个复孔(20)测定j组间重复,同一 样本在不同时间重复测定(间隔5个月), 每次均做20个孔,比较两次变异. 四,特异性试验 1.心磷脂抑制试验:在氮气流中蒸发 CL溶解液中的乙醇,加入PBs,超声混悬, cL浓度为12~500Pg/ml.将各种不同稀释 度~jIgG-ACA性血清与等量的CL悬液混 台,置2YC孵育1小时,4?振荡过夜.不同 稀释度的上述阳性血清与等最不含CL~PBS 混合做为对照.取悬液傲ELISA,均做三复 孔. 抑制率(嘶) :×loo%一阳性血清吸附前OD 2.DNA抑制试验:浓度为5OOg/ml的 dsDNA和ssDNA与等量各种不同浓度的IgG — ACA~H性血清混合,其余步骤同CL抑制试 验. 五,参考血清与结台指数(Bingding Index,BI) 参考血清;取6O份正常人阴性血清,混 f1(总?1) 台,分装,一8O?冻存.每一微孔板均设三 复孔|取其0D均值. 结合指数(BI) 一兰查9D-室自B 一参考血清OD一空白对照OD 结果 一 ,正常值上限的确定和AcA阳性率 经D一检验发现所测定正常人ACAOD值 呈偏态分布,但因正常血清样本大,故仍可 按均数加标准差(x+SD)确定正常值上 限.本实验采用ACA的BI记录实验结果. 正常值上限为BI的x+2SD,144份正常人 山清中I#-ACABI正常值为.2.35.IgA— ACA为2.06,IgM—ACA为2.超过者为阳 性. 144名正常人AcA阳性率为3.5%.50倒 SLE病人中23例ACA阳性(46%),各类抗 体的检出率为IgG44~,IgM3o%,IgA22% (表1).14例RA病人中,ACA的阳性率为 35%. 裹1部分文蠢中AcA的曩I定方法曩其数据资料 正常值上限SLE病人的ACA阳监率() 文献方法对厢(_+ns总体(Tol’1)IBGgMIgA NoNoNo 往释:THIs一本研究;一95可信阻 一 平均数ISD一标准盖; 90位; n一倍数,#一因文献豢目所眼,教此取代. 』 一 地地,,,,一,, 玎=.m舳,,,,,, 27’070.: ?=昌锄?,,, 日2日O30.?,,,, ???柚,,,, ;言一着. ;,温度对实验结果的影响t不同稀释 《基础医学与临床》1994~第l{卷第3靳 度的刚性血清分别于2225和37~C下进行 ELISA测定.结果表明,22~(3和25~(3时所得 结果较37?时高,37%时所得OD值显着下 降.实验温度对IgG检测的影响大”:l=IgM. 讨论 抗心磷脂抗体是一种多克隆自身抗体, 常见于结缔组织病?”,因其参与病人血液 高凝状态的形成而受到重视cu.研究发 现,ACA与未明原因的血栓栓塞现象,如 动,静脉血栓形成,中风,习惯性流产,血 小板减少症等密切相关}临床上把与之 相关的一组临床症状称为抗磷脂综合征(a?_ tiphosph0lipidsyndrome,APS)~11?.因 此,ACA是APS的必要诊断依据. 本实验结果表明,SLE和RA病人的ACA 阳性率(46,和35)弭显高于正常人群 (3.5).对TSLE和RA,ACA虽无特异 诊断价值,但可作为一项有意义的辅助诊断 指标.文献中,SLE患者的ACA~I性率为2l , 83.9c.除实验方法和样本选择的 差91#b,导致这种差异的原因可能还有以下 五个方面:(1)正常值上限的定界不同, 正常对照组的平均数(x)加2SD到5SD不等 (表1)}(2)正常对照组样本大小不一I(3)所 选择病人的临床和血清学标准不同}(4)缺少 统一的测定单位,因而不利于各家研究结果 的精确对比j(5)所测定的Ig类别影响总体阳 性率.1986年召开的ACA国际会议确定了标 准的实验程序,但并未制定统一的正常值上 限.本实验采用国际会议认可的标准实验程 序测定了144名正常人,并把BI均教加2个标 准差作为正常值上限,测定了IgG,IgM和 ~gA---类抗体.尤其是BI作为测定单位,避免 了因操作过程和实验条件的变化所造成的批 间差异.由于正常人ACAOD值里偏态分布, 本实验通过加大正常人样本量使ACAOD值 趋于正奄分布,提高了x+2SD所袭示正常ff[ 的准确性和可信性.因此.本实验所得结果 牡挈;由孥’Y ? ? 《基础医摹与临床》1984~第1卷港3抽 是相对准确的. 据文献报道和本实验证实c”,在ACA 的ELISA检测中,不同温度下的实验结果 不同.这可能是由于温度升高使磷脂由极性 片层状结构转变成六边形H?型结构,而后者 与ACA亲和力低.血清中的糖蛋白协同因子 (B.一糖蛋白I)能与阴电荷磷脂结台,是 ACA与CL结台所必须的[1.因NBS 中含有大量B:一糖蛋白I,故10NBS的封 闭效果比1BSA好,尤其是毹更好地阻断 73(总233) 正常人血清的非特异性结台. 鉴于ACA与血栓形成的密切关系,临床 上对于未明原因血栓形成的患者,应考虑到 ACA的存在,ACA可作为一项血栓形成趋势 的预.侧指标[‘,.因此,ACA的ELISA检 测为研究ACA与血栓形成的关系以及APS 和结缔组织病的诊断提供了重复性好,敏感 性高,特异性强,简便易行的理想的实验 方法. 参考文献 1.ChsrlesMY.Antipho.pholipi+antibodies: more|hB?iuBt?d1?5BmarkerfImm_nology Today19901II(2):6O 2.Loi=ouSJsta1.Me~satemeatofsatl—心礴脂抗体在系统性红斑靛癌的临床 意义.中华内科杂志1988;28:78 B.C:oalaME-etEI. IgGtndIgM?tjc?rdioliPin ~ntlbod:.Bipatlen【swithlupusassociated with~liaioaIByndromee . JRheama|ol 1988115:705 7.MaaoussaklsMN-etI1. Anti0&rdiOnPin8n- tib0di08ia11n$elcotedanti/mmunrhe?mBtia1 disetB0pttients. CliaInoI1mmunopatho 19871??:207 8.ColacoCBJat4】. AnIiPhOsph0Iipidantlbo— diesia.yphilis~ad&thtombottaaabsotof SLE:distiuetprafilesofopitopospeoi~iolty. CIinEPI1~IRI1lloI1986;59:4?0 9.LoakshinMD,eta1. ISGbutnotIgManti— phosphoIipid4ntibodlosbiadiagistemporx— tn邝dependent. JCJi?Immnnol1988;8:199 lO.M.NellHp,etIJ. AnIipho.ph0IipidBntib dise?ddlrected日Eiast?campJez412rigaj thatin~ludes4lipid—hi4di”giahibltorof coagulation:Bl—gla~aproteiaI(apollpapro- teia).Pro0NatlAcadsciUSA1990;87: ?120 4(总234)《基础医学与临床》199?年靠”卷s霸 TheDeterminationofAnticardi0lipinAntibodies LiChuanyuLiuGuijianXuYougLiulunda (Depsrtmen’ofPathopbyeiologyJResasreh[nstitGtoofClinicM0dicine’Baijing Frlnadf~ig~losflltti) Quantitativedetermi~tionofanticardioliplnantibodies(ACA)wasperformed with4highlyspeclflC,sensitiveandreproducibleELISAmethod.Experimentalre-- suhsshowedthatthepercentageofinhibitiofcard/oliplnblndingactivityto ACAamoLIDtSto90,Bindingindex(BI)variationwaslessthan4%intra—as say and8%inter—assay.RcsultswereexpressedasaBIinsteadofoptiealdenslty(OD) foreompensationoftheariatiOi2duetochangesofconditlOIlSandprocednre8in theexperiments.Theaveragevalue(i)ofBIplUs2standardderivatlon(SD)in 144healthyindividualsasdefined40theupperllmnof口 0rmalrathe.Thenormal value(~+2SD)ofIgG-,IgA—andIgM-ACABIis2.352.06,and2.6respectiv ely.The prevalenceofACAinthepatientswithSLEandRA(46and35%)iehigherthan thatofnormalladividuals(3.5%.P<0.05).50patlehtswithSLE,theACA positiverateofIgG,IgM,andIgAIs44,30,and22%respectively.Thiestu— dyconfirmsthatACAmayact4$theassistantfactorfoldlagnosisofSLEand RAandtheuecesearilydiagnosticbasisofAPS. ThepresenceofACAimplicates theriskofdevelop/ngthrombosisclinically. Keywords_ tiph0sPho1Pidantibody(&PA)antieardiollpinantibody(ACA)eystemi ~ iapnserythBmttOSgB(SLE)e?zyme—linkedimmanosorbe?t?By(ELISA) f , , ,