【doc】长期使用十一酸睾酮抑制大鼠睾丸和附睾的雄激素受体基因表达

【doc】长期使用十一酸睾酮抑制大鼠睾丸和附睾的雄激素受体基因表达 长期使用十一酸睾酮抑制大鼠睾丸和附睾 的雄激素受体基因表达 ?l52, Reprodnction&Conlraceptim~(1599)19(3):l52,l57 f一'』 长期使用十一酸睾酮抑制大鼠睾丸和附睾 的雄激素受体基因表达R772,f 贾孟春刘德确/吴燕婉陈馨莲周丽瀛曾陶张桂元,,———,,——, (国家计划生育委员会科学技术研究所,北京,100081) , 本研竞探讨十一酸辜酮抗雄性太鼠生育的机制.l2周龄雄性SD大鼠,给药组8只每 2周注射20mg/kg十一酸睾酮,共3个月.与10只对照大鼠比较,十一酸辜酮处理太鼠 辜丸罔液中精于密度下降到对照组的7,附辜尾部精于活动力下降至对照组的6,血清 辜酮水平上升至对照组的255蜗,而辜丸网液辜酮却下降至对照组的55.两组之间均有 非常显着差异.未发现十一酸辜酮处理大鼠辜丸生殖细胞和附辜上皮细胞凋亡状况有明显 改变,但辜丸和附辜的雄激素受体基因表达豆着低干对照组太鼠十一酸辜酮抑制辜丸精 于生成和降低附辜精于活动力可能与辜丸罔液的雄激素水平下降以及辜丸和附辜雄激素 外桃制张,盘帕 关键词;十一鳗睾酿;苎避;攀望童里蔓聚合酶链反应 长效睾酮(T)是一种较为理想的男性避孕 药,它不象LHRH类似物或孕激素需要补充雄 激素以维持性欲和性功能,以避免长期缺乏雄 激素的副作用WHO(1990)组织了由7个国 家,1O个中心进行的多中心研究,217名健康生 育年龄的男性每周肌内注射200mg庚酸睾酮 (TE).在注射TE的l2个月中,157名男性成 为无精子症;在1486个有效月中仅有i饲妊娠 (O.8/too人年)0].十一酸睾酮(TU)是我国 研制的一种长效睾酮制剂,单剂可以维持药效 60d左右.是一种有前景的男性避孕药.目前, 国家"九五"攻关课题组与WHO人类生殖规 划署和其他国际组织台作正在开展十一酸睾酮 抗生育作用多中心临床研究.人们对睾酮抗生 育作用机理的了解尚不够全面与深入.Kunth 等n认为,超生理剂量的T通过抑制垂体促性 腺激素FSH和LH及睾丸.中睾酮的分泌,从而 破坏了精子发生所依赖盼具有高浓度睾酮的曲 细糟管内环境,导致精子发生障碍.张桂元 等r"在TE诱导的无精子症及少精子症者的 观察中发现.给药后3,12个月.血清中FSH 和LH水平下降,而T升高176%,195}给 药120d后,全部受试者达到无精子症.现在的 问题是.由于外源性给予长效T引起血中T 水平升高的情况下,睾丸内,特别是睾丸网液中 T浓度下降到何种程度尚不清楚.本研究欹观 察给大鼠注射Tu后,血和睾丸网液中T的浓 度和对精于生成的影响 张桂元等0发现给人注射TE,血中促性 腺激素水平下降缓慢,精子活力略有下降.带泡 滴小体的精子稍有增多,但均维持在正常范围 内,而此时精子多元运动速度指标,人精子穿透 击透明带地鼠卵试验和精子爬高等精子功能全 面受损.众所周知,精子运动能力,特别是前向 运动力是在附睾内获得的,因此推测TE影响 刊附睾成熟精子的功能.本实验欲检测给予 一——————— 4—————————————一————?潮菇i Tu后附睾尾部精子的活力. 雄激素通过靶细胞上特异性雄激素受体 (AR)发挥作用.Luhahn等首先报遭,阉割24 h后大鼠前列腺的雄激素受体(AR)的 mRNA表达增加+注射T可阻止这种作用, 表明在前列腺,雄激素引起ARmRNA的降调 节作用Eel.B]ock等E的实验结果显示+在未成 熟大鼠Sertoli细胞的培养液中,加入FSH72 h导致ARmRNA的表达增多,但是加入T井 未显着改变ARmRNA的表达.本研究还欲 观察给予大鼠Tu后.在睾丸和附睾内AR mRNA的表达情况. 与方法 一 ,研究动物,给药方法及剂量+取材 l8只l2同龄雄性SD大鼠(200~250g), 由本所动物室饲养,控制室温(20?,24?)和 光照条件下,自由进食和饮自来水,分为给药组 大鼠8只,对照组大鼠l0只.十一酸睾酮 (Tu)针剂由浙江仙居制药股份有限公司提 供,每支250mg,由精制荼油配制.给药组大 鼠每2周一次在大腿内侧肌肉处注射Tu,每 次注射2Omg/kg,共3个月.lO只对照大鼠注 射安慰剂(即精制茶油).末次给药2周后,取 睾丸网液.从眼眶取外周血测定睾酮,并且取另 一 侧睾丸和附睾组织,一部分组织迅速用液氨 冷冻,提取睾丸和附睾的总RNA,另一部分组 织经脱水,固定后,做石蜡切片,用ApopTag 药盒(OncorTechnicalAssistance,USA)观 察细胞凋亡状况. 二,睾丸同液采集,睾丸同液中精子敷,附 睾尾部精子活力测定 束次给药后2周,用3戊巴比妥钠溶液 (30mg/kg)麻醉大鼠.在离睾丸3mm处,结 扎睾丸输出管.18h后,麻醉状况下,按照吴蟪 婉等人】采集睾丸网液的方法在双筒解剖镜下 暴露出睾丸输出管,去除管周围脂肪.将直径大 约为300gm的聚乙烯管插入输出管,导管的 另一端接蠕动泵,可以收集1001左右睾丸网 液,取5l用生理盐水稀释2O倍,用白细胞计 ? 153? 数板作精子计数,其余睾丸网液2500g离心5 20?,待测睾酮.同 min,去除精子后储存在-- 时取下附睾,从附睾尾部挤出精子,用生理盐水 稀释后在倒置显微镜下观察精子活力. 三,睾酮测定 采用wHO提供的RIA配对试剂,严格按 操作进行.所有标本集中在同一批实验中 进行,批内误差为7.2. 四,睾丸和附睾生精细胞凋亡状况的观察 在末次给药后2周,取给药组和对照组大 鼠睾丸和附睾做石蜡切片.用ApopTaq药盒 观察生精细胞和附睾上皮细胞凋亡状况.其基 本过程为:地高辛一ll—dUTP和dATP在末 端去氧孩苷酸转移酶(TdT)的催化下.标记 DNA片段3'_OH末端,然后加入交联碱性磷 酸酶的抗地高辛抗体,最后进行常规碱性磷酸 酶组织化学反应,凋亡细胞呈紫红包. 五,用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR) 方法测定睾丸和附睾组织雄激素受体(AR) mRNA (一)提取总RNA 末次注射Tu后2周取睾丸和附睾组织, 立即在液氨中冷冻,按照Chomczymakl等的异 硫氰酸胍一酚一氯仿一步法提取睾丸和附睾组织 总RNA+方法简述如下,100mg新鲜睾丸或附 睾组织,加入lml含0.8二巯基乙醇的4 mol/L异硫氰酸胍(pH7.0),匀浆后加入0.1 m12mol/L,pH4.0醋酸钠,lml水饱和酚和 0.2ml氯仿:异戊醇混合液(24}1).冰浴l5 min,l0r000g,4?离心20rain+取水相加lml 异丙醇置在一20?冰箱中2,3h,10+000g, 4?离心20min,用75乙醇洗2次+最后沉 淀物溶于50l焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的 水中. (二)RT—PCR 首先以睾丸或附睾组织中提取的总RNA 作为模板反转录合成eDNA第一链,取5l总 RNA(10g)加入ll(100.gt~1)的雄激素 受体(AR)或9一肌动蛋白(0一actin)反义引物 和9l高纯水,在65?1;孵育5min,室温下 r ___丁厂———————————_ ?154? 孵育10min加入1.5l(10#g/.u1)AMV反 转录酶(Promega),5ul5倍反转录酶缓冲液, 11RNAsin(Promega,RNA酶抑制剂),25 1dNTPs(10mmol/L),轻轻混匀后,在42? 下孵育1h,然后取5l合成的cDNA,加入2 plAR引物(正义引物5'GTGGAGTTG TGAAcAGAGTCC3'和反义引物5'GCC TTCAATGTGTGATACAGTC3,预期片 段大小为485hp)和月一act[n引物(正义引物 5,GTGGGCCGCTCTAGGCACCA3'和 反义引物5'CGGTTGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG3',预期片段大小为245bp),10 10倍缓冲液,5ldNTPs(10mmol/L),10 lMgC12(15mmol/L),1l(5g/1)AMP TaqDNA聚合酶(Promega),加水使总体积为 100/al,覆盖矿物油.首先在95?下孵育5min, 在室温下冷却5mln,然后用PCR仪(Perkin ElmerDNAThermalCycler48O)进行扩增, 扩增的周期为95U1min,54?1mln,72? 2min共35个周期,最后在72?下孵育l0 min,然后冷却至4?.同时作8一actin的RT- PCR的目的是标准化RT—PCR的合成量,作 为RT—PCR扩增系统的对照. (三)电脉 取10ulRT—PCR反应最终产物,走琼 脂糖凝胶电泳,用Bio—Rad制造的光密度扫 描仪(Bio—Rad,ModelGs一1O0Imaging Denshometer)测定电泳凝胶上AR和月- actin条带的光密度,然后利用电脑分子分析软 件(MolecularAnalysisSoftware)转换为数 据 结果 (一)十一酸睾酮(TU)组大鼠睾丸网液 中精子计数,附睾尾部精子活力,血中和睾丸网 液中T浓度与对照组之间有非常显着差异(见 表).TU处理大鼠睾丸网液中精子密度下降到 对照组的7,附睾尾部精子活动率下降至对 照组的6,血清睾酮水平上升至对照组的 255,而睾丸网液却下降至对照组的55. 表十一醴搴酮组与对照组大鼠搴丸网澶中耗子计微,附搴尾部耗子活动宰,血中和 搴丸网洼中T浓度 TableComparisonofthespermdensityandtestosteronelevelintestisretefluidandsperm motilityinepididymusca~dabetweencontrolandtreatedgroul~ (--)经Tu处理大鼠未发现睾丸生精细 胞和附睾上皮细胞的凋亡状况有明显改变. (三)经Tu处理后大鼠睾丸和附睾组所 含AR明显步于对照组大鼠.图1(见图版二) 显示Tu处理大鼠和对照大鼠睾丸和附睾组 织样本经RT—PCR和琼脂糖凝胶电泳条带. 图2显示经电脑软件数据转换后用AR条带 光密度值除以口一actin条带光密度值后,得到 的相对光密度比值.正常睾丸和附睾相对光密 度比值分4为0.689士0.035?)和0.891 士0.119,而给药组睾丸和附睾分别为0.452士 0.119和0.437?0.1O0.Tu处理后大鼠睾丸 和附睾AR表达量显着低于对照组大鼠,P值 分别小于0.05. 蜊 章 ? 智 圈N正 . 常 rm 荤丸 alTen|s 固正常附睾 一 NormalE口ididymus 自给药晕丸一 TI?tTe~is 日给药附睾 图2睾丸和附睾雄激素受体基固相对光密度比值 Figure2Relativeintenhyofandrogenreceptorin testisandepididymus|tomcontrolandtreaedg~oups 讨论 在人类.超生理量的睾酮可以抑制垂体分 泌促性腺激素(FSH,LH)和睾丸Leydig细胞 产生睾酮],从而使55,70的白种人 和88.9,100的中国人达到无精子症. 其余为严重少精子症.在大鼠有所不同.超生理 量的睾酮可以抑制LH和睾丸内睾酮水平,但 是血清FSH水平仍然维持在正常或部分抑制 水平,即使加上外源性雌激素的协同作用也是 如此,给大鼠使用超生理量的睾酮只能部分抑 制大鼠睾丸生精.本研究给大鼠注射超生理 剂量的十一酸睾酮(TU).血清睾酮上升至对 照组的255,这是由于Tu在体内代谢为睾 酮所致.然而睾丸网液中的睾酮浓度下降至对 照组的55.提示生精系统中睾酮浓度下降. 睾丸网液中的精子密度下降到对照组的7 左右,但是不能达到无精子症,而附睾尾部精子 活力明显下降至6左右.这一结果与其他两 个研究结果一致口'],他们甚至合并使用孕激 素或雌激素,也不能达到完全抑制精子生成. 在大鼠诱发和维持精子生成是否需要 FSH,尚有争论.击垂体大鼠在缺乏FSH和 LH状况下单独T可以维持精子生成[1". Singh等0利用Hpg小鼠这一动物模型来研 究这一问题.Hpg小鼠是一种GnRH基因缺失 而引起先天性促性腺激素缺乏的动物,他们给 这种小鼠使用睾酮或双氢睾酮8周,尽管睾丸 内睾酮水平仍然很低,外周循环FSH水平低于 可检测水平.仍然使小鼠睾丸体积增大14倍, 而且诱发出具有受精能力的精子.说明在鼠类 即使完全缺乏FSH.雄激素仍然可以启动精子 生成.人类精子发生调控机理更为复杂,迄今仍 有不同观点.较早期研究认为,人类在没有 FSH存在下,单独使用睾酮不能启动精子生 成.对于特发性低促性腺激素型性腺功能低 减的病人.使用单纯FSH和T也不能启动和 维持精子生成,只有加上LH,促使内源性睾酮 产生,提高睾丸内睾酮水平,才能达到此目 的.然而晟近的临床研究发现FSH受体灭 活性突变导致女性闭经和不孕,但男性精子发 生仅受到部分影响[1. 众所周知,睾丸内高水平的睾酮是诱发和 维持精子生成所必需的,究竟睾丸内睾酮需要 维持多高才能保证质量正常成熟精子发生,仍 属未知.一些实验证实.当睾丸内雄激素水平大 大低于正常睾丸时.精子仍能维持生成".本 研究中,给予大鼠超生理剂量睾酮后,睾丸网液 中睾酮仍保持在相当高水平.在这种情况下,大 鼠睾丸继续生成精子是完全可能的.给予超生 理剂量的睾酮使大鼠生育力显着下降【"的主 要原因是精子数目减少和精子活力严重低下. 睾酮是通过雄激素受体(AR)而发挥其 生物效应的.免疫组织化学和原位杂交显示,雄 激素受体存在于睾丸间质细胞,血管平精肌细 胞,管周类肌细胞,支持细胞.支持细胞的AR 受体的表达在90天大鼠曲细精营的?和vI阶 段达到峰值,此期睾酮分泌正处于最高峰 雄激素对AR水平有调节作用.配体结合 实验用EDS(ethanedlmethasesulphonate) 去除问质细胞.5d后导致血中和睾丸内睾酮 降至极低水平,前列腺,附睾的AR增加2,4 一——————————————.曙了习露?_—一溺: 一 m 南 d???????L直 n ...,.., ??0 jl?l量 ? 156? 倍.而睾丸内AR未发现明显变化.而免疫沉 淀和免疫印迹实验显示长期EDS处理大鼠睾 丸内AR蛋白显着降低["].本研究发现给予大 鼠大剂量Tu使睾丸和附皋AR含量较对照 下降I.5,l_8倍,大剂量睾酮引起AR的降 调节作用可能与睾九精子产量和附睾尾部精子 活动率下降有关. 细胞凋亡是近年来生物界研究的一个热 门.它是指在细胞发育过程中生理性的程序化 死亡.生精细胞死亡主要发生在A2,A3型精原 细胞,增殖,分化的生精细咆仅有25发育成 为细线前期精母细胞.在正常生精过程中,精原 细胞死亡的机制是凋亡,而不是坏死.生殖激素 控制睾丸内细胞的凋亡,促性腺激素和睾酮对 生精细胞的存活至关重要.并且睾酮可以阻止 生精细胞的凋亡""].给予Tu后,在血中 FSH,LH和睾丸内T下降的情况下是否增加 睾丸内生精细胞的凋亡.这是本研究欲探讨的 另一个问题.但实验结果显示,长期给予大鼠大 剂量Tu并未影响睾丸生精细胞和附睾上皮 细胞的凋亡.睾丸精子数量降低可能是通过作 用于生精细胞的有丝分裂或减数分裂环节而实 现的. 综上所述,给大鼠长期注射Tu可降低曲 细精管内睾丸网藏中的睾酮浓度,部分抑制精 子生成.大大降低附睾尾部的精子活动率,从而 达到抗生育作用.长期大量使用雄激素可抑制 睾丸和附睾中雄激素受体基因表达.这可能是 睾丸精子产量和附睾尾都精子活动率下降的诱 因之一. 参考文献 EllWHO,Tkforceonmethods/ortheguIation ofmaleIertility:Contraceptionmdncyof testosterone—indueedazOosperm;ainnorma| men.Lancet336I955.1990 [2]KnuthUA,NieschlagE:Endocrineapproaches tomaleIertilitycontro1.Bail]iersClln EndocrinolMetabl:l13.1987 [32张挂元,张光华,朱晓红,张芝娟,颜文清,曹 炳,崔应琦,刘孙斌,乔根梅,赵珩庚酸睾酮诱 导的无及少精子症者生殖激素和精子功能指标 变化的观察.生殖医学杂志l(1)7.1992 [42LubahnDB.JosephDR.SullivanPM,w?and HF&FrenchFS:Cloningofhumanandrogen receptorcomplementaryDNAandlocalizationto theXchromosome.Science240:327.1988 [52B]okLJ,MaekenbachP,TrapmanJ.Themmen APN,BrinkmannAO&GrootegeoedJA} Folliclestimulatinghormoneandrogenregulates androgenreceptormRNAinSerto]icells.Mol CellEndocr63:267,1989 [6]wuYwandYuanDA}Modifiedmethodfor co1]eetionofretetestisfluidfromtherat.IntJ Aodrol7:362,1984 [73WHO.Taskforceonmethodsfortheregulation ofmalefertility:Contraceptiveefficacyof testosterone—inducedazoospermiaand oligozoospermiainnormalmn.Fe~ilSteril65: 821.1996 [8]MelaehlanRI,WrefordNG.MeachemSJ.de KretserDM&RobertsonDM:Ef『ectsof testosterone0nspermatogeniccellpopulations intheadultrat.既oIReprod51:945,1994 [9]方瑞英,周慧君,扬宝珠楼宜矗,章元沛长技 睾酮酯典台井甲孕酮或戊酸雌二醇对雄性大鼠 的抗生育作用.浙江医科大学13(6)285. 1984 [103许烨,顾芝萍,童建孙,王慧张珠诗,林 宁,钱绍桢t十一酸睾酮与棉骑台用对大鼠生育 力的影响.生殖与差孕13(4):272,1993 [儿]AwoniyiCA.ZirkinBR,ChaodrashekarV& SchlaffWD!Restorationofadvancedspermato —genie.eI1sintheexperimentallyregressed testis:quant~atativerelationshipof testosteroneconcentrationwithinthetestis. 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Keywords;Testosterone Apoptosis undecanoate,Testisretefluid,Androgenreceptor, RT—PCR 一 孽: