叶绿素合成前体物质及相关酶的测定

叶绿素合成前体物质及相关酶的测定 1 ALA (5–氨基酮戊酸)含量的测定(所有操作均在4?下进行) 参照Dei(1985)的:用质量体积比为4%的三氯乙酸提取 0.5 g 叶片中的 -1ALA，5 mL提取液与2.35 mL NaAc(1 mol?L)、0.15 mL乙酰丙酮和2.5 mL 醋 -1酸盐缓冲液(1mol?L，pH 4.6)混合后，于沸水浴中加热10 min，冷却至室温后，用Ehrlich-Hg试剂显色，检测波长553 nm处的OD值。 2 PBG(胆色素原)含量的测定 参照 Bogorad(1962)的方法:取0.5 g叶片用液氮研磨后，加入5 mL 提取缓 -1-1冲液(0.6 mol?LTris，0.1 mol?LEDTA，用盐酸调至pH 8.2)提取叶片PBG，410×g离心10 min，取2 mL上清液加2 mL Ehrlich-Hg试剂，黑暗中显色15 min，测波长553 nm处的OD值。 3 Urogen ?(尿卟啉原?)含量的测定 -1参照Bogorad(1962)的方法:取0.5 g叶片经 0.067 mol? L磷酸缓冲液(pH6.8) -1提取，取5 mL提取液加入0.25 mL，溶液(1%)，强光照射20 min后，用1 mol?L冰醋酸调pH至3.5。乙醚萃取3次，合并水相并测405.5 nm处的OD值。 叶绿素降解相关酶的测定 叶绿素酶脱镁螯合酶脱镁叶绿叶绿素——脱植基叶绿素——脱植基叶绿素酸— 酸双氧酶—色素丧失 1 叶绿素酶活性的测定 1.1 剪碎后混合均匀，称取2 g，加入10 mL丙酮，在液氮中研磨后，置于-20?提取40 min，提取液12000×g 离心5 min，去除上清液，对底部沉淀再用同样条件重复提取2 次。在沉淀中加入5 mM pH=7 的磷酸缓冲液3 mL(含50 mM KCL，0.24%TritonX-100)，30?下磁力搅拌30min，12000×g 离心5 min，上清液即是酶粗提液。 1.2 酶活性测定酶活性的测定参照Fang[10]、Fernandez-Lopez[11]等人的方法:反应体系包括0.1M抗坏血酸30μL，酶粗提液500μL，120μmol/L的叶绿素 300ul，丙酮1.7mL，最后加蒸馏水定容至3.3 mL。反应体系于35?、黑暗条件下反应40min。然后加入预冷的丙酮3mL，正己烷6mL，剧烈震荡来终止反应。4?，12000×g 条件下离心5min，取丙酮层，测定667nm下的OD值。以沸水浴加热失活的酶液为比色空白对照。试验所用的叶绿素纯品购自Sigma公司。 2 MDCase的提取和测定 取叶片按照2ml/g的比例加入4摄氏度预冷的提取液【0.1mol/l的磷酸缓冲液ph=6含0.2%tritonX-100,30g/l聚乙烯吡咯烷酮，1mmol/l苯甲基磺酰氟和5mmol/la半胱氨酸】，冰浴中匀浆后放在低温摇床上震荡2h后，4层纱布过滤，滤液在4摄氏度下以9000g离心20min，上清液为粗酶液。 花色苷含量的测定及相关酶活性的测定 花色苷:是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。花色苷是类黄酮——以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。 溶解性:溶于水;颜色随着PH的改变而发生变化，酸性条件下为红色，中性为紫色，在碱性条件下呈蓝色 1. 花色苷含量的测定 参照Pirie 和Mullins(1976)的方法，取0.5 g 样品，加入10 mL 预冷的1%盐酸—甲醇溶液，避光室温浸提2 h。用分光光度计测定提取液在530 nm 和657 nm 处的吸光值，二者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01 定义为一个单位U。设取样重复3 ~ 5次。 2 叶片中PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性的测定 -1 取0.5g剪碎的叶片加入5ml提取液[0.05molLNa2HPO4/KH2PO4(pH7.0)， -1-10.05mol.L抗坏血酸，0.018mol.L巯基乙醇]，冰浴匀浆，4?下15000g离心20min，上清液为酶粗提液，用于测定酶活性。PAL和CHI活性测定参照Lister等的方法。 PAL活性 取4支10ml试管(3支测定管,1支对照管),分别加入0.02mol/l L-苯丙氨酸1.0ml(对照管不加,代之为蒸馏水),硼酸缓冲液(Ph=8.8)2.0ml,酶液1.0ml(根据酶活性适当的稀释或增加体积),总体积4.0ml.摇匀后置30?恒温水浴中保温 60min,加0.2ml 6mol/lHcl终止反应hyu,若有沉淀需过滤或离心.用对照tiu管调零,在290nm处检测测定管反应液得吸光度A290。 以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位(u) PAL活性(u/gFw.h)= A290×Vt×v/0.01×VS×Fw×t 式中:Vt:酶液总体积(ml); Fw:样品鲜重(g); VS:测定时取酶液的量(ml); v:反应液总体积(ml); t:反应时间(h)。