探讨过度内质网应激在慢性环孢素a（cy-closporine a，csa）肾毒性细胞凋亡中的作用机制

探讨过度内质网应激在慢性环孢素a（cy-closporine a，csa）肾毒性细胞凋亡中的作用机制 摘 要 目的:探讨过度内质网应激在慢性环孢素A(Cy-closporine A，CsA)肾毒性细 胞凋亡中的作用机制。 方法:将Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组和慢性CsA肾毒性组， -1-1-1-1分别给予皮下注射橄榄油(1mg)kg)d，对照组)和CsA(15mg)kg)d， 毒性组)1周及4周后处死大鼠。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口 末端标记测定法(TUNEL染色法)和三色染色评估肾小管间质纤维化和细胞凋亡; 使用免疫组化学染色和免疫印迹依次检测分子免疫球蛋白结合蛋白(BIP)、磷酸 化的真核细胞翻译起始因子2α(elF2α)、生长抑制DNA损伤基因153(GADD153)、 细胞凋亡相关基因caspase-12及caspase-3蛋白达。 结果:CsA注射1周观察不到肾小管间质纤维化和TUNEL阳性细胞，而给予CsA 注射4周大鼠表现为明显的肾小管间质纤维化和大量TUNEL阳性细胞蛋白的表达 1周达到高峰，4周后降至正常水平蛋白表达呈时间依赖性的增加。 结论:在慢性CsA肾毒性中，过度的内质网应激耗尽分子伴侣、激活凋亡前途径 从而导致肾小管上皮细胞凋亡参与肾小管间质损伤。 关键词:慢性环孢素A肾毒性;内质网应激;细胞凋亡 Abstract Objective: To investigate the impact of excessive endoplasmic reticulum stress on apoptotic cell death in a rat model of chronic cyclosporine A (CsA) nephrotoxicity. Method: Male Sprague-Dawley rats maintained on a low salt diet were treated daily with vehicle (olive oil,1mL/kg/d, s.c.) and CsA (15mg/kg s.c.) for 1 and 4 week. Tubulointerstitial fibrosis and apoptotic cell death was estimated by trichrome staining and TUNEL staining. In addition, immunohistochemistry and immunoblotting were used to evaluated the expressions of BIP, elF2α, GADD153,caspase-12,and caspase-3. Results: Rats treated with CsA for 1week did not develop tubulointerstitial fibrosis and TUNEL-positive cells, whereas 4weeks treatment of CsA induced typical tubulointerstitial fibrosis and increased TUNEL-positive cells. At a molecular level, CsA induced a significant increase in BIP and caspase-12 expression peaked at 1week, ant then return to normal levels at 4weeks. In contrast, the expressions of eIF2α, GADD153, and caspase-3 in CsA-treated rat kidneys were significantly increased in a time-dependent manner. Conclusion: These findings suggest that excessive endoplasmic reticulum stress causes apoptotic cell death by depleting molecular chaperones and stimulating the proapoptotic pathway in chronic CsA nephrotoxicity. Key words: Chronic CsA nephrotoxicity; endoplasmic reticulum stress; apoptosis 前 言 环孢素A(CsA)是一种强力的免疫抑制药物，于1972年Borel首先自真菌中 [1]提取，并在1976年发现有免疫抑制的功能。纵然新的免疫抑制剂层见迭出， CsA仍作为首选的免疫抑制剂，现已广泛用于难治性肾病综合征、系统性红斑狼 疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病及器官移植等，并展示了其良好的治疗效 果。但随着临床使用的时间延长和应用领域的拓展，对其导致的各种副作用的认 知也逐步增加。如糖代谢紊乱、肾毒性、肝毒性、神经毒性、高血钾、口腔溃疡 等，严重影响了患者的长期存活率。其中慢性肾毒性越来越受到重视，慢性CsA 肾毒性的病理特点为肾小管间质炎症和纤维化。曾有研究表明，啮齿类动物给予 皮下注射CsA和低钠饮食，可以加速肾损伤的发生，并可以成功复制人类慢性 [2]CsA肾毒性的模型，且明显缩短了成模的时间。但是慢性CsA肾毒性的发病机 [3][4]制目前还不十分清楚，可能与炎性趋化因子、转化生长因子β1，肾素血管紧 [5][6][7、8]张素系统(RAS)、细胞凋亡、氧化应激等相互影响及作用有联系。而其中的细胞凋亡饰演着不可或缺的主要角色，因为肾小管上皮细胞凋亡使肾实质细胞大量缺失，是纤维化形成的根本所在。临床和动物实验证实，CsA治疗可激活凋亡前基因引起肾实质细胞凋亡，利用TUNEL技术可以观察到凋亡的细胞小体。 内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)是真核细胞的一种自我保护性应激表现，经过ERS细胞减少胞内未折叠蛋白的比率，抑制未折叠蛋白发生堆积。然而过度的ERS可启动细胞凋亡，是一条新的细胞凋亡信号传导通路不同于经典的凋亡途径，这一信号传导通路包括非折叠蛋白反应和钙离子起始信号等机制。ERS介导的细胞凋亡与定位于内质网的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12 (caspase-12)、ERS标志分子免疫球蛋白结合蛋白(BIP)、ERS相关促凋亡分子 [9]GADD153 的激活有关。大量研究表明，过度ERS诱导的细胞凋亡在肿瘤、糖尿病、缺血性心脑血管疾病、慢性炎性疾病以及很多肾脏疾病的发生发展进程中起 [10、11、12、13]到了主要作用。但是关于内质网启动的细胞凋亡途径在慢性CsA肾毒性过程中的作用和机制还不十分明确。所以本研究以慢性CsA肾毒性大鼠为模型, 观察过度ERS在慢性CsA肾毒性细胞凋亡中的作用机制。 第一章 材料与方法 1.1 动物与分组 将雄性健康成年Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Technology, Korea) 32只(体重200g-220 g)。给予喂饲低盐饲料 (0.05% NaCl，Teklad Premier, Madison, WI, America) 下, 随机分为2组: 1( 正常对照组 (VH, n = 16):皮下注射橄榄油 (1mL. kg-1.d-1, Sigma, America)。 2( 环孢素A毒性组 (CsA, n = 16): 皮下注射 CsA (15mg. kg-1. d-1, Novartis Pharma, Basel, Switzerland)。 两组大鼠治疗1周及4周后分别处死, 留取肾组织标本。 1.2 肾脏病理 肾脏病理及其损伤程度判定:肾组织由过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液固定，石蜡包埋后切片(厚4μm)。脱蜡后行三色(Masson Trichrome) 染色，观察肾小管 TM间质纤维化。肾小管间质纤维化程度利用数字化显微镜分析仪(TDI Scope Eye Version3.0 for Windows，Olympus， Japan)，在100倍显微镜下，每张切片上至少观察非重叠20个不同区域，获取图像，利用 Polygon Program定量地计算 2肾皮质受损部位的百分比(%/0.5mm)。由2位观察者对每个样本随机进行盲法评分，取平均值。 1.3 免疫组织化学染色 石蜡包埋切片置二甲苯脱蜡和梯度乙醇中脱水， 室温下(37?) 0.3%过氧化氢/甲醛30min处理后，PBS液洗3次。置微波炉中加热行波炉抗原修复(98? 5min)，PBS液洗3次。滴加非免疫性血清封闭液, 室温下进行20min。PBS液洗3次，在4?下滴加BIP?抗 (Santa Cruz Biotechnoogy，Inc.， Calif.，America)孵育12?16h。PBS液洗3次后滴加?抗, 室温孵育2h。以DAB为底物显色, 呈棕黄色为止(具体调节时间)。自来水流水洗涤,复染苏木素，常规树脂封片。 1.4 免疫印迹 (10mmol/L Tri-Cl, pH7.6;150mmol/L 提取的肾组织用蛋白质溶解缓冲液 NaCl; 1% 脱氧胆酸钠; 1% Triton X 100; 0.1%十二烷基硫酸钠;;1% 抑肽酶; 2mmol/L Na3VO4; 1ug/mL leupeptin;1mmol/L 苯甲基磺酰氟，PMSF) 制 in) 后, 取上清液测定蛋白浓度 (Bio-Rad, 成匀浆; 4?下离心(1500r/m Hercules); 20μg 标本在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳;电转膜 (90伏特) 2h后, 4?下 置BIP抗体于非脂牛乳中以1:1000 浓度孵育12?16h;室温下缓冲液液洗3次,加辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG (Amersham) 1h; 室 TM温下缓冲液液洗3次,增强发光 (ECL, Amersham) 和曝光。磷酸化的真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)、GADD153、caspase-12、caspase-3的免疫印迹步骤与BIP类似。以β-actin为参照进行条带分析。 1.5 统计学方法 计量资料数据以均数 ?差(Mean?SEM)表示，多组间比较通过SPSS 12.0 软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)，使用Bonferroni进行校正。由于对照组1周和4周无统计学差异，仅用VH表示。当结果P <0.05时认为具 有统计学差异。 第二章 结 果 2.1慢性CsA肾毒性肾脏病理变化 CsA注射1周观察不到明显的肾脏病理改变[纤维化;而CsA注射4周观察到肾小管间质带状纤维化和大量TUNEL阳性细胞。 2.2 内质网应激分子伴侣BIP的蛋白表达 为观察内质网应激本实验检测其分子伴侣BIP蛋白的表达，在VH组中，可以观察到BIP蛋白在肾小管上皮细胞的表达。CsA注射肾小管间质纤维化和TUNEL阳性细胞1周后其表达显著增加，尤其是在肾小管间质纤维化区域(图2A)，CsA注射4周后其表达下降。免疫印迹进一步证实BIP蛋白表达的趋势，见图2B。 2.3 eIF2α蛋白的表达 免疫印迹实验结果显示(图3)，与VH组相比，CsA组真核翻译因子eIF2α激酶蛋白的表达明显增加，呈CsA给药时间依赖性。 2.4 细胞凋亡相关基因的表达 为揭示内质网应激诱导的细胞凋亡机制，本实验检测直线细胞凋亡相关基因的表达。结果表明，CsA注射组caspase-12蛋白的表达1周达到高峰，4周降至正常水平)。与之相反，GADD153、caspase-3]蛋白的表达随CsA给药时间逐渐递增，见图5和图6。 第三章 讨 论 因细胞凋亡而大量缺失肾实质细胞最终形成肾脏纤维化或硬化是诸多肾脏病的发病机制之一。本研究利用慢性CsA肾毒性大鼠模型，观察ERS与细胞凋亡在肾小管间质纤维化中的作用。结果表明，ERS启动了caspase-12依赖的细胞凋亡程序，通过真核翻译因子eIF2α激酶磷酸化、细胞凋亡基因GADD153和 caspase-3，导致肾小管上皮细胞凋亡和纤维化形成。提示CsA所致的ERS反应和凋亡反应失衡有助于肾实质细胞凋亡从而参与慢性CsA肾毒性的发病。 机体内环境需要动态平衡，一旦失去平衡即造成疾病的发生。物理、化学、遗传、病理等因素导致内质网内环境失衡, 形成ERS。ERS时其分子伴侣BIP分离而激活，此时已活化的双链RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase，PERK),特异性地磷酸化eIF2α第51位丝氨酸，eIF2α磷酸化则失去起始蛋白质翻译的活性，进而蛋白质合成受到抑制。eIF2蛋白有A、B、C三种亚基，其中eIF2α是一种参与真核翻译起始的重要蛋白质。因此，eIF2α是与细胞生存紧密相关的 [14、15]真核起始因子。在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化模型或高糖诱导的人类 [16][17]近端肾小管上皮细胞培养实验中，Chiang 等和Lim等分别报道，ERS分子伴侣BIP与激活的eIF2α在过度的ERS所诱导的肾小管细胞凋亡中扮演重要角色。在本实验中，CsA诱导的ERS反应是双向的，给大鼠CsA注射1周显著上调内质网伴侣蛋白BIP蛋白的表达，而4周注射后其表达降至正常水平。免疫组化结果进一步证实BIP蛋白在肾小管上皮细胞中高表达，该区域正是CsA损伤的靶部位。反之，eIF2α蛋白的表达明显增加4周时达到高峰，呈CsA时间依赖性。以上结果表明CsA所致的过度ERS持续激活真核起始因子eIF2α磷酸化从而极度地消耗了肾小管细胞的内质网分子伴侣蛋白BIP，最后导致慢性CsA肾毒性肾小管细胞内环境受到损伤。 慢性CsA肾毒性以肾小管间质带状纤维化为病理特征，肾实质细胞凋亡是其分子发病机制之一。我们以往研究表明，CsA使肾入球动脉收缩导致缺血缺氧，从而激活肾内肾素血管紧张素系统、上调致纤因子转化生长因子β1，以上因素均可调控促凋亡基因(Fas、Bax、caspase-3)和抗凋亡基因(Bcl-2、EGF)，有效控制肾实质细胞凋亡。正常情况下，ERS反应可以成功地维持内质网内环境稳定。但是，过度的、过长的ERS可激活caspase-12依赖的细胞凋亡信号传导途径诱导细胞死亡。已知caspase-12属于特异性的内质网半胱氨酸蛋白酶，它是由ERS所激活继而引起线粒体非依赖的caspase-3裂解。本实验中，我们观察到环孢素A 1周致caspase-12蛋白的高表达而后下降，而促凋亡基因GADD153和caspase-3的表达随CsA给药时间递增，4周后达到顶峰。在肾脏病理组织中，环孢素A 1 周观察不到TUNEL阳性细胞，而4周后肾小管上皮细胞显现出大量的TUNEL阳性细胞。这些结果提示凋亡前信号先于细胞凋亡，过度的ERS反应通过调控凋亡基因GADD153和caspase-3的表达导致细胞程序性死亡。 CsA诱导过度ERS和细胞凋亡的机制还不清楚，一种解释是CsA发挥药物毒 [18]性可直接引起ERS。有趣的是，Justo等利用体外实验报道，CsA可诱导ERS相关性促凋亡分子CHOP但不能激活ERS特异性的caspase-12凋亡经典途径。这些不同结果暗示CsA本身不足以引起细胞凋亡，尚需一些介质协助完成凋亡程 [19][9][20]序，如活性氧自由基、肾素血管紧张素系统、一氧化氮合成酶及天然免疫 [21]系统等，因为这些都是ERS和细胞凋亡的诱发因素。基于以上理论，我们推测在慢性CsA肾毒性中，CsA本身协同其他介质共同完成ERS相关的细胞凋亡。 在临床实践中，肾移植早期移植肾对CsA所致的ERS有较好的适应能力，因为体内产生内质网分子伴侣。然而，由于对ERS反应的下降和细胞凋亡前途径的激活，使得移植肾很难长期适应CsA的服用。且已有慢性CsA肾毒性的动物研究证实，肾小管间质细胞凋亡的数目不仅明显增多，并且还与环孢素A的给药时间 [22]和剂量有明显的依赖性。另有实验证实，环孢素A的中断与肾小管间质凋亡细胞的数目间有显而易见的时间依赖效果，凋亡细胞的减少同时伴随肾功能及肾小 [6]管间质损害的改善。因此，本实验结果为临床药物减量或停用CsA以达到预防慢性CsA肾毒性之目的提供了分子理论基础。 第四章 结 论 1.短期给予环孢素A可上调内质网分子伴侣BIP及细胞凋亡相关基因caspase-12的表达，保护ERS引起的细胞损伤，但随着给药时间延长，导致过度内质网应激后，BIP持续消耗，caspase-12的不断水解，其表达降至正常水平。 2(翻译蛋白因子elF2α、细胞凋亡相关基因GADD153及caspase-3的蛋白表 达呈时间依赖性，随给药时间逐渐递增，因长时间的内质网应激使elF2α磷酸化，GADD153及caspase-3基因不断生成，最终导致细胞受损。 致 谢 转眼间，我已在这美丽的长白山脚下生活了八年，这八年是我最真诚的青春，是我最纯真的岁月，是我最美丽的大学生活。尤其最后这三年更是我最珍惜的日子，也许是因为考研太苦，亦或是科室里如家庭般幸福的生活，所以当迎来这阳光明媚的五月，到了这告别的时刻，刹那间涌上了许多不舍。三年的学习历程虽然充满挫折及疲惫，但仔细回首来，在肾内科这个集体里也是充满快乐的，同门师兄妹们无数次结伴同游，无数次对酒当歌，无数次谈天说地、嬉笑怒骂，无数次在陌生的胡同里寻找美食，这一幕幕宛在昨天，现在变成了可以共同分享许多美好的回忆。 就是在这样美好的研究生生活里，我要感谢所有关心我、帮助我、教育我的老师们，感谢陪伴我一起成长的同学及朋友们，感谢一直支持我鼓励我的家人们，对你们我表示最衷心、最诚挚的谢意～ 首先让我最急切表示敬意和赞美的是一位平凡人，我的导师。我不是您最出色的学生，而您却是我最尊敬的老师。您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。授人以鱼不如授人以渔，置身其间，耳濡目染，潜移默化，引导我迈向医学的道路，树立我严谨行医准则，教导我如何做人，如何救人，如何医人。 其次我要感谢肾内科主任李灿教授，从题目的选定到论文写作, 正是有您的悉心帮助和指导，我的论文才得以顺利完成。还有您活跃的学术思想、执着的科研精神及高尚的做人，都给我留下了终生难忘的印象。感谢您让我在学医的道路中不仅教育我学习的方法，还感受到了快乐。您如父亲一样三年来在工作、学习和生活上给予我的无微不至的关心和帮助，所有的这一切我都将铭记在心。 还要感谢在这三年来给予我关怀、默默地支持和鼓励我的肾内科的每一位老师和全体护士，无论是工作、学习还是生活，正是有你们的悉心指导和帮助下我才逐渐成长起来，感谢大家对我的教诲，你们就像我家人一样，让我感到温暖和 亲切，我的每一点进步都包含着你们的心血，在此深表谢意～ 感谢我的师兄妹们，感谢我的室友，与你们一起度过的那些既有笑颜、又有泪水的学习生活是我终身的宝贵财富。是你们让我体会到了非血缘的手足情深，我们之间的友谊今生不忘。在此我献上最诚挚的感谢和深深的祝福。 最后感谢我的家人，我永远的支持者，正是在你们殷切目光的注视下，我才一步步的完成了求学生涯。没有你们，就不会有今天的我!我一直很感谢你们，让我拥有一个如此温馨的家庭，让我所有的一切都可以在你们这里得到理解与支持，得到谅解和分担。你们的支持和鼓励是我前进的动力。