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免疫捕获pcr快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌

2017-12-28 2页 doc 13KB 21阅读

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免疫捕获pcr快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌免疫捕获pcr快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 作者:周义正 李向阳 杨锦红【关键词】 阳性 金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引发社区感染和院内感染的重要致病菌,其所致感染常以急性、化脓性为特征。以其引发菌血症而致的脓毒血症最为严重。作者采用免疫捕获PCR法(Immunocaptured PCR,icPCR)检测S.aureus,即应用抗体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.aureus,再用PCR法...
免疫捕获pcr快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌
免疫捕获pcr快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 作者:周义正 李向阳 杨锦红【关键词】 阳性 金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引发社区感染和院内感染的重要致病菌,其所致感染常以急性、化脓性为特征。以其引发菌血症而致的脓毒血症最为严重。作者采用免疫捕获PCR法(Immunocaptured PCR,icPCR)检测S.aureus,即应用抗体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.aureus,再用PCR法快速检测ssa基因和mecA基因,以期建立一种快速准确地检测阳性血培养瓶中S.aureus的方法。 1 材料与方法 1.1 材料 本实验所用的菌株均购自卫生部临床检验中心,其它非标准菌株是本实验室保存的临床菌株,均分离自患者的血培养标本并得到Vitek-32全自动细菌鉴定仪的鉴定。引物:(1)ssa基因:ssa-F:5‘-TCGGTACACGATATTCTTCAC-3‘,ssa-R:5‘- ACTCTC GTATGACCAGCTTC-3‘,,,。(2)mecA基因:mecA-F: 5‘-GCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGC -3‘ mecA-R:5‘- GATTGAAAGGATCTGTACTGGGT -3‘。 1.2 方法 (1)抗体包被微量PCR管:人IgG以0.1mol/L的Na2CO3缓冲液(pH=9.6)稀释至20μg/ml,取500μl加至0.6ml的PCR管中37?孵育3h,再放置4?过夜,然后倒掉包被液,加入500μl 10%小牛血清在37?孵育1h,最后以PBST洗3次,包被好的PCR管置4?冰箱备用,,,。(2)免疫捕获和模板DNA制备:以无菌方式抽取阳性血培养瓶中的带血球菌液置无菌试管以2,000r/5min离心,取500μl上层菌液加入包被有人IgG的PCR管中在37?孵育30min,然后倒掉菌液以PBST洗涤6次,每次2min,最后在吸水纸上扣干残液,以上完成免疫捕获,接着在捕获完后的PCR管中加入100μl双蒸水并在PCR仪上以99.9?裂解10min,然后参照《精编分子生物学实验指南》上的醋酸钠-异丙醇法,3,沉淀DNA并用70%乙醇洗涤,待自然干燥后加入10μl双蒸水即得到PCR反应所用的模板DNA。(3)PCR扩增反应体系和参数:反应体系包括10×Buffer 5μl,2.5mmol/L dNTP 4μl, Taq酶1U,20μmol/L正反向引物各 1μl ,25mmol/L MgCl2 3μl,模板DNA 10μl,最后补ddH2O至50μl。ssa基因和mecA 基因的PCR扩增参 数先94?预变性5min,再按94?,30s?53?,30s?72?,1min,共35个循环;最后72?,10min。目的基因片段大小分别为180bp和210bp。(4)最低检测限检测:先将在绵羊血琼脂平板上生长24h的S.aureus(菌株ATCC43300)纯菌落用无菌蒸馏水调置成1McFarland的菌液,然后以无菌操作方式将调好的1ml菌液加入血培养瓶中,再以无菌操作方式将5ml正常人无菌血加入同一血培养瓶中,最后将血培养瓶放入BacT/Alert全自动血培养仪直至阳性报警,接着以无菌操作方式从阳性血培养瓶中抽取5ml置无菌试管中2,000r/5min离心,再取上层菌液3ml作原始菌液并以新血培养瓶中的无菌培养液10倍系列稀释观察icPCR的最低检测限,每个稀释度做5管,重复试验3次,原始菌液和各稀释菌液均以琼脂倾注法作活菌记数。(5)特异性试验:按照与最低检测限检测中相同的方法用表1中1-20号菌株制作模拟标本,分别用icPCR法检测ssa基因和mecA基因以鉴定S.aureus和MRSA,重复试验3次。(6)临床标本检测:以本实验室2006年7至8月收到的血培养标本中的106例阳性报警瓶为检测对象,分别采用传统方法和icPCR法进行检测S.aureus和MRSA。
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