二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用

二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用 二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用 第37卷第3期 2006年6月 解剖 ACTAANATOMICASINICA Vo1.37.No.3 Jun.2006 二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用 吕丹瑜刘雅琼刘宁毕振伍吴俊李英 (1.北京大学基础医学院组织学与胚胎学系,北京100083;2.北京大学公共卫生学院中心实验室,北京100083) [摘要】目的探讨二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的影响.方法对妊娠初期的雌性小鼠采用静式吸人 染毒法进行二甲苯染毒,观察胎鼠体重变化;原子吸收分光光度测定法(atomicabsorptionspectroscopy,AAS)检测妊娠 母鼠血清Fe2,M异2含量;单细胞凝胶电泳法(singlecellgelelectrophoresis,SCGE) 检测妊娠母鼠外周血有核细胞 DNA损伤程度.结果染毒各组妊娠母鼠血清Fe2,M含量下降(P<0.01,P<0.05), 并具有统计学意义;染 毒组妊娠母鼠外周血有核细胞发生DNA断裂并形成彗尾图像;染毒各组胎鼠体重较正常组相比均显着下降,且存 在显着性差异(P<0.05);部分胎鼠表现为胚胎被吸收,脑膜脑膨出,椎骨发育不全等.结论二甲苯可造成妊 娠母鼠血清Fd,M含量下降,外周血有核细胞DNA损伤并致使流产发生;二甲苯引起胎鼠体重下降,并影响生 长发育. 【关键词】二甲苯;妊娠;胚胎发育;原子吸收分光光度测定法;单细胞凝胶电泳法; 小鼠 [中图分类号】Q343.1[文献标识码】A[文章编号】0529.1356(2006)03.355 ToXICEFFECTSoFXYLENEoNPREGNANCYANDE?IRYoNIC DEVELoPMNToFMICE LUDan-yu,LIUYa-clio,LIUNing,BIZhen-wu,wuJun,LIYing (J.DepartntentofHistologyandEmbryology,&hoolofBasicMedical&矗,l?: 2.CentralLaboratory,&hodofPublicHealth,PekingUniversity,Bering100083,China) 【Abstract】 OMeettveToexploretheinfluenceofthexyleneonthepregnancyandtheembryonicdevelopmentofmice. MethodsFemalemiceinprirnmTgestationweretreatedwithstaticinhalationofxylene,Todetectthechangesoffetalmouse bodyweightafterexposurewithxylene.Theatomical~mtlo.spectroscopy(AAS)wasusedtoexaminethelevelofFdand Minselqlnlofgravidmice.The8iIlglecellgelelectrophoresisassay(SCGE)wasappliedtOdetecttheDNAd岫age0f karyecyteinmiceexposuredtoxylene.ResultsThelevelofFe2andMinsenlnlofgravidmicesignificantlydecreased(P< O.O1andP<O.05)afterxyleneexposure.DNAdamageofkaryocyteoccurredinperipheralblood,andcomettailimagewaS shownafterxyleneadministration.ThereWaSasignificantdifferenceinfetalmouscbodyweightbetweenadministrationgroupand controlgroup(P<O.05).Embryoabsorption.meningoencephaloceleandspondylousdysplasiawereappearedinsomefetalmice followinginhalationexposure.ConclusionThematernaltoxicityofxylenecausedthelevelsofFdandM异2todescendin ~Etlmofgravidmice,ledtODNAdamageofkaryocyteinperipheralblood,andresultedintheoccurrenceofspontaneous abortion.ToxicityofxyleneWaSevidencedbysignificantdecreaseinfetalmousebodyweish tandadelayofprocessinembryonic growthanddevelopment. [Keywonts]Xylene;Pregnancy;Embryonicdevelopment;Atomicabsorptionspectroscop y,(AAS);SingleceIIgel electrophoresis(SCGE);Mice 二甲苯(Xylene)为无色透明,具有芳香气味的 挥发性液体,不溶于水,溶于有机溶剂.二甲苯经呼 吸道,皮肤及消化道吸收.吸人的二甲苯在体内分 布以脂肪组织和肾上腺中最多,其后依次为骨髓, 脑,血液,肾和肝.在皮肤瘤形成中,二甲苯是一种 致癌剂.近年来,苯的毒性作用越来越受到人们的 重视,但对其生殖毒性和胚胎发育毒性研究报道尚 不多见?.本实验通过对胎鼠体重变化,妊娠母鼠 外周血有核细胞凝胶电泳,微量元素测定等方面进 行观察,旨在探讨二甲苯对妊娠小鼠及其胚胎发育 的毒性作用. [收稿日期]2005-09.14[修回日期]20O5—12—16 [作者简介]吕丹瑜(1972一),女(汉族),安徽省贵池县人,学和方法 浦诩椎着, '主 ..., 1.实验动物wh*通讯作者(Toomcom叩on.eaIIldbea'kIrled)" E-mail:pr~cmorllying@sins.c0mTel:(010)82802464ICR成年健康雌性小鼠由北京大学实验动物科 解剖37卷,3期 学部提供,体重28,35g,与同种系雄性小鼠合笼, 次日检查阴栓,见阴栓者定为妊娠第1d(d1).将妊 娠小鼠随机分为4组,分别为正常对照组,二甲苯吸 入低剂量组(500me/m3),中剂量组(1000mg/m), 高剂量组(2000mg/m3),每组动物6只. 2.实验药品及仪器 二甲苯,北京北化精细化学品有限公司出品,含 量?99.0%.AA一2610型原子吸收分光光度计(拓 扑分析仪器有限公司).DYY一6C型电泳仪(北京市 六一仪器厂). 3.实验方法 3.1静式吸入染毒法:向体积为10L的圆柱形玻 璃静式染毒柜中分别加入5.7ml,11.4ml,22.8rnl二 甲苯,使低,中,高染毒组浓度分别为500mg/m3, 1000mg/m3,2000nag/m3.于d7将妊娠小鼠投入染 毒柜进行静式吸人染毒,每日吸入3次,染毒时间为 45min/次,其间染毒小鼠休息30,60min,连续10d. 对照组除不吸入苯蒸气外,其他条件与染毒组相同. 3.2观察胎鼠体重:d17颈椎脱臼法处死妊娠小 鼠,剖腹取出胎鼠,称量胎鼠体重. 3.3AAS法检测孕鼠血清Fe",Mg2含量:d17 妊娠小鼠经心脏穿刺获得全血,4~C静置24h,取血 清经0.2%硝酸稀释,定容后,原子吸收分光光度仪 分析,测得血清Fe2,mg含量. 3.4外周血有核细胞计数:采集对照组,各实验 组以及染毒后发生急性死亡之妊娠小鼠尾血入细胞 稀释液,1%龙胆紫染色,利用红细胞计数板于光学 显微镜下计数有核细胞. 3.5SCGE法检测外周血有核细胞DNA损伤: (1)琼脂载玻片的制备:取磨砂玻璃片预冷备用.用 无ca2,Mg2的PBS配制1%正常熔点琼脂糖 (NMA),待其溶解后,滴加在预冷的磨砂玻璃片上并 覆盖盖玻片,4~C,固化10min后推去盖玻片,制成第 1层胶.取d17妊娠小鼠尾血,与0.8%低熔点琼脂 糖(LMP)1:3(v:v)混匀,制备第2层胶,4~C,固化15 min后推去盖玻片.(2)细胞裂解:将上述制好的样 本浸入裂解液(2.5mol/LNaCI,0.1mol/LNEDTA, 10mmol/Lriffs,10%DMSO,1%Triton—X100,pill0.0), 4~C,40min.(3)DNA解旋:将样本从裂解液中取 出,DW清洗,于预冷的电泳液(0.3mol/LNaOH.1 mmol/LNa2EDTA,pill3.0)中静置10min.(4)电泳: 将样本置于盛有预冷电泳液的电泳槽中,调节电泳 仪电压25V,电流300mA,4~C,避光电泳45min. (5)中和:电泳后的载玻片放入0.4mol/LTris (pH7.4)的中和液中,15min×2,中和强碱,洗去去 污剂,晾干.(6)染色:向凝胶上滴加20-ng,L溴化乙 啶20,加盖盖玻片,染色30min.(7)观察并摄片: 荧光镜下选择515,560tim波长激发光照射样本, 并采集图像. 3.6检查胎鼠外形及骨骼发育情况:于d17剖腹 取出鼠胚,解剖镜下观察胎鼠外形发生畸形程度;清 除胎鼠皮肤及内脏并经95%酒精固定72h,1%KOH 透明,1%茜素红S-1%KOH染色l2,24h,蒸馏水洗 净,甘油保存标本并在解剖镜下观察胎鼠骨骼发育 情况. 3.7资料分析:采用SPSS10.0统计软件对原始 数据进行独立样本l检验,单因素方差分析 (ANOVA)等显着性检验. 结果 1.一般情况 对照组动物无异常表现,悬尾实验表现为克服 体位而不断挣扎.染毒低,中,高剂量组动物在染毒 期间均表现为眼微睁,无神;眼分泌物增多;呼吸急 促;肌张力下降;对外界刺激反应迟钝;悬尾实验表 现为后肢无力,3min内无活动(图1).中,高剂量组 部分孕小鼠表现出少量阴道出血现象.染毒后低, 中,高剂量组均有少数动物发生急性中毒并死亡. 2.胎鼠体重改变 染毒组胎鼠体重较正常组相比均显着下降,且 存在显着性差异(P<0.05)(表1). 3.血清微量元素含量改变 经AAS法检测染毒各剂量组妊娠小鼠血清 Fe含量均显着下降(P<0.01)(表2).染毒中,高 剂量组孕鼠血清Mg2含量下降(P<0.05)(表3,图 4).染毒后发生急性死亡之妊娠母鼠血清Fez, Mg2含量(表2;3)均显着下降,且具有统计学意义 (P<0.01). 4.外周血有核细胞计数改变 中,低,高剂量组妊娠母鼠外周血有核细胞计数 与对照组相比并无显着性差异.染毒后发生急性死 亡之妊娠母鼠外周血有核细胞计数显着下降(P< 0.01)(表4).取急性死亡妊娠母鼠外周血经瑞氏一 姬姆萨染色发现大量红细胞膜呈棘状突起(图2). 5.外周血有核细胞DNA损伤检测 荧光显微镜下DNA红染,没有发生DNA断裂 的有核细胞呈圆形(图3);染毒组发生DNA断裂的 有核细胞表现为DNA断片向阳极方向移动并形成 彗尾图像(图4). 6.对胚胎发育的影响 中,低,高剂量组均有妊娠母鼠发生流产现象 (表5).胎鼠毒性表现为胚胎被吸收(图5),脑膜脑 膨出(图6),胚胎局部淤血(图7),椎骨发育不全(图 8)等现象;染毒组胎鼠经茜素红染色后未发现下颌 吕丹瑜等.二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用 骨,肋骨发育存在融合,多生等现象. 表l二甲苯对胎鼠体重的影响 Table1Effectofxyleneonbodyweightoffetalmice *:与对照组相比,P<0.05(comparedwithcontrolgroup,P< 0.05) 表2妊娠小鼠血清含量的比较 Table2Comparisonofironlevelin~erumofgravidmice *:与对照组相比,P<0.01(comparedwithcontrolgroup,P< 0.01) 表3妊娠小鼠血清M'含量的比较 Table3Comparisonofmagnesiumlevelinserumofgravidmice *:与对照组相比,P<0.05(comparedwithcontrolgroup,P< 0.05) **:与对照组相比,P<0.0l(comparedwithcontrolgroup,P< 0.01) 表4妊娠小鼠外周血有核细胞数目比较 Table4Comparisonofkaryocytenumbersinperipheralbloodof gravidmice *:与对照组相比,P<O.o5(comp~withcontrolgroup,P< 表5二甲苯对妊娠母鼠发生流产的影响 Table5Effectofxyleneontheoccurrenceofabortioningravid mice 二甲苯浓度(g/m3)有正常胚胎的妊娠母鼠数 c0ncentrati0nofnutub — erof — gravidmicewi — thnormalfetus xylene(ms/~)?1211—5<5 对照组(controlgroup) 500 1000 2000 讨论 二甲苯工业用途广泛,是一种高脂溶性的有机 溶剂,该化学物质具有广泛的生物学毒性,可对代谢 酶类,造血系统,神经系统及肝功能产生影响.目前 部分研究发现,二甲苯引起小鼠胚胎发育延迟呈剂 量依赖性],但对于母体的毒性及对实验动物生殖 系统影响的相关报道尚不多见,仅有资料表明,雌性 个体对苯系混合物的敏感性较雄性个体强.本研究 通过对血清微量元素含量,外周血有核细胞DNA损 伤等指标的观察表明,二甲苯可引起妊娠母鼠外周 血有核细胞DNA损伤,并使血清Fe",Mg2含量显 着降低.通常状况下,小鼠妊娠时期母体的血容量, 凝血因子(除XI,XlI外),有核细胞数量均增加,微 量元素存在着动态改变.由于母体血液经胎盘与胚 胎发生物质交换,因此,一旦母体血液系统损伤将直 接或间接影响宫内胎儿的生长发育.由于Fe是 构成血红蛋白和肌红蛋白,细胞色素的重要成分,同 时也是体内多种酶的活性中心.在正常情况下妊娠 妇女血清Fe含量较未妊娠妇女显着增高,而发生 流产时即发生低Fe",引起低血色素性贫血,使血 红蛋白携氧能力下降,引起慢性缺氧,因此可导致胚 胎生长发育障碍.Mg2作为多种酶的辅助因子参 与糖,脂肪及蛋白质的代谢,同时也是蛋白质和高能 物质合成必需离子,参与神经细胞的再生,修复及维 持膜结构的完整.由于Mg2是胎儿发育过程中不 可缺少的营养成分,然而它的获得只能依靠母体血 液供给,所以,母体血液中Mg2含量的变化对胎儿 发育具有非常重要的影响.如果妊娠时期缺Mg2 或Mg2与其他有关微量元素比例失调,引起酶活性 降低,胎儿的核酸,蛋白质代谢异常,胚胎发育过程 可直接受到严重干扰H.由此推测,本实验中二甲 苯引起母体血清Fe",Mg2水平下降可能是导致胎 鼠体重减轻,发育迟缓的原因之一.本研究发现,发 生急性二甲苯中毒时还可造成妊娠母鼠有核细胞数 量降低并出现棘形红细胞增多症.由于棘形红细胞 通常作为区别肾性血尿和非肾性血尿的特征性标志 物,它的出现与肾小球疾病密切相关,因此我们推 重二 ?$牵?_l干静自}m{)砷n 目2染毒?中毒:m,姬坶自&酊脑膜样×4? 3SCGE慷外m常细?I)NA.彤400 4毒m胞罐SCCE目俾,DNA榷崔DNA断自m&方向#并形(十) 咖 5毒*f口c十)x25 月6毒腩脑膨忡自焯x4 7毒Fm(十)x3 目8毒m帷&?{fT方框自小虹椎]00 Rg1e…mH0"{_}Jeff._)I咖immobii*1ntj……1.8??lmlPcIhenLa~e)likdv 2Wright.Gimmn.m州1??inpkmlnhof哪'thaiexpenen~dddendeath…I…vx403 F.g3DNA0rke.~tel"penph.e~b…mred…ofSCGEIhn_,i…x4? F4DNA0rk"mnm??lJw…qi)~Fcr0fSCGE…withDNAdmnaSeshowedLI nennvet0…k日foxedc?(十)x枷 Fig5S…e"hnl0…d……of8n】dgrvup(十】25 F6F~Lt,I…in"ml…J…lu~howod一…f哪kdq,tx4 7F~ta]…iu………de曲mm(+)H3 68附Hl…indn叫…"p~howMdH0md"Pl…(').__n日P0母h…ti…om…i00 一一一一 Vo1.37.No.3吕丹瑜等.二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用?359. 测,急性二甲苯中毒可能通过造成急性肾脏功能损 伤而导致孕鼠发生急性死亡. 二甲苯属低分子量化合物,容易通过人,大鼠及 小鼠胎盘屏障直接作用于胚胎,研究发现,大鼠经 二甲苯染毒2h后,胎鼠血中二甲苯浓度约为母血 的25%,30%;由于苯具有较强的细胞遗传效应, 能引起各种类型的染色体畸变,因此导致自然流产, 低体重出生的发生率偏高.流行病学研究发现, 妊娠早期接触二甲苯与自然流产危险性增加有关. 大鼠致畸实验进一步证实,在器官发生期内进行二 甲苯或其异构体染毒,在母体有轻微毒性的情况下 即存在胚胎毒性,主要表现为胚胎体重下降,发育迟 缓和胚胎吸收现象.有报道称,大鼠在整个孕期 (4,20d)连续16d接触二甲苯870mg/m3,可增加 胎鼠除前囟外颅骨骨化延迟发生率,同时二甲苯 也可引起植入后期受精卵着床失败,腭裂,脑积水, 两性畸形并少数内脏畸形的发生.此外,由于二 甲苯具有高度亲脂性,在通过胎盘屏障后,进入胚胎 体内可达中枢和周围神经系统,并且对神经细胞 具有直接毒性作用?,实验动物子代神经行为学的 研究发现,二甲苯对胚胎的毒性作用甚至可以持续 到子代出生后,主要表现为染毒孕鼠子代翻正反射 出现延迟,脑组织绝对重量下降,学习能力和运动能 力均受到影响,且以雌性仔鼠更为明显. 二甲苯虽属低毒物质,本研究结果提示,二甲苯 可对妊娠小鼠产生毒性效应并影响胚胎发育.吸入 二甲苯可通过对妊娠母体血液系统造成损伤进而导 致自然流产发生及胚胎发育迟缓;同时,二甲苯也可 通过母体血液经胎盘直接造成胚胎毒性,其毒性作 用机理还需进一步研究探讨. 参考文献 [1]SaillenfaitAM,GallissetF,MoretG.eta1.Developmentaltoxicities ofethylbenzene,ortho-,meta-,para?xyleneandtechnicalxylenein ratafollowinginhalationexpo~[J].FoodChemToxicol,2003,41 (3):415-429. 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