发状念珠藻中麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆和序列分析

发状念珠藻中麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆和序列分析 Vol ,4 0 ，No ,2 第4 0 卷 第 2 期上海师范大学学报( 自然科学版) 2 0 1 1 4 Journal of Shanghai Normal University( Natural Sciences )年 月 Apr ,， 2 0 1 1 发状念珠藻中麦芽寡糖基海藻糖水解 酶基因的克隆和序列分析 * ，，，何靓吴双秀沈蓉蓉王全喜 ( ，上海师范大学 生命与环境科学学院上海 200234) ( Nostoc flaglliforme) MTHase : 摘 要从发状念珠藻中克隆出麦芽寡糖基海藻糖基水解酶 的基 TreZ，1848 bp，615 , 因 对该基因核苷酸序列测序明开读框全长 编码的蛋白质有 个氨基酸根 TreZ MTHase , TreZ TreY 据基因序列预测的 氨基酸序列具有 的催化功能保守区发菜 和 与点形 ( Nostoc punctiforme) TreZ TreY , : 念珠藻的 和 有很高的同源性结果初步表明可以从发状念珠藻 TreZ，中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因 为进一步研究海藻糖代谢在发状念珠藻抗逆机 ,理的工作奠定了理论和实验基础 : ; ; ; 关键词发状念珠藻麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因克隆序列分析 : Q785A1000-5137( 201012) -0202-05: : 中图分类号文献标识码文章编号 ,1, ( Nostoc flaglliforme Born, et Flah, ) ，、，发菜是发状念珠藻的俗称它广泛分布于干旱半干旱地区对 , 2007 极端环境具有很强的适应性本实验室已于 年在干旱胁迫条件下测得发菜中有海藻糖的积累,2,, 2 ，、海藻糖是由 个葡萄糖分子经半缩醛羟基结合而成的一种非还原性二糖它具有很强的热稳定性酸 ，( 、、、) 稳 定性和化学稳定性在严酷环境下脱水高温高渗透压重金属等可以保护生物体的组织和大分,3 ) 4,，,子 的功能和活性因此被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢产物 ，( mal-海藻糖在生物体内的合成途径因物种的不同而有所不同其中通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶 tooligosyl trehalose synthase，MTSase) ( maltooligosyl trehalose trehalohydrolase，和麦芽寡糖基海藻糖水解酶 MTHase) , 2008 ，合成海藻糖是低等生物海藻糖合成途径中重要的一种方式年本实验室成功从发菜中, 5 ,MTSase TreY( NfTrY) ( GenBank F433294) ，2010 E克隆了编码 的基因 简称 数据库的基因编号为 年在 MTHase TreZ( NfTreZ) ，GenBank 此基础上又克隆到了发状念珠藻中编码 的基因 简称 片段提交 数据库 HM802214, MTHase TreZ ORF 的基因编号为 本研究对发状念珠藻中编码 的基因 的 片段再次克隆并确 ，NfTreZ NfTreY 认核苷酸序列同时将该基因 和发菜中另一个海藻糖合成酶基因 序列进行了生物信息学 ，,分析为全面揭示发菜中参与海藻糖代谢的酶和相应基因的研究奠定基础 1材料与 1, 1 实验材料 ; PMD19 )T ( Takara 本实验所用发菜干体采自内蒙古苏尼特左旗载体以及各种酶为大连 生物公 : 2010-10-20收稿日期 : ( 03JC14057) ; ( 05DZ29) ; 基金项目上海市基础研究重点项目上海市教委科研项目上海市教育委员会重点学科建 ( J50401) ; ( DZL808)设项目上海师范大学细胞生物学校级重点学科 : ( 1986) ) ，，; ( 1956 ) )， ，，作者简介何 靓 女上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生王全喜男博士上海 ,师范大学生命与环境科学学院教授 , 1, 2 实验方法 1, 2, 1 DNA提取发状念珠藻总 , 6 ,SDS) C TAB , ，，37? 2 : 4 h 采用 法首先取适量干发菜用双蒸水洗净其中杂质于 恒温箱内 至半 , ，Eppendorf buffer,100 mmol / L Tris )，干状态在灭菌的研钵中用液氮研磨装入灭菌的 管中加入裂解 HCl，20 mmol / L EDTA，2% lauroyl sarcosine ( w / v) ，42%urea ( w/ v) ,600 L，， μ用枪头吹吸均匀使裂 ,7, , 《》: 、、解液与材料充分接触然后按照分子克隆试验指南的基本操作步骤依次加入苯酚氯仿异戊醇 , 1 /10 NaAC DNA，2 分别依次抽提和高速离心取上清最后用上清液的 体积的 和 倍体积的异丙醇沉淀 ，, ,离心电泳检测注意全程操作需在冰上完成 、、DNA 、《质粒抽提电泳鉴定片段回收连接反应等基本分子生物学实验操作均按照分子克隆实验 , 7 ,》, DNA ,指南进行操作的测序由上海桑尼生物技术有限公司完成 1, 2, 2PCR DNA 引物合成和 测序 PCR 1,，引物合成由上海生工公司完成引物序列见表 1 发状念珠藻 TreZ 表的克隆和表达所用引物 引物用途 P1:5 'GTGAAAATTGGTGCTAACTACTTG3' 扩增，上游完整 DNA ，DNA P2:5 'TCATCCTTTTTCATAGAGTACTAAAC3 ' 完整 扩增下游 1, 2, 3TreZ ORF PCR 发状念珠藻 基因 片段的 扩增 GenBank NfTreZ HM802214 DNA ，参照本实验室提交 的发菜 基因编号 所提供的 片段序列借助于 NCBI ORF finder( www, ncbi, nlm, nih, gov, ) NfTreZ ( ORF) “”上分析 全长序列中潜在的开放阅读框设 PCR ( P1、P2) , La Taq , : DNA ，PCR 计 特异性 引物以发菜总 为模板用 聚合酶进行 扩增扩增条件为 94 ? 5mn，94 ? 30 mn，66, 4 ? 1 mn，72 ? 3 mn，30 , PCR iiii预变性 变性 退火 延伸 个循环将 扩增产物 PMD19 )T ，DH ) 5，，用试剂 盒纯化后连 载体转化大肠杆菌 α选择抗性单克隆提取质粒分别用限制性 PCR ,，内切酶 酶切分析和 方法筛选鉴定电泳初步鉴定正确后再进行测序确认 1, 2, 4 TreZ 发菜 序列分析和同源性比较 Clustal X 1, 83 MTHase NfTreZ MTSase NfTreY 用 软件对发状念珠藻编码 的基因 和编码 的基因 与其 MTHase MTSase ; PHYLIP MTHase 它原核细菌编码 和 的核酸和氨基酸序列进行比对用 软件建立 和 MTSase ,系统发育树 2 结果 TreZ ORF DNA PCR 2, 1基因 片段 序列的 扩增 3 TreZ、TreY 发状念珠藻中参与海藻糖代谢的 个基因在其细胞核基因组中的排列顺序可能是按照 ,5,TreH( ) , TreZ 和 海藻糖水解酶基因的顺序排列本实验室前期利用兼并引物克隆到一条与 基因具有 2300 GenBank( M802214) , DNA ，H同源性的 左右长度的 片段其核苷酸序列提交 基因编号 本实验参照 DNA ，NCB ORF finderNfTreZ DNA I“”该基因序列号所提供的 片段序列借助于 上分析 基因 序列中 ( ORF) ，P1 P2，PCR ，潜在 的开放阅读框根据开放阅读框两端序列合成引物 和 进行 扩增对扩增产物进 ，1900 bp ( 1) , PMD19 )T DNA 、行电 泳检测得到 左右的 片段图 对扩增产物分别进行纯化回收连接 载、，，: PCR NfTreZ 体转 化大肠杆菌和鉴定选择正确的单克隆进行测序结果表明上述 扩增得到的发菜 ORF 1848 bp，NCBI BLAST，基因 片段全长为 对其翻译的氨基酸序列在 上进行 结果显示该氨基酸序列 ( Nostoc upnctiforme) MTHase 92% ,与点 形念珠藻的同源性达到 204 上海师范大学学报( 自然科学版)2011 年 图 1 发菜 TreZ 全基因 PCR 扩增结果电泳图 fTreZ N2, 2的序列分析 2, 2, 1 NfTreZ 的序列特征分析 DNATool 5, 1 NfTreZ DNA 用生物学软件 对这个 基因编码区的 序列及翻译的氨基酸序列进行分 ，: ( G + C) 44, 64% ，NfTreZ ORF 615 ，析结果表明该基因含量为 基因 片段编码一个含 个氨基酸的蛋白 70, 19 kDa，pI 5, 28( 2) ,计算其相对分子质量约 为表 表 2 发状念珠藻中 TreZ 的生物信息学序列分析 基因序列长度( bp)氨基酸长度( G + C) 含量( % )预测分子量大小( kD)pI 值 TreZ184861544, 6470, 195, 28 2, 2, 2NfTreZ NfTreY 和 的序列特征分析 Clustal X 1, 83 NfTreZ NfTreY 用 比对 基因和相同途径合成海藻糖的另外一个重要基因 序列与其他 TreY TreZ ，: MTHase , PHYLIP 原核细菌 和 的序列结果表明其氨基酸序列具有 的催化功能保守区通过 TreY TreZ ( 2 3) , : NfTreZ NfTreY ，软件获得这几种原核细菌 和 进化树图 和图 结果显示与 的进化树结 ，( Nostoc punctiforme) ，73102(N ostoc punctiforme 果一致均与点形念珠藻的同源性最高其次是点形念珠藻 PCC 73102，) 7120 ( Nostoc sp, PCC 7120) 29413 ( Anabaena variablilis ATCC然后是鱼腥藻 和多变鱼腥藻 29413) ( 2 3) ,的同源性也很高图 和图 图 2 NfTreZ 系统进化树分析 图 3 NfTreY 系统进化树分析 3讨论 1994 Q36 MTSase MTHase ，年日本林原生化研究所在节杆菌 中发现了 和 双酶作用下能够直接水,8,,9,，( Brevibacterium helvolum) 、( Sulfolobus solfa- 解淀粉产生海藻糖随后在微黄短杆菌硫矿硫化叶菌,10,,11,taricus) 、( Mycobacterium tuberculosis) MTSase ，及结核分枝杆菌中得到证实这条途径首先由 通过分 ) 1，4 ) 1，1 ，MTHase 子内转糖基作用将淀粉糖链还原末端的 α 糖苷键转化为 α 糖苷键然后 再进一步 ) 1，1 )1 ，4 2 水解与 α 糖苷键相邻的 α 糖苷键生成海藻糖和比初始糖链少 个葡萄糖残基的麦芽 , 8 , ,寡糖,5,NfTreY ，继从发状念珠藻中克隆到合成海藻糖的 基因又克隆得到另外一个海藻糖合成酶基因 NfTreZ，1848 bp, TreZ 该基因开读框全长为 通过序列分析和与其他物种中已报道的 进行比较和生物信 NfTreZ NfTreY 、7120 TreZ TreY 息学分析表明 和 都与点形念珠藻鱼腥藻 等的 和 有着更近的种系发生关 ( 2 3) ，系图 和图 这也与文献报道的发状念珠藻的海藻糖合成途径可能与原核细菌如念珠藻和鱼腥藻 ,5,、,的途径相似而与大肠杆菌酵母和高等植物的不同的结果一致 ，2 3 ，( Sufoobus) TreZ TreY ll另一方面由图 和图 可以看到硫矿硫化叶菌属细菌的 和 聚类在一个 ，( Nostoc) ( Anabaena) TreZ TreY ，组点形念珠藻属和鱼腥藻属的 和 聚类在一个组这与形态学分类的结 , ，MTSase MTHase 果一致而且两个组又聚类在一起表明它们的海藻糖合成酶 和 之间有着更高的同源 ，, 性可以推测这些海藻糖生成相关酶可能有共同的进化来源硫矿硫化叶菌属细菌与点形珠藻属和鱼腥 、，藻属物种的生境都是经常遭受高温干旱或渗透胁迫等极端环境海藻糖生成途径是为适应恶劣生境而 ，,发展起来的抗逆代谢适应这一代谢途径的进化或保留可能跟生境适应关系密切 NfTreZ NfTreY 、、、、、关于发状念珠藻中海藻糖生成的相关基因 和 在高温低温干旱渗透强光氧化胁 迫下的表达调控和海藻糖的积累与发状念珠藻的极强抵抗胁迫能力的分子机理的研究还在进一步研究 ，,中本实验结果为深入开展这些研究提供了重要的实验基础 :参考文献 ,1, ，，，, ,J,, ( 1 ) : ，2003，17 唐进年张竅明聂文果等发菜形态特征及其与环境因子的关系干旱区资源与环境123 ) 127, , 、,J,, : ，2007， ，，，,2, 庞婉婷吴双秀于晶等干旱胁迫下发菜原植体中海藻糖蔗糖测定上海师范大学学报自然科学版 36( 3) : 73 ) 76, MASAR K，YUTAKA M，MASSAKO K，eta l, Purification and characterization of newtr ehalose )p roducing enzymeisso la- ,3, 206 上海师范大学学报( 自然科学版)2011 年 ted from theh yperthermophilic archaeumS ulfolobus solfataricus KM1,J,, Biosci Biotech Biochem，1996，60 ( 3 ) : 546 ) 550, 4, , KATO M, Trehalose production with a new nezymatic system fromSu lfolobus solfataricus KM1,J,, Journal of molecular ca- talysis B: Enzymatic，1999，6( 3) : 223 ) 233, ,5, WU S X，SHEN R R，ZHAN G X，et al, Molecular cloning and characterization of 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Y T，KAROTH E V，JOURDIAN W J，et al, Trehalose synthase oMfy cobacterium smegmatis: purification，cloning， ex- pression，and properties of the nezyme,J,, Euro JB iochem，2004，271( 21) : 4259 ) 4269, Cloning and sequencea nalysis of maltooligosyltrehalose trehalohydrolase genef rom nostoc flagelliforme * HE Liang，WU Shuang-xiu，SHEN Rong-rong，WANG aQnu-xi ( College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China) Abstract: A ORF fragment oTfre Z gene necoding the maltooligosyl trehalose trehalohydrolase was lconed from Nostoc flaglli-forme, The nucleotide sequencen aalysis revealed that the opernea ding framel ength of theT reZ genei s 1848 bp，encoding a pro- tein with 615 amino acids, The sequencaen alysis showed thaNt fTreZ gene andN fTreY gene werehi ghly homologous to thoseof Nostoc Punctiforme and NfTreZ-encoded enzymea lso had the conservecdat alytic function of maltooligosyl trehalose trehalohydro- lase, The results showed that thTere Z from Nostoc flaglliforme was lconed successfully and this work provided a theoretical and experimental basis for further study troefh alose metabolism in Nostoc flaglliforme response to stress resistance mechanism, Key words: nostocfl aglliforme; maltooligosyltrehalose trehalohydrolase; cloning; sequencen aalysis ( : )责任编辑顾浩然