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中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的发现

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中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的发现中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的发现 华中科技大学硕士学位论文中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的 发现姓名姚淇申请学位级别硕士专业生物化学与分子生物学指导教师王擎20080529 华中科技大学硕士学位论文 I摘 要 无虹膜症aniridia是一种严重的眼内先天异常一 般为双侧性发病率为1/96000-1/64000。病变通常还涉及到角膜、晶状体、视网膜及 视神经常常伴随眼部的其他疾病如白内障、角膜混浊、青光眼、黄斑及视神经发育 不良等。患者通常表现为虹膜缺如或虹膜组织高度发育不良可直...
中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的发现
中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的发现 华中科技大学硕士学位论文中国人群导致先天性无虹膜症PAX6基因突变Q301X的 发现姓名姚淇申请学位级别硕士专业生物化学与分子生物学指导教师王擎20080529 华中科技大学硕士学位论文 I摘 要 无虹膜症aniridia是一种严重的眼内先天异常一 般为双侧性发病率为1/96000-1/64000。病变通常还涉及到角膜、晶状体、视网膜及 视神经常常伴随眼部的其他疾病如白内障、角膜混浊、青光眼、黄斑及视神经发育 不良等。患者通常表现为虹膜缺如或虹膜组织高度发育不良可直接看到晶状体赤道 部边缘、悬韧带及睫状突。临床症状有畏光及视力低下若有进行性角膜混浊、晶状 体浑浊及青光眼者常导致失明。约2/3的患者有家族病史表现为常染色体显性遗传余 1/3患者为散发病例。 根据目前研究PAX6基因被鉴定为无虹膜症的候选基因。关于 无虹膜症的研究国际上已有较多资料但在我国人群中对致病基因的类型以及临 床表现与基因突变关系的报道较少而以病例较多。我们收集到一个连续3代发病 的常染色体显性遗传的无虹膜症家系。我们选取家系患者和无症状的个体作为代表 进行详细的眼科检查了解该家系的表型特征随后对候选基因进行突变检测。实验结 果发现PAX6基因的第11外显子上的Q301Xc.901CgtTQ301X突变。该家系所有患者 都携带这一突变而正常人则未检测到这一改变。Q301X该突变位点位于PAX6蛋白靠 近羧基端的富含脯氨酸、丝氨酸及苏氨酸的结构域proline-serine-threonine rich domain PST的起始位置。突变导致PAX6蛋白在翻译过程中在PST结构域提前终止使 得异常蛋白缺失PST结构域而丧失功能不能发挥转录因子的作用。研究表明PAX6蛋 白的表达水平是决定无虹膜症表现型的关键因素。这一突变是该家系中患者致病的 遗传基础。 我们在中国人群中首次发现PAX6基因的Q301X突变可引起中国人患有 先天性无虹膜这一研究对于理解中国先天性无虹膜的遗传基础以及病人的基因诊断 具有一定的理论和应用价值。 关键词无虹膜PAX6基因Q301X突变 华中科技大学硕 士学位论文 IIAbstract Aniridia is a severe intraocular congenital anomaly and in general affects both eyes. The incidence is 1/96000-1/64000. Its pathological changes also involve the cornea the crystalline lens the retina and the optic nerve and can associate with other diseases such as cataract cloudiness of cornea glaucoma macular degeneration and optic nerve maldevelopment. The patient usually displays lack of iris. The clinical symptoms of patients are photophobia and low vision the cloudiness of cornea cloudiness of crystalline lens and glaucoma which often cause patients to lose sight. Approximately 2/3 of the patients have the family history and follow the autosomal dominant inheritance pattern. The remaining 1/3 of the patients are sporadic cases. We characterized a 3 generation family with autosomal dominant aniridia. We carried out detailed ophthalmic examinations for selected patients and normal family members. We carried out mutational analysis of the PAX6 gene in the family and identified the Q301X c.901CgtTQ301X mutation in the 11th exon. All patients in the family carry the mutation but the normal family members do not carry the mutation. These results suggest that the Q301X mutation in the PAX6 gene is the causative factor in the Chinese family. This is the first time that the Q301X is identified in the Chinese population. Q301X is located in the domain rich in the proline serine and threonine residues PST at the C-terminus. The mutation causes the PAX6 protein to terminate before the PST domain generating a truncated protein without the PST domain and creating a non-fucntonal transcription factor. This study identifies a new mutation in the PAX6 gene in the Chinese population and expands the spectrum of PAX6 mutaitons causing the aniridia phenotype. Keywords: Aniridia PAX6 gene Mutation 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知除文中已经标明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? 在 年解密后适用本授权书。 不保密?。 请在以上方框内打“?” 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 本论文属于 华中科技大学硕士学位论文 11 绪论 1.1 无虹膜症定义和临床症状 无虹膜症 aniridia 是一种严重的眼内先天异常 一般为双侧性 发病率为1/96000-1/640001。病变通常还涉及到角膜、晶状体、视网膜及视神经 常常伴随眼部的其他疾病 如白内障、角膜混浊、青光眼、黄斑及视神经发育不良等。患者通常表现为虹膜缺如或虹膜组织高度发育不良 可直接看到晶状体赤道部边缘、悬韧带及睫状突。临床症状有畏光及视力低下 若有继发性角膜混浊、晶状体浑浊及青光眼者常导致失明。该病发生可能与早期胚胎发育过程中胚裂闭合不全有关。约2/3的患者有家族病史 表现为常染色体显性遗传 余1/3患 眼球分为眼内容和眼球者为散发病例2。 1.2 虹膜的结构和生理 1.2.1 虹膜的结构 壁两大部分。其中眼球壁包括外、中、内三层 外层包括角膜和巩膜 中层为葡萄膜 内层是视网膜 图1.1 。 虹膜介于前房与后房之间 是葡萄膜的最前部 后面有晶体支托 为一圆盘形膜。它的根部和睫状体前缘相连 向中央延伸到晶状体前面 成为将眼球前后房分开的一个重要隔膜。虹膜中央有圆孔 称为瞳孔 它的平均直径为3mm 瞳孔的大小随光线的强弱而改变 从1mm到8mm 。瞳孔周围虹膜的基质内 有环形排列的瞳孔括约肌 使瞳孔收缩 虹膜基质层后面有放射状排列的肌纤维 称瞳孔开大肌 使瞳孔开大。 在虹膜前表面距瞳孔缘约1.5mm处 有一隆起的环状条纹 即虹膜小环。虹膜小环将虹膜表面分为两个区域 小环内部为瞳孔区 外部为睫状区。在虹膜小环附近 有许多大小不等的穴状凹陷 叫虹膜隐窝 在睫状区的周边部也有隐窝 它们是虹膜前层的中胚叶组织局灶性萎缩形成的。隐窝部分的虹膜组织 由于缺少前表华中科技大学硕士学位论文 2面层 房水可以直接与虹膜基质中的血管接触 有利于虹膜和房水间的液体交换。在虹膜周边部有与角膜缘成同心排列的皱褶 系为瞳孔开大时形成的皱襞。瞳孔缘的窄黑色环 呈花边状 是由虹膜后色素上皮层向前延伸所致。此黑边当瞳孔扩大时变窄 缩小时变宽 这种现象称为生理性葡萄膜外翻3。 图1.1 眼球的结构 Figure 1.1 Schematic diagram of the structure of an eyeball 引自葛坚. 眼科学. 第一版. 人民卫生出版社 2005. 虹膜的组织结构 图1.2 由前向后可分为4层 1 前表面层 2 基质与瞳孔括约肌层 3 前色素上皮与瞳孔扩大肌层 4 后色素上皮层。 1 前表面层 该致密组织由成纤维细胞和色素细胞的突起互相吻合交错所形成 其中还有胶原纤维和神经末梢。在虹膜隐窝处 此层膜完全缺如。前表面层在虹膜根部嘎然而止 有时前表面层也可呈丝状、带状沿小梁网葡萄膜部的内侧面延续 甚至可达角膜后弹力层的上端 形成虹膜梳状韧带的一部分。 由睫状后长 动脉和睫状前动脉的分支吻合而成一粗大的血管环 称虹膜动脉大环。在虹膜的瞳孔缘附近 有一环行的血管吻合 称为虹膜血管小环 它并不是一个完整的血管环。、 2 基质与瞳孔括约肌层 瞳孔括约肌位于虹膜瞳孔区基质层的后部 为围绕华中科技大学硕士学位论文 3瞳孔缘的环行平滑肌纤维束 宽约0.8-1.Omm。括约肌的后面与结缔组织的致密层相连接 这些结缔组织与瞳孔开大肌相延续。 图1.2 虹膜的组织结构 Figure 1.2 Histological Structure of Iris 引自葛坚. 眼科学. 第一版. 人民卫生出版社 2005. 3 前色素上皮与瞳孔开大肌层 虹膜有两层上皮 即前上皮层和后上皮层。前上皮层也就是瞳孔开大肌层 为紧贴后色素上皮层的薄层平滑肌 自瞳孔缘直达虹膜根部。 4 后色素上皮层 该层位于瞳孔开大肌层之后 为一层具有浓密色素的细胞 在瞳孔缘处出现在瞳孔领的虹膜表面 形成瞳孔缘的色素边。后上皮细胞的顶部朝向虹膜基质 与前上皮层细胞的顶部相连接 基底部朝向后房4。 华中科技大学硕士学位论文 4虹膜的间隔作用和其中央圆孔-瞳孔 成为光学系统上的光栅装置。瞳孔括约肌和开大肌控制瞳孔的运动从而控制进入眼内的光线的数量。虹膜后表面的两层上皮向后分别移行为睫状体的色素上皮层和无色素上皮层。 1.2.2 虹膜的生理 1.2.2.1 虹膜的神经支配 虹膜的神经来自睫状神经丛 在虹膜中形成各种神经丛。瞳孔括约肌由属于副交感神经的动眼神经的纤维支配 瞳孔开大肌由交感神经纤维支配。虹膜的感觉神经纤维来自三叉神经的第一支。 1.2.2.2 虹膜的功能 虹膜的间隔作用和其中央圆孔 瞳孔 成为光学系统 因光线照射的强弱而散大或缩小。瞳孔括约上的光栅装置。瞳孔是主要光学窗口 肌和开大肌控制瞳孔的运动和进入眼内的光线的数量。瞳孔的大小 也受到神经的影响。瞳孔的变化既可以调节入射到眼内的光线的数量 又可以调节角膜、晶状体等屈光间质所致的球面差和色差 减少不规则光的影响 使成像清晰。瞳孔对光反射的途径是 光?瞳孔?视网膜的黄斑纤维?视神经?视交叉?视束?上丘臂?上丘和顶盖前区。然后由顶盖前区发出神经纤维 到同侧和对侧的第三神经核?睫状神经节?瞳孔括约肌。出生时 人的虹膜前表面有一层内皮细胞覆盖 但1-2岁以后内皮细胞消失 为成纤维细胞所代替。 不同人种的虹膜颜色主要由基质中色素细胞所含色素的多少决定。 目前已知人患白内障的主要环境因素之一就是长期强烈的太阳光照射 长年累月的紫外线照射积累 对此人类的防御能力则很大程度上取决于虹膜中的黑色素含量多少。虹膜越黑 透过的光线 尤其是紫外线越少 但是浅色眼睛透光性能强 吃亏不少 因而在白种人中患后天白内障的发病率更高。 据1989年和1994年的两篇文献报道 虹膜的颜色会影响视觉的感知 主要是华中科技大学硕士 宦畚?5视觉反应敏锐性等参数。有人特意研究眼睛颜色对运动反应时间的影响。虹膜的颜色深浅 影响对光线的敏感度 最终会影响视觉对运动物体的反应。研究者测试了眼睛颜色深浅不同的人种在不同运动中的表现 结果发现 深色眼睛的人在拳击、乒乓球等需要快速反应的运动中表现更佳5。 1.2.2.3 虹膜的血液供应 虹膜富含血管 参与营养与抗体的扩散渗透和吸收。分布在虹膜的许多动脉细支常从虹膜动脉大环发出 经虹膜的睫状部呈放射状达瞳孔缘。在虹膜血管小环处有少数动脉支与相对的静脉支吻合成不完整的环 所以没有真正的虹膜动脉小环 而只有虹膜血管小环存在。大多数血管直接到达瞳孔缘 分支成毛细血管后折回 形成静脉的开始。虹膜的静脉彼此吻合 在虹膜根部进入睫状肌 与睫状突的静脉吻合后经脉络膜至涡静脉。部分静脉血流入睫状静脉。 1.3 眼的发育 1.3.1 眼的发 育简要概述 胚胎第3周 前脑两侧形成视泡 伸出视茎 表面外胚层出现晶状体始基。 胚胎第4周 晶状体泡形成 视泡凹陷成为视杯。在视杯和晶状体泡之间 中胚层组织分化 胚胎裂出现玻璃体动脉。视网膜呈现两层 初期视乳头形成 角膜上皮层及眼外肌始基开始分化。 胚胎第5周 胚胎裂开始闭合 晶状体上皮分化纤维 晶状体泡外面形成囊膜并出现血管膜 出现脉络膜血管网 初期视细胞分化。 胚胎第6周 胚胎裂闭合 晶状体纤维充填其间空隙 瞳孔膜形成 原始玻璃体生成 视网膜各层分化。角膜基质和内皮细胞开始形成。 胚胎第7周 形成眼睑 眼外肌开始分化 前、后睫状动脉出现 视神经发育 虹膜基质产生 泪小管以细胞索形式出现。 胚胎第8周 巩膜生成 视茎被神经纤维充满 视交叉和视束发育 眼眶部形成泪腺 眉毛始基出现。 华中科技大学硕士学位论文 6胚胎第9周 上下睑缘愈着 巩膜增厚 玻璃体血管开始萎缩 第二玻璃体出现。 胚胎第10周 视细胞进一步分化。 胚胎第11周 睫状肌和睫状突始基出现。 胚胎第12周 眼轮匝肌生成 晶状体悬韧带开始出现。 胚胎第4个月 视神经管形成 提上睑肌和眼球筋 5个月 泪道延伸至鼻腔。 胚胎第6膜囊出现 视网膜中央动脉开始分支。 胚胎第 个月 黄斑部发育。 胚胎第7个月 瞳孔膜消退 玻璃体动脉闭塞 上下眼睑分开。 胚胎第8个月 晶状体血管膜消退。 胚胎第9个月 视神经外包裹髓鞘 玻璃体血管萎缩。 华中科技大学硕士学位论文 71.3.2 眼球发育示意流程图 图1.3 眼球发育简单流程图 Figure1.3 Flow chart of development of the eyeball 引自葛坚. 眼科学. 第一版. 人民卫生出版社 2005. 1.3.3 胚眼的发生和形成 机体的发育从受精卵开始 经历卵裂、桑椹胚、囊胚、原肠胚、神经胚、胚胎、华中科技大学硕士学位论文 8胎儿、孕体、原基等阶段 直到出生为婴儿。机体各细胞、组织、器官均由囊胚发育 经细胞繁殖分化成的内、中、外三个胚层 在基因与基因外因素相互作用下 经过胚胎诱导、获得细胞决定、产生细胞分化这些循环反复并有精密的时间和空间顺序的过程 最终发育而成。眼的发育及其调控与整个机体的发育和调控有着紧密的联系。眼特别是视网膜 是大脑的延伸部分 所以眼的发育和神经系统尤其是中枢神经系统的发育关系最为密切。人胚第3周初 位于原条前方的神经外胚层受诱导增厚形成细长形的神经板 神经板逐渐长大凹陷形成神经沟 神经沟闭合成神经管。然后神经管前段膨大 衍化为脑 后段细小 衍化成脊髓。神经沟愈合为神经管过程中 神经沟边缘与表皮外胚叶相延续的一部分神经外胚叶细胞在神经管背外侧形成左右两条与神经管平行的神经嵴。当神经褶融合成神经管时 神经褶头部在脊索前方发育成较宽的两叶状态 即前脑的始基。在宽大的神经褶内面各出现一道浅沟 称为视沟 开始胚眼的发育。 雌雄配体形成受精卵 孕6天-8天即形成桑椹胚与胚囊 到孕16天 已具备三胚叶胚层分化能力。胚眼由神经外胚叶、表皮外胚叶和中胚叶发育而成。胚胎22天 第四周开始时 由神经管发育而来的前脑两侧神经褶内陷 形成视沟。视沟继续深陷 向表皮外胚叶靠近 形成腔室 称为视泡。此时神经褶相互融合形成前脑泡。视泡远端不断膨大 继续向表皮外胚层生长、贴近 进而发生内陷形成双层杯状结构 称为视杯。同时 视杯近端与前脑连接处缩窄变细 形成视柄 为视神经始基。视泡与表皮外胚层接触后 诱导该处的表皮外胚层增厚形成晶状体板 为晶状体始基。然后晶状体板内陷入视杯内 且渐与表皮外胚层脱离 形成晶状体泡。视杯逐渐深凹并包围晶状体 视杯前缘最终形成瞳孔。视杯早期下方为一裂缝 称为胚裂。围绕视杯的中胚叶玻璃体动脉经视裂进入视杯 内 营养视杯内层、晶状体泡及视杯间质 玻璃体静脉由此回流。视裂于胚胎第5周时开始闭合 由中部开始 向前后延展 当胚长达17mm时 除了沿视茎下面外 完全闭合。玻璃体动、静脉穿经玻璃体的一段退化 并遗留残迹.称玻璃体管 其近段则分化为视网膜中央动脉、静脉。如果胚裂闭合不全 则会形成虹膜、睫状体、脉络膜或视盘的缺损。在视泡形成至胚裂闭合过程中 包绕视杯、视柄、晶状体泡的中胚叶逐渐分化成内侧的脉络膜始华中科技大学硕士学位论文 9基及外侧的巩膜始基。此时 眼的各部组织已具雏型 即形成胚眼。 1.3.4 眼各组织的发育来源 1 表皮外胚叶 晶状体、角膜上皮、结膜上皮、泪腺、眼睑皮肤及其衍生物 睫毛、睑板腺、Moll腺和Zeis腺 、泪器上皮、玻璃体。 2 神经外胚叶 视网膜、视神经 包括神经细胞、神经胶质细胞和软脑膜 、虹膜色素上皮、瞳孔括约肌和开大肌、睫状体上皮、玻璃体。 3 神经嵴细胞 角膜基质及内皮、小梁网、睫状肌、葡萄膜基质、巩膜、眶骨、Muller肌、结缔组织、黑色素细胞、神经。 4 中胚叶 血管 出生前消失的血管 如玻璃体血管、晶状体血管囊 永存性血管 、眼外肌、部分巩膜、如脉络膜血管、视网膜中央动脉、睫状血管以及其他血管 原始玻璃体。 1.4 无虹膜症的分子生物学研究进展 1.4.1 眼球发育调控概述 目前已知 眼发育过程被分为三阶段 特化期 决定期和终末分化期。前两步发生在眼原基之前 而第三步在眼原基之后启动。每一期都与特定的选择性基因或蛋白的表达有关 而后者又受到细胞外信号通路的调控。特化期是细胞塑型的早期 此时的 即眼组织特定发育基因的表达。该阶段细胞分化具有细胞命运主要依赖环境因素 高度可逆性。决定期的细胞进一步塑型 该期细胞的分化为自治行为 不可逆转 对环境信息不敏感。这两期的细胞在时空上表达许多重要的发育基因或蛋白。调控细胞进入限定期和决定期蛋白质有两大类。 第一类 眼发育过程所需要的选择性蛋白或基因。此类基因符合以下4个特点 1 基因突变 功能丧失 会阻断早期眼的发育 如ey toy的突变可引起无眼球、小眼球或无虹膜等。 2 异位表达可重塑其它的原始细胞发育为视网膜组织。 3 此类基因的表达谱可以显示眼发生的部位或范围 4 编码的蛋白为核蛋白 大多为结合DNA的转录因子。迄今为止 至少已发现10个眼选择性基因或蛋白 包括ey 华中科技大学硕士学位论文 10toy eya so dac eyg tsh optix hth and exd 大部分为同源盒基因PAX6家族成员。它们可以单独或联合、协同或拮抗性地指导眼的早期发育、分化。尤其是在正常眼的发育过程中 这些基因通过多重信息反馈、交叉调控等相互作用 出现时空特异性的基因表达谱 从而逐步调控多潜能的上皮细胞向眼组织定向分化、成熟及命运决定。 第二类 细胞外信号分子 或信号通路 。他们与上述选择性复合体蛋白共同作用 促进限定期状态的细胞逐步向决定期、分化期的细胞过渡、成熟。比如果蝇眼发育、细胞分化、命运决定中 至少涉及5条不同的细胞外信号通路 包括hh dpp wg notch egfr等。其中hh dpp通路启动MF及光感受器的分化 介导了Zone I细胞向Zone II Zone III细胞的转化。 1.4.2 PAX6基因与眼球发育密切相关 许多研究表明 PAX6虽然在眼外也有表达 脑 嗅器官 垂体 但它对眼发育的调控有极其重要的作用。PAX6是进化保守基因Pax家族的一员 Pax基因参与调控组织的特化发育、细胞的增殖分化、调控哺乳动物细胞的移行和凋亡、成体组织特性的维持、角膜缘干细胞的形成和眼组织损伤的修复等6。目前认为PAX6对眼组织发育的特化作用与它和组织特化调控因子 c-Maf AP-2 Sox2等 广泛表达因 子转录因子的表达 c-Maf MafA/L-Maf Six3 pRb and TFIID 相互作用 以及它可以调控一些转录因子的表达有关7-10。 1.4.2.1 PAX6基因的结构特点和生化特点 人的PAX6基因位于11号染色体p13 鼠的位于2号染色体p1311。Pax基因家族的共同特点是含有配对盒基元序列。PAX6配对盒基元保守序列为387bp 编码128-129个氨基酸的特殊DNA结合区 称为paired domain PD 。PAX6编码产物属于DNA结合蛋白家族 其结构中除了含有配对盒结构域外 还包含另一DNA结合区 即同源结构域 homeodomain HD 二者在功能上均属于高度保守的转录因子 选择性剪切Pax基因的表达。此外 其羧基端为一富含脯氨酸、丝氨酸及苏氨酸的结构华中科技大学硕士学位论文 11域 proline-serine-threonine rich domain PST domain 说明PAX6基因同时具有潜在DNA激活功能12。 了解PAX6的结构有利于我们阐明各种错义和无意义突变的分子机制。配对结构域 PD 从结构和功能上可以分为两部分 PAI和RED。哺乳动物PAX6基因编码的产物主要有两种 PAX6 p46 和PA.
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