生化实验报告-胰蛋白酶活力测定生化实验报告-胰蛋白酶活力测定
实验 胰蛋白酶活力测定
一、原理
福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼蓝)。
蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
试管
7220分光光度计
恒温水浴锅
三、实验试剂
1. 福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 2. ...
生化#实验
#-胰蛋白酶活力测定
实验 胰蛋白酶活力测定
一、原理
福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼蓝)。
蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
试管
7220分光光度计
恒温水浴锅
三、实验试剂
1. 福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 2. 0.55mol/L碳酸钠溶液:58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水,稀释并定容至1000ml 3. 10%三氯乙酸溶液
4. 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5):
5. 0.5% 酪素溶液:称取0.5g酪素,以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润,再加少量0. 2mol/L
磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解,冷却,稀释并容至100ml,冷藏在(冰箱)里。 6. 500ug/L酪氨酸溶液
7. 胰蛋白酶溶液
四、实验步骤
,
曲线的制作:按下表加入试剂:
管号 1 2 3 4 5 6
500ug/L酪氨酸溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
, 各管中加0.5%酪素2ml,于37?水浴中反应15分钟,然后加入10%三氯乙酸3ml,
过滤除去沉淀,取清液1ml,加入0.55mol/L碳酸钠5ml,再加入福林试剂1ml,于
37 ?水浴中显色15分钟,测OD680。
, 以光密度为纵坐标,酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定:取干燥的试管2支,按下表加入试剂
管号 备注 1 2
0.5%酪素溶液 37水浴中酶解15分钟 2.0 2.0
0. 2mol/L磷酸缓冲液 1.0 0
2mg/ml胰酶溶液 0 1.0
10%三氯乙酸溶液 过滤 3.0 3.0
上清液 37水浴中显色15分钟 1 1
0.55mol/L碳酸钠溶液 5.0 5.0
福林试剂B 1 1
OD680 0 0
管号 1 2 3 4 5 6 7(样品) 酪氨酸微0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ----------- 克数
OD680 0 0.156 0.252 0.373 0.499 0.584 0.873 OD680 0 0.158 0.253 0.374 0.501 0.585 0.875 OD680 0 0.159 0.255 0.375 0.503 0.586 0.877 OD680(平0 0.158 0.253 0.374 0.501 0.585 0.875 均)
五、结果计算
由上表可作出标准曲线如下:
y = 1.1645x + 0.0207
2 = 0.9941R
0.7
0.6
0.5
0.4
吸光度0.3
0.2
0.1
0
00.10.20.30.40.50.6酪氨酸(ug)由上可知,样品的吸光度y=0.875,则x=0.7336μg,即A=0.7336μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ?F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
胰蛋白酶活力为:0.7336 /15 ?13=0.6358
六、实验
1. 测定胰蛋白酶活力的原理?
答:蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
2. 胰蛋白酶的最适PH值多少? PH值对胰蛋白酶稳定性有何影响? 答:胰蛋白酶的最适PH值为8.1。胰蛋白酶的活性在一定的PH值范围内随着PH值的升高而升高,超过最适的PH值时酶活性降低。
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