由甲壳素制备N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的研究

由甲壳素制备N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的研究 由甲壳素制备N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的研 究 第23卷第5期 2005年10月 河南 HENAN 科学 SCIENCE Vo1.23No.5 Oct.2005 文章编号:1004—3918(2005)05—0663—04 由甲壳素制备N.乙酰葡萄糖胺二聚糖的研究 吴平格,高辉2,王宏雁,黄雪,张鹏举 (1.河南工业大学化学化工学院,河南郑州450052;2.洛阳大学环境与化学工程学院,河南洛阳471000) 摘要:虾壳经酸碱两次交替处理制得甲壳素.制得的甲壳素用浓盐酸部分水解得到N一乙酰葡萄糖胺低聚糖混 合物,柱层析分离制备N一乙酰葡萄糖胺二聚(NAG).试验考查了水解温度,水解时间,盐酸浓度对水解 反应的影响以及脱洗液浓度与二聚糖纯度的关系.甲壳素水解制备N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的适宜反应 条件为水解温度50?,水解时间5,5h,盐酸浓度6.0mol/L.分离N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的最佳脱洗液 浓度为5%乙醇溶液,此条件下N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的得率最高可达24.06%. 关键词:虾壳;甲壳素;N一乙酰葡萄糖胺二聚糖 中图分类号:Q539,7文献标识码:A 甲壳素低聚糖的生理功能研究取得了较大的进展,相继报道它具有抑止肿瘤细胞, 降低胆固醇,抑止血 压上升,改善肝功能,降低血糖,消炎抗菌等生理功能【.更重要的是它属于天然低聚物,分子量小,易溶于 水,易被人体吸收,对人体无毒副作用,可以开发成医疗,保健类药物[.而N一乙酰葡萄糖胺二聚糖是最小 分子量的甲壳低聚糖,作为药物使用时有更好的水溶性,渗透性,以N一乙酰葡萄糖胺二聚糖为基质,合成二 聚糖衍生物的研究受到重视.目前还没有N一乙酰葡萄糖胺二聚糖合成途径的报道,利用降解分离提纯是制 备N一乙酰葡萄糖胺二聚糖重要之一.它对单一结构二聚糖的制备有一定的参考价值. 1实验部分 1.1主要仪器与原料 电子分析天平,梅特勒一托利多仪器有限公司;ZK高速自控组织捣碎机,江苏省盐城市科学仪器厂; 上海司乐仪器厂;活性炭层析柱,自制;其它为实验室常8l一2型恒温磁力搅拌器, 用仪器.原料采用龙虾壳, 市售.氢氧化钠,盐酸,无水乙醇等试剂均为分析纯.氨基葡萄糖品,上海试N--厂进口分装. 1.2实验方法 1.2.1甲壳素的制备与分析 1.2.1.1甲壳素的制备 龙虾壳一破碎冲洗一碱处理(1)一水洗至中性一酸处理(1)一水洗至中性一碱处理(2)一水洗至中性一 酸处理(2)一水洗至中性一干燥一白色片状甲壳素. 1.2.1.2甲壳素的分析 采用标准样品IR谱图和自制样品IR谱图对照【,如图1,图2所示. 波数/c皿 圈1甲壳素标准样品IR谱图 Fig.1ThestardardIRspectrogramofchitin 收稿日期:2005—04—29 作者简介:吴乎格(1956一),女,江苏南京人,河南工业大学实验师. ---—— 664'__——河南科学第23卷第5期 76.O 74.O 7O.O 66?O 62.0 58.O 54.O 5O.O 波数/om 图2甲壳素自制样品IR谱图 Fig.2ThespampleIRspectrcograrnofchitin 1.2.2N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的制备与分析 1.2.2.1甲壳素的水解 对甲壳素进行部分水解,水解过程如下:称取壳索5.0g,于250ml【l1烧帆.lI'加入150ml冷的浓 盐酸,于冰水浴下搅拌3h,于水解温度下搅拌符r小时.冷却,i冰水浴巾用50'%NaOH洲pH至rf1性,过 滤,得到多种低聚糖混合滤液. 甲壳水解制备NAG的影响闪素主要_彳]'水解度,eg~N,J'问和水解时酸的浓度,实验在I古J定两个影响因 素的前提下,通过改变一个反应条件,考察其对水解反J的影响,找到适F1=的制钎NAG的条件.结果见 图3一图5. 图3水解温度对得率的影响 Fig.3Theeffectsofhydrolysistemperalure onyieldofNAG 图4水解时间对得率影响 Fig4Fheeffects()fhydrolysistirnc O13yieldofNA( 图5盐酸浓度对得率的影响 Fig.5FheeffectsofconeenlrationofHCI onyieldofNAG 1.2.2.2N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的分离 N一乙酰葡萄糖胺二聚糖分离方法女I1下:将f述滤液以130ml/h的流速}.舌Pt炭层析柱(35×47cm), 流出液再重复吸附1次,蒸馏水250ml洗脱去杂,依次j}】不f?3浓度的乙醇溶液进行洗脱,收集洗脱液.j十J 硫酸蒽酮法跟踪至尤糠份流出为止,减压蒸馏浓缩,冰冻I燥,称可t儿". 为了考察不同浓度的乙醇溶液对N一乙酰匍恂柑胺二聚糖分离效果,分别川2.0',30%,40'%,50%, 结果见1. 60%,7.0%,8.0t%和30%的乙醇洗脱, 表l不同浓度乙醇溶液的分离结果 Fable1TheseparateresuhsofdifferentCOllcentrationofethanol)Il】ln 3.0% 4.0% 5.O'{6 6.0t‰ 7.0% 8.O'埔 nn' (128 (1.28 【116 (1l7 0l7 (1.(18 0.17 0(18 I1I18 彩个 乙眦{llij绚)9}f帔聚 州介物 乙眦彻钧桃肢,聚桃 乙眦简绚J『J坟聚 rj聚时介物 乙呲铀绚钋帔聚J} 聚合度芝3的物质 2.23蜗 ll2% l751% 5.4(1'% (127% I1(13'% I181% 2l4% 50l1 【j】先索删备N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的研究 1.2.2.3N一乙酰葡绚糖胺二聚糖的分析 …活性炭柱析所得组份减压浓缩至5毫升,在冰箱巾放置一周出现棒状结晶.将所 得产品配成 lmg/ml的溶液.川纸析法对炭杜析分离fII的产物进-t分析.展开剂:正丁醇:乙醇: 水:氨水=40:10: 49:l(}为腰剂).色剂:0.93g苯胺和1.66g邻苯二甲酸溶于100毫升水饱和的正丁醇 中.用行 纸析法进行,标准一I1I的R『值比较可以鉴定机.合并Rf值相同的组份,干燥后准确称量,计算各组份 质超r1'分含}}{=. 2结果与讨论 2.1甲壳素的分析 将制样rI?R谱图和标准样品IR谱图进行对照,二者极为相似,在3450CII1处有强而宽的吸收峰, 表示有缔合OH伸缩振动,3200CII1附近处有弱的N—H伸缩振动,在1660crn有较强的吸收峰,为 C一()的伸缩振动,1315crn和1379CII1处的吸收峰分别为CH3和CH2的弯曲振动,在 900,llO0crn处有一系列较强吸收峰,为C一()__C的伸缩振动.故可确定提取的产品是甲壳素. 2.2水解温度对N一乙酰葡萄糖胺二聚糖得率的影响 2.2.1水解温度对N一乙酰葡萄糖胺二聚糖得率的影响 改变水解fal定水解时问为3.5h,酸的浓度为6.0mol/L,峻加入最为壳素重量的8倍,温度,考查水 解IfJ壳素时N一乙酰筒萄糖胺二聚糖的得率,试验结果见3.由图3町以看…,水解温度为50?时,N一乙 酰葡萄糖胺二聚糖的得率最高,为24.35t泊.提高水解温度,N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的得率快速下降,所以, 适的反温度为5()?. 2.2.2水解时J1_1J对N一乙酰葡萄糖胺二聚桃得率的影响 同定水解温度为50?,酸的浓度为6.0mol,酸加入量为咩I壳素重量的8倍,考查水解甲壳素时,水解时 问刈N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的得牢影响,试验结果见图2.从图2可以看}fJ,适宜的水解时间为4.5h,N一乙酰 葡萄糖胺二聚糖的得率最高,为25.50t%.反应u问延长,得率下降. 2.2.3盐睃浓度对N一乙酰葡萄糖胺二聚糖得的影响 定反应温度为50?,水解时J11J为4.5h,酸加入量为LfJ壳索重量的8倍,考查水解甲壳素时,酸的浓度 对一乙暇先葡萄糖胺二聚糖的得率影响,试验结果见图3.从图3可以看出,适宜的酸的浓度为5.5mol/L, 一 乙酰葡萄糖胺一聚糖的得率为22.4%.从图3还可看出,提高酸的浓度,N一乙酰葡萄糖胺二聚糖的得率 亦捉f矗if{少. 2.2.4【交实验结果 反应濉度,反J,;LII?和酸的浓度足影响N一乙酰葡萄糖胺二聚糖得率的主要因素,各因素对得率的影响 小址简rrL的线火系,II.素存在/f同程度的交7作用.试验在单一影响因素的基础上,按j冈素四水平 设计rf卜交试验,对反膻条件进行了优化,其结果为:适宜的反应温度50?,反应时间5.5h,酸的浓度为 6.0mol/L,此时N一乙酰匍萄糖胺二聚糖的得率为24.06%. 2.3N.乙酰葡萄糖胺二聚糖的分离 从农l纸忻展陷术看,馏份1和馏份2R『值与标准N一乙酰葡萄糖胺的Rf相同,可知馏份1和馏 份2足N一乙献葡萄糖胺.馏份3为个斑点,从Rf值分析为乙酰葡萄糖胺与二聚糖混合物,此混合物用 3.0t%乙醇洗脱町将乙酰葡萄糖胺-j<聚糖分离,H.单糖占多数.馏份4为乙酰葡萄糖胺二聚糖.馏份5和 馏份6为两个斑点,从Rf值分析为乙酰葡萄糖胺二聚糖lLjj聚糖的混合物,此混合物用5.0%乙醇洗脱可 将乙酰葡萄糖胺二聚糖与?聚糖分离,f1.在馏份5中二聚糖占多数,馏份6中二聚糖含量很少.馏份7为乙 眦葡萄糖胺二聚糖,说明8.0%以【:的乙醇溶液已不含二聚糖.从表1分离结果可 以看出,从4.0%,7.0% 的乙醇脱洗液【{l含有N一乙酰葡萄精胺二聚糖,以5.0%乙醇溶液分离效果最佳,适当加大脱洗量可分离完 令,合并二聚糖得牢为24.06%. 3结论 以虾壳为原料,用胲碱两次交替处法提取叶1壳素,再用盐酸对甲壳素进行部分水解,最适反应条件为 ?--—— 666?--——河南科学第23卷第5期 水解温度50?;水解时间5.5h;盐酸浓度6.0mol/L.水解后得到的N一乙酰葡萄糖胺低聚物混合液,经由 炭柱层析分离,用5.0%乙醇溶液分离得到N一乙酰葡萄糖胺二聚糖,得率为24.06%. 参考文献: [1]魏新林,夏文水.甲壳低聚糖的生理活性研究进展[J].中国药理学通报,2003,19(6):614—617. [2]魏新林,夏文水.甲壳低聚糖的理化性质研究[J].日用化学工业,2004,34(3):164—166. [3]杨建红,杜予民,覃彩芹.红外光谱与核磁共振波谱在甲壳素结构研究中的应用[J].分析科学,2003 [4]刘晓,石瑛,白雪芳,等.甲壳低聚糖的酸水解[J].中国水产科学,2003,10(1):69—72. [5]sABarker,ABFGster,MSt,amy,JMWebber.Amino-sugarsRdatedG】f11pOImds[J].J.Chem.Soc,1958,(6 [6]李利军,孑L红星,陆丹梅.硫酸一蒽酮法快速测定蔗糖的研究及应用[J].食品工业科技,2003,24,(10):1 [7]IngleTR,VaidyaSH,PaiMU.ProductionofD-GlucosamineHydrochloridefromFishca nningwaste Industry,1993,(18):54—56. ,(3):282—287. ):2218—2227. 45—149. [J].Rrsearchon ThepreparationofdimericN-acet-glucosaminebyhydrolytic degradaionusinghydrochloricacidfromchitin WUPing—ge,GAOHui,WANGHong—yan,HUANGXue,ZHANGPeng—ju (1.FacultyofChemistwandChemicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450052,China; 2.LuoYangUniversityEnvironmentalandChemicalEnineering,Luoyang471000,China) Abstract:Chitinwasobtainedbyalternatelydealingshrimp— shellswithacidandalkali.Bypartialhydrolysisof chitininconcentratedhydrochloricacidtogetthemixtureofchitodigosacharides.theoutcomeswere chromatographedoncharcoalcolumnforpurification,thendimericN—acet— glucosaminewasobtained.The experimentinvestigatedinfectionsoftemperatureandtimeaswellastheconcentrationofexperiments hydrochlorictothepartialhydrolysisofchitin.Theresultsofexperimentssuggestthatthebestconditionsof chitin'Shydrolysiswere50?/5.5h/6.0mol?L一 hydrochloricacid.Thebestconcentrationofwashing,solution toseparateN—acet— glucosaminewas5%ethanalsolution.Ontheseconditions.thedimericN—acet— glucosamine wasaccessibleinthehighestyield24.06%. Keywords:shrimp—shells;chitin;dimericN—acet—glucosamine