家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞增殖

家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞增殖 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血 管平滑肌细胞增殖 _i?' cN43—1262/R中国动脉硬化杂志2OOO年第8卷第1期17 [文章编号]1007—3949(2OOO)一O1—0017—04?实验研究? 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞增殖 季 徐仓宝,张亚萍,王亚文 (西安医科大辛;;硬医.陕西省西安市710061)弓年 R. [主题词】肌,平滑,血管;每件培养基;增殖;自分泌;旁分泌;生长抑制因子;萄脉粥样硬化 [摘要]为探讨血管平滑矶细胞自分泌和旁分泌对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用,采用家兔主萄脉贴块培养 击培养血管平滑肌细胞,井制备平滑肌细胞蒂件培养基.采用孔径100kI)a和10kDa的Millipore滤膜,将平滑肌细 胞奈件培养基分部.平滑肌细胞增殖测定采用宝曼曼试剂盒XIT击.蛄果提示.豪克血管平滑肌细胞奈件培养基 抑制血管平滑肌细胞的增殖,浓度50%的平滑肌细胞务件培养基抑制血管平滑肌细胞的增殖率高达45%,且该生 长抑制活性物质具有剂量依赖,加绱56.c30rain稳定和分子质量小于10kDa的特点. [中图分类号】11364.3[文献标识码]A nleConditionedMedimnfromRabbitAortleSmoothMuscleCellsInhibitedProliferation ofVasettlarenlarSSaloofllMuscleCeU xUcaI】g—BaotZI-IANG"Ca—Ping.andWANG"Ca—Wen (}-',^dm铂l?Med/calI',,.哪710061,a) MeSHlVl~elelSmooth.Vascular;Cod蜘edNedium;Prolifemfion;Aut~rlne;Paracline;GIaw山lnhibltor; Ad瞄clers 加sIRAcrATo删e町w~eular蛐o0musclecell8iNtv汕oe】l~llferntion a~fine口a工acrofgrowthi?}bi啪.【esC~ditienedmedium5ramrabbitcHnmu~lecellwas1l8edin thisstudy.eondifi~edmediumwas~lteredbycutoffM.w100kDaor10kDa(叫).Io0【I.mmelecellprolif- .?w珊a哪edbytl-emeosul~nentofm(B.el1血Molln]lein)ReP,~Ntaortic驯00【I.mu~lece?c一 d~nedmediuminl刚轴l00【I.mI】cellpmllfemfion.50%sn~othmI】celle~lidonedmedium~hieved4-5%l ofmuscleoeuon.‰6on蛐姆.56?,30rain~tableM wless岫10kDa.I商0啦P~bitcsmoothmusclecelle~uldinhibit?舶m~elecellp枷?bya eori:~raerlneibit? 动脉平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化发生和发 展中起重要作用J.当动脉局部受损或在生长因子 刺激下,动脉平滑肌细胞从中层移行到内膜下,并在 内膜下增殖,参与损伤的修复过程.大量研究资料 表明,动脉平滑肌细胞能够分泌血小板源生长因子 (pl~telet—derived舯wthfactor,PDGF),纤维母细胞 生长因子(fibrobl~tgro~hfactor,f?F)以及转化生长 因子一l?(t~nsforminggrowthfactor一口,TGF—p)等,并 [基金项目]国家自然科学基金资助课题{项目编号39570318) [作者筒介】徐仓宝,男,1957年3月出生,研究员.博士研究生导 师,西安医科大学首批跨世纪学术带头人,西安医科大学动脉粥样硬 化研究室暨分子生物学技术中心主任,卫生部微量元素与地方 病重点实验室学术委员会主任,j嚷西省生理科学会副理事长.从事 血管细胞生物学及动脉粥样硬化发病机制的研究工作,发表有关研 究论文5o多篇.曾获国家,省(部)敏科学基盘资助课题】0余项. 指导研究生10多名.荣获兰州军区科学技术进步兰等奖. 通过自分泌或旁分泌的方式调节平滑肌细胞自身的 增殖.但是,动脉平滑肌细胞分泌生长抑制因子, 参与平滑肌细胞增殖调控的研究报道甚少.我们既 往的研究证明,动脉内皮细胞分泌生长刺激活性物 质和生长抑制活性物质,二者的平衡调节平滑肌细 胞的增殖.J.本研究采用家兔主动脉平滑肌细胞 条件培养基,观察其对动脉平滑肌细胞增殖的影响 作用,旨在探讨动脉平滑肌细胞通过自分泌或旁分 泌或旁分泌生长抑制活性物质调节平滑肌细胞增殖 的作用. l材料与方法 1.1家兔主动脉平滑肌细胞的培养和鉴定 家兔l2周左右,耳缘静脉注气处死,取主曲脉 纵向剖开,去腺动脉外膜和内皮,然后将勘脉中层平 18ISSN1007.3949ChinJArterioscler.v0l8,Nol 滑肌切成表面积为1×1r岫2的小块,种植在底表面 积为12.5的玻璃培养瓶中,用音15%新生小牛 血清(newbornbovineseillln,NBS)的DIvIEM/F12 (Sigma)1:1培养基,在37?,5%C02条件下进行 培养,0.25%胰酶消化传代,5,10代平滑肌细胞用 于实验.平滑肌细胞台盼蓝染色,活细胞数在 98%以上.平滑肌细胞的鉴定采用—actin免疫组 织学织化学染色阳性,以及形态学典型的"峰和谷" 样生长状态判定. 1.2条件培养基的制备 传代后的平滑肌细胞在底面积为25—玻璃 培养瓶中生长融合后,再继续培养3天,用PBS(pH 7.4)洗3次,换成无血清培养基5mL,48h后收集 条件培养基,离心10min,去除细胞碎片,一2O?保 存.实验时分别在24h,48h及72h收集条件培养 基. 1.3条件培养基的过摅分离 采用Iillipore滤膜,孔径100kDa或10kDa,将 平滑肌细胞条件培养基粗分为分子质量小于100 kDa或小于10kDa两部分. 1.4平滑肌细胞增殖测定 采用)法(BoehfingerMannhein).筒而言 之,培养细胞在24孔板中,PBS洗三次,加入rr检 测液(XTr]PBS1:2)0.5mL,在37?,5%C02条件 下培养12h,收集XTr检测液,紫外分光光度计 (PE,Lamda5)492am处读数. 1.5实验步骤 平滑肌细胞按每孔6000个细胞种植在24孔培 养板(NUNC)中,用15%NBS的DNEIVI/F12培养基, 在37%,5%C02条件下培养24h,用PBS洗三次,换 成0.25mL无血清培养基加0.25mL无血清条件培 养基.对照组为0.5mL无血清培养基.然后在 37?,5%C02条件下培养48h,进行xTr检测条 件培养基币同作用时间试验分别在24h,48h和72 h进行XTT检测.平滑肌细胞增殖抑制率按以下公 式计算: 增殖抑制率(%)=[1一实验组XTrOD()值/ 对照组XTTOD值()]×100% 1.6条件培养基热稳定实验 将条件培养基加热至56?30min,特垮却后, 按l:l比例与无血清培养基进行混台,然后用于实 验. 1.7统计学处理 所有数据均以均嫩?标准差(?)表示.统 计学采用检验,以P<0.05表示差异有显着性. 2结果 2.1家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基对平 滑肌细胞的增殖抑制作用 无血清平滑肌细胞条件培养基与无血清培养基 按1:3,1:1和3:1混合,得到25%,50%和75%的 平滑肌细胞条件培养基.把不同浓度的条件培养基 加入24孔板平滑肌细胞培养中,每孔1mL,培养48 h,用XTT法测定细胞增殖,计算平滑肌细胞增殖抑 制百分率,结果如表l(Table1)所示. 表1.不同浓度家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基对平滑 肌细胞增殖的抑制作用 e1.Eli'eelsofdifferentdoesofcond~tionedmed~tmfr帅 abbitRI]~dCsmoothnlL~ecellsooinhlTbiliollof目nO0thmuscle eellp10Ii舶 CM=0?邮.d珊d_n瑚.sF=SennafreewMiumb:P<005,c:P <001,d:P<0.001-o?叩亡d山e~ntro]group 由表l(Table1)可以看出,与无血清培养基相 比,无血清平滑肌细胞条件培养基对平滑肌细胞增 殖有显着抑制作用,且随着浓度增大,抑制作用增强 (r=一0.9960,P<O.001). 2.2家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基不同收集 时间对平滑肌细胞增殖抑制作用的影响 融合三天后的平滑肌细胞,用PBS洗3次,换成 无血清培养基,分别在换液后24h,48h和72h收集 条件培养基,与无血清培养基按1:1混合后,加入24 孔板平滑肌细胞培养中,每孔1mL,培养48h,用 XTr法测定细胞增殖,计算平滑肌细胞增殖抑制百 分率.结果如表2(Table2)所示.可见,平滑肌细 胞条件培养基不同收集时间对条件培养基抑制平滑 肌增殖作用有一定的影响,随着收集时间的延长,生 长抑制活性有增强的趋势. 23条件培养基热稳定实验 将条件培养基加热至56?30rain,冷却后,与 无血清培养基按1:1混合,加入24孔板平滑肌细胞 培养中,每孔1mL,培养48h,测XTr值.计算平滑 肌细胞增殖抑制百分率.实验结果如图1(Figure J)所示. 由图l(Figure1)可看出,加热前后,家兔主 寸 cN43—1262/R中国动脉硬化杂志2003年第8卷第1期19 动脉平滑肌细胞条件培养基抑制平滑肌细胞增殖的>0.05). 活性无显着变化(P>O.05). 表2家免主动脉平滑肌细胞条件培养基不同收集时间对 平滑肌细胞增殖抑制作用的影响 Table1.Effects0fdiffelmat.0Ilec理time0fetmfllllaledlm. dlumfromI-sbl~taortlemloothtmlsdecells帕jIIhiMn0f mloothn?lsclecellL~-ollferatiml CMconditioned?1蚰.SF=Serumfreemedi~c:P<0.01…. withcontrolgoup 周1家免主动脉平滑肌细胞条件培养基生长抑制活性的 热稳定实验 ngui~1.Effect0fheatmgrowthj曲i蜥唱aettvity0feondi- 啦饵坤dmediumfromrabbitElorlicmlooth皿塔decells SFserumfree耐hem=n0heatemdJti~edmedi~.hmu~d =he~edconditionedmedi~B:P>O05,c0mpdwithnOheatmndi— timmedi~ 2.4条件培养基分部试验 采用孔径100kDa或10kDaMillipore滤膜,将 条件培养基粗分为分子质量小于10kDa和小于100 kDa两个部分,然后把它们分别与无血清培养基按1 :1混合,加入24孔板平滑肌细胞培养中,每孔1 mL,培养48h,测XTY值,计算平滑肌细胞增殖抑制 百分率.结果如图2(Figure2)所示.可见,与家兔 主动脉平滑肌细胞条件培养基相比,分子质量小于 100kDa部分和分子质量小于10kDa部分,三者之 间对平滑肌细胞增殖抑制作用没有显着性差异(P 图2.不同分部的家免主动脉平滑肌细胞条件培养基对平 滑肌细胞增殖的抑制作用 ragare2E嘲0fdifferentfractions0fconditionedmedium fromr曲bjt酬cmlooth皿ecells611mlooth皿塔decell prolfferafioll SFmfreemedlmll,CN=mndltionIllO~lltll,<10kDa=MW1嚣 than10kDaconditionedmedium,<100kDa=M.Wlgthm100kDa conditi~耐i2tltllbgfl"~-ells 3讨论 本文对家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基影响 平滑肌细胞增殖的作用进行了实验观察,结果提示: 平滑肌细胞条件培养基可以抑制平滑肌细胞增殖, 且该生长抑制活性物质具有剂量依赖,热稳定,分子 质量小于10kDa的特点.这与我们以前报道的牛 主动脉内皮细胞条件培养基中的小分子生长抑制活 性物质相类似.血管细胞条件培养基中存在着 许多刺激平滑肌细胞增殖的因子,如:PDGF,FGF 等,同时也存在着抑制平滑肌增殖的因子,如:TGF — p,肝素样物质.但TGF—B和肝素样物质分子质 量比10kDa大.平滑肌细胞分泌的一氧化氮(nic oxide,NO)和前列环素(pmsta一din,PGI2),它们 虽分子质量小,且具有抑制平滑肌细胞增殖的作用, 但因其半衰期仅数秒钟到数分钟,不可能通过条件 培养基发挥其抑制细胞增殖的活性】.本研究结果 提示家兔平滑肌细胞条件培养基中存在一种小分子 生长抑制物质,但其性质有待于进一步试验澄清. 从理论上讲,条件培养基对细胞增殖起负调节还是 正调节作用,是由条件培养基中生长刺激活性物质 和生长抑制活性物质之间的平衡决定.若生长刺激 ??"????们0 ISSN1007—3949ChinJ.4aterioscler,Vol8,No1 活性物质占优势,则刺激细胞增殖,若生长抑制活性 物质占优势,则抑制细胞增殖.在本实验条件下,家 兔主动脉平滑肌条件培养基中生长抑制活性可能占 优势.因此,条件培养基中的多种生长因子可能不 能够发挥生长刺激作用,这与oaiage等和oodge 等_7人的研究结果有相同之处,同时,也与生理 状态下体内血管平滑肌细胞处于静止和非增殖状态 相符合.由此推测,在各种动脉粥样硬化的"危险因 子"作用下,血管壁局部生长刺激活性和生长抑制活 性之问的平衡紊乱,使得生长刺激活性占优势,引起 平滑肌细胞大量增殖从而参与动脉粥样硬化病灶 的形成和发展. 参考文献 [1]RR.91)年代动脉粥样硬化发病机制的研究进展和方向 [J].中国动脉硬化亲志,1993,1(1):79—84 [2』sc】出sM,B日D.0蹦肌Eli1k山mSoilhathem一 ~clerceis?日瑚[J].c融1995不(3):445—65 [3]xucB,pe~hlttts【日瑚L.I?姗b喊nI.db0一 vi肿~a'teliale?d.lIlmd即彻lecells:FaUcets0f曲皿 thetele.a~)w哪山衄d)wirflliNting邸bgt日I1船lJJ. 删?&To~'ol,1991,:195—200 [4]衄,FeP,?s【删州L.1口t蛳咖etl椰Ih?耐bo- vinem日n神nlu~]ecdlB棚d0由di:Shl出鸭伽出e rde&唧山6t】g蚰d目hnII1rIsh啪[JJ^ ? 读者?作者?编者? 丁翠芬 尹卫东 吴学思 王善圣 沃兴德 李进 宋剑南 张祖辉 周新 洪嘉玲 潘敬运 韩琴琴 周少琴 黎健 粟秀初 徐仓宝 t~j'r.1990,l7:297—310 [5]XUcB,乳vL,Pe.~en—R曲舢B啪It.I口ra咖be- tw一h1r.dbea目'如山j-r口ecells; 】d?therd咖e0fP,-,ndmbye|ldo出djeell~[J1.^ 押r,1992,19:94—111 [6]s山Y,ub0id.0瑚丑c把zBli帆0f吐丑cd?d皿IB蛔ltTGr — Pby呻一邙忡0ferIdo出djcellsqol-唧?叫I tells:Bserf一mg咖[J1.』伽删1990,lll:757— 763. 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