戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制备

戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制备 第27卷第2期青岛科技大学Vo1.27No.2 2006年4月JournalofQingdaoUniversityofScienceandTechnologyApr.2006 文章编号:1672—6987(2006)02—0123—04 戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制备 梁足培.桑明心..李建..曹长青.王广建 (1.青岛科技大学化工学院,山东青岛266042;2.青岛国风东瑞制药有限公司,山东 青岛266034 3.青岛华仁药业有限公司,山东青岛266101) 摘要:在微波辐射下以戊二醛为交联剂,将壳聚糖球交联引入醛基,然后将交联的 壳聚 糖球浸泡在脲酶溶液中24h,制备了壳聚糖球固定化脲酶,其酶比活为1O.83U?g-1栽 体.最优固定化条件是戊二醛的体积分数(GA)1,脲酶与湿壳聚糖球的质量比 m(E):m(CB)为0.01,固定化时间为24h,固定化所用溶液的pH值为6.5.研究表明, 固定化脲酶具有良好的重复使用性和贮存稳定性.戊二醛交联壳聚糖球可作为酶 固定化 的优良载体. 关键词:脲酶;固定化;戊二醛;交联;壳聚糖球 中图分类号:TQ925.9文献标识码:A PreparationofUreaseImmobilizedontoGlutaraldehyde Cross-linkedChitosanBcads LIANGZu-pei,SANGMing-xin.,LIJian.,CAOChang-qing,WANGGuang-jian (1,CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingd ao266042,China;2,QingdaoDongrui PhamaeeuticalLimitedCompany,Qingdao266034,China;3,QingdaoHuarenPhamaeeuti calLimitedCompany,Qingdao266101,China) Abstract:Ureasewasimmobilizedontothecrosslinkedchitosanbeadscontainingaldehyde groupsthatwerepreparedinthepresenceofglutaraldehydeundermicrowaveirradiation.The specificactivityoftheimmobilizedureasewas10.83U?g_.carrier.Theoptimumconditions ofimmobilizationwereglutaraldehydevolumefraction9(GA)1~/6,urease/beadsweightratio 0.01,processingtime. 24handpHofthereactionmedium6.5.Theimmobilizedureasewasof goodreusabilityandstoragestability.Itwasindicatedthatthecross-linkedchitosanbeadswas anadmirabalecarrierforimmobilizingenzyme. Keywords:urease;immobilization;glutaraldehyde;crosslinked;chitosanbead 壳聚糖属多糖类物质,是一种生物相容性好, 易生物降解,无毒,廉价易得的天然高分子生物材 料,可加工成粉,膜,多孔微球,凝胶,纳米粒子等 形态.壳聚糖易于进行化学改性,引入新的功能 团,尤其是壳聚糖分子中含有游离的氨基,通过化 学交联剂(如戊二醛)很容易与酶发生间接共价结 合,使酶牢固地固定在壳聚糖分子上.因而壳聚 糖是一类性能优良的固定化酶载体,可以通过包 收稿日期:2005—05—18 作者简介:梁足培(1965,),男,博士,副教授 埋法,吸附法和共价结合法,达到固定化酶的目 的. 脲酶是一种催化尿素水解为氨和二氧化碳的 高度专一性酶,尿素的酶促水解速度是非酶水解 速度的1O?倍.但酶的价格昂贵,溶液中酶很不 稳定,容易变性和失活,反应后酶难以分离回收, 无法重复使用,限制了酶的应用,因此,人们常常 制成各种固定化脲酶,将其应用于人工肾[1],口服 124青岛科技大学第27卷 尿素氮吸附剂,临床诊断引,脲酶电极及尿素 废水处理等领域,显示了固定化酶的良好应用 前景. 本工作以戊二醛交联的壳聚糖球为载体,通 过共价结合法,制备了固定化酶,并测定了其酶比 活及回收率,研究了重复使用性和贮存稳定性. 式中:A为固定化脲酶的酶比活(U?g); c为盐酸标准溶液浓度(mol?L);V为滴定反 应液消耗标准盐酸溶液的体积(mL);Vo为滴定 空白液消耗标准盐酸溶液的体积(mL);1000表 示由mmol转换为/lmol(生成氨的酶量);t表示时 间(min);W为固定化脲酶试样质量(g). 1实验部分2结果与讨论 1.1 脲酶(EC3.5.5),生化试剂,英国BDH化学 公司;壳聚糖,生化试剂,青岛恒盛生化有限公司; 戊二醛,分析纯,青岛市大茂化学仪器供应站;尿 素,分析纯,青岛市化学试剂一厂. 1.2实验过程 1.2.1交联壳聚糖球的制备 0.1.g壳聚糖加入10mL体积分数为1的 醋酸溶液中,磁力搅拌1h制得壳聚糖一醋酸溶 液.将上述溶液用装有5号针头的注射器滴入到 200mL20mg?L的三聚磷酸钠溶液中固化2 h,得到粒度均匀,形状规则的白色的壳聚糖球, 然后,用去离子水洗涤至中性. 将制得的壳聚糖球和20mL体积分数为1 的戊二醛溶液置于100mL的圆底烧瓶中,放在 改造过的家用微波炉内,微波辐射功率置于中低 火,辐射时间2min.反应完毕,冷却,用去离子 水洗涤以除去未反应的戊二醛,直至洗涤液在 280nm处的吸收值小于0.01为止. 1.2.2脲酶固定化 按一定质量比,将交联壳聚糖球浸泡于5mI 脲酶溶液,在4?冰箱内固定化反应24h.然后 用去离子水洗涤3次,以除去未反应的脲酶.所 得湿态固定化脲酶贮存在冰箱内,备用. 1.2.3脲酶比活的测定 酶活力定义为在37?下,脲酶每分钟催化尿 素生成1ttmol氨所需的酶量.游离脲酶活力的 测定按NF?法进行.酶比活是指单位质量酶 制品所具有的酶活力数.固定化脲酶酶比活的测 定:取0.5g湿状固定化脲酶,置于150mL锥形 瓶中,加入2OmL0.33mol?L尿素一0.05 mol?L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0),37?水浴 保温30min后,滴加2滴甲基红一溴甲酚绿混合 指示剂,用0.1mol?L盐酸标准溶液滴定至灰 色.按下式计算酶比活(U?g): A—c(V—V)1000/fW 2.1交联壳聚糖球及其固定化酶的表征 微波辐射下,戊二醛与壳聚糖分子上的氨基 发生Schiff反应形成交联壳聚糖球并引入醛基. 交联壳聚糖球上的醛基与脲酶分子上的氨基发生 反应形成Schiff碱,从而使脲酶牢固地结合在交 联壳聚糖球上.其反应式如下: 2chitosan—NH2+OHC一(CH2)3一CHO— chitosan—N—CH(CH2)3一CH—N—chitosan (1) chitosan—NH2+0HC一(CH2)3一CH0—— chitosan—N—CH(CH2)3,CHO(2) chitosan—N—CH(CH2)3一CH0+H2N— Enzyme__+chitosan—N—CH(CH2)3一CH— N—Enzyme(3) 交联前后壳聚糖球及其固定化酶的红外谱图 见图1. v/cm 图1壳聚糖(a),戊二醛交联壳聚糖球(b)夏戊二醛 交联壳聚糖固定化脲酶(c)的红外谱图 Fig.1TheIRspectraofchitosan(a),glutaraldehyde crosslinkedchitosanbeads(b)andureaseimmobilizedonto glutaraldehydecrosslinkedchitosanbeads(c) 从图1a可以看出,1646.3cm处有酰胺I 带的吸收,1597.6cm处是N—H的变形振动 吸收(包括酰胺II带的吸收).图1b中, 1661.2cm处出现了醛基,酰胺和Schiff碱的 吸收峰,且N—H的变形振动吸收峰消失,说明 戊二醛与壳聚糖上的氨基发生了反应,并有残存 的悬挂醛基.这可能因为本实验是在微波辐射下 第2期梁足培等:戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制备125 进行的,反应速度快,当戊二醛分子的一个醛基与 壳聚糖上的氨基反应后,由于其邻近的氨基已与 其它戊二醛反应,及壳聚糖大分子的刚性和缠绕 等空间因素的存在,使戊二醛分子的另一个醛基 无法参与反应,从而产生悬挂醛基.另外,由图 1c和图1b相比较,可以看出,图1c中醛基的吸 收峰消失,1649.8cm处显现出了原来被醛基 吸收峰掩盖的酰胺和Schiff碱的弱吸收峰,也证 明交联壳聚糖存在悬挂醛基;同时表明交联壳聚 糖球上的醛基与脲酶分子上的氨基结合形成 Schiff碱,使脲酶牢固地固定在壳聚糖球上. 2.2交联壳聚糖球固定化酶的条件优选 2.2.1戊二醛体积分数对固定化酶比活的影响 壳聚糖与戊二醛反应引入醛基后与酶分子上 的游离氨基发生反应生成Schiff碱,从而将酶固 定化.当(E):m(CB)=0.01,固定化反应时 间24h,溶液pH6.5时,考察(GA)(0.5, 1.5)对固定化酶比活的影响,见图2.由图2 可以看出,(GA)对固定化酶比活影响较大,固 定化酶的酶比活最大值出现在(GA)=1处; 当(GA)小于1时,由于交联度低,壳聚糖球上 的悬挂醛基量低,所结合的酶分子数量少,因而所 得固定化酶比活小;而当(GA)大于1时,交联 壳聚糖球上的悬挂醛基量高,固定化过程反应剧 烈,悬挂醛基与酶蛋白分子上的氨基发生多点结 合,导致酶蛋白高级结构发生变化,破坏部分活性 中心,从而使酶比活降低. 0.5O0751.001.25l5O (GA)/% 图2(GA)对固足化一比活的影嗣 Fig.2Effectof妒(GA)onspecificactivityoftheimmobilizedurea~ 2.2.2固定化酶与交联壳聚糖球的质量比对固 定化酶的酶比活的影响 当(GA)一1,固定化反应时间24h,溶液 pH6.5时,考察(E):m(CB)(0.002,0.02)对 固定化酶比活及其回收率的影响,结果见图3. 开始时随着re(E):m(CB)的增加固定化酶比活 随之增加,当(E):m(CB)一0.01时固定化酶 比活接近最大值,随后其酶比活增加非常缓慢. 这是由于交联壳聚糖球上的悬挂醛基含量是一定 的,通过Schiff反应结合到壳聚糖上的酶分子的 量也是一定的,因此再增加酶的用量,固定化酶比 活不再随之增加.所以实验中采用re(E): (CB)一0.01为宜. ^ ? ? 己 蛭 {醯 删 匣 图3m(E):m(CB)对固定化一的一比活殛其回收奉的影响 Fig.3Effectofm(E).m(CB)ratioonspecific activityoftheimmobilizedurease 2.2.3固定化反应时间对固定化酶比活的影响 图4是固定化反应时间对固定化酶比活的影 响. ^ ? ? 己 !!g {醯 匣 t/h 图4固定化反应时问对固定化一比活的影响 Fig.4Effectofreactiontimeonspecificactivity oftheimmobilizedurease 由图4可以看出,随着固定化反应时间的延 长,固定化酶比活随之增大,24h达到最大值. 这说明在给定条件下24h足以完成固定化反应, 再延长时间固定化酶比活反而下降.这可能是由 于受反应介质的影响,已被固定在球上的酶分子 部分发生结构变化而失活. lO9876543 ^?v.n,烬丑髓删匿 126青岛科技大学第27卷 2.2.4pH值对固定化酶比活的影响 pH值对固定化酶比活的影响见图5.固定 化酶比活最大值出现在反应介质的pH6.5时, pH值低于或高于6.5,固定化酶比活都下降,尤 其是在碱性条件下,脲酶更容易失活. IlO ? 一lO5 100 瘿95 避90 85 阿 80 505560657075 pH 围5pH值对固定化奠比活的影响 Fig.5EffectofpHonspecificactivityoftheimmobilizedurease 2.3固定化酶的稳定性 实验考察了固定化酶的重复使用性和贮存稳定 性,结果固定化酶重复使用10次其酶比活仍保留初 始活力的40;湿态固定化酶在冰箱内4?下贮存 35d后其酶比活仍保留初始活力的469/5,说明固定 化酶具有良好的重复使用性和贮存稳定性. (上接第122页) 参考文献 [1]ShenX,ShiXF,KangBS.eta1.Syntheses,crystalstruc— turesandpropertiesofZn(II)andCd(II)complexesderived fromN一(o-nitropheny1)一N'-(methoxycarbony1)thiourea(H omt)and2.2'-bipyridine(bpy)or0一phenanthroline(phen) [J].Polyhedron,1998,17:4049—4058. r2]MaoC,SudbeckEA,VenkatachalamTK,eta1.Rationalde— signofN-[2一(2,5-dimethoxyphenylethy[)]一^厂一[2一(5一bromopyr— idy1)]一thiourea(HI-236)asapotentnon-nucleosideinhibitorof drug-resistanthumanimmunodeficiencyvirus[J].Bioorganicand MedicinalChemistryLetters,1999,9:1593—1598. [3]AntholineW,TaketaF.Bindingof2-formylpyridinemono— thiosemicarbazonatocoppertItocatandnormalhumanhe— moglobins[J].JInorgBiochem,1982,16:145—154. [4]NarayanT,AkinchanA,PiotrM,eta1.Crystalstructure andspectroscopiccharacterizationofbis(N—phenylthiourea) [J].JournalofChemicalcrystallography,2002,32:9卜97. r5]SheldrickGM.SiemensSAINTsoftwarereferencemanual, siemensanalyticalX—raysystems[M].USA:IncMadicon Wisconsin,l996. [6]SheldrickGM,SADABS.Programforempiricalabsorption correctionofareadetectordata[M].Germany:Universityof 3结论 将壳聚糖一醋酸溶液滴入三聚磷酸钠溶液中制 成的壳聚糖球,在微波辐射下,与戊二醛发生交联 反应并引入醛基,制得了含有悬挂醛基的交联壳聚 糖球.以此为载体,制备固定化脲酶的最优条件为 ?(GA)一1,(E):m(CB)一0.01,固定化时间为 24h,固定化所用溶液的pH为6.5.所得固定化 脲酶的酶比活为10.83U?g载体.固定化脲酶 的稳定性良好.结果表明交联活化壳聚糖球可以 作为酶固定化的优良载体. 参考文献 r门LeeKB,BoadiDK,NeufeldRJ.BIoodureaclearancewithmi— croencapsulatedurease[J].JTheorBiol,1995,175:295—303. [2]于九皋,刘峰,于景琳.包覆包醛氧淀粉固定化脲酶制备及对 尿素吸附[J].天津大学,2003,36(2):197—200. [3]都恒华,邵伟平,丁漪,等.用固定化脲酶测定人血清中的尿 素[J].南京大学,1990,26(3):437—441. [4]邵正中,方跃,邓家祺,等.用桑蚕丝素蛋白固定腮酶的研究 及脲酶电极的制备[J].化学,1995,53:883—888. [5]徐虹,朱建良,朱颖,等.利用固定化脲酶处理尿素[J].南京 化工大学,1998,20(1):33—35. E6]蒋传葵,金承德,吴仁龙,等.工具酶的活力测定[M].上海: 上海科学技术出版社,1982. Gottingen,1996. r7]SheldrickG^,LSHELXTL-PC,referencemanual,siemensana— lyricalX-raysystems[M].USA:IncMadisonWisconsin,1990. [8]WilsonAJ.InternationaltableforX-raycrystallography[M]. VolumeC,Dordrecht:KIu—rAcademicPublishe!,1992. [9]刘浪,刘广飞,贾殿赠,等.卜苯基一3一甲基一4一(6-氢一4一甲基氨 基一5一硫杂一2,3-吡嗪)一吡唑啉酮的合成与晶体结构[J].结构 化学,2003,22(2):203—206. [1o]王瑛,陆路德,建方方.等.4一苯基一2,苯偶氮基一1一硫代一3,4一 二氮唑硫酮一5的合成和晶体结构[J].结构化学,2001,20 (5):406—408. [11]WangY,JianFF,YangXJ,eta1.Diphenylcarbazideace— tonitrilesolvate[J].ActaCrystE,2001,57:312-314. [12]马礼敦.高等结构分析[M].上海:复旦大学出版社,2002. [13]黄量,于德泉.紫外光谱在有机化学中的应用[M].北京: 科学出版社,2000. [14]李锦州,沙靖全,安郁美,等.呋喃甲酰基吡唑啉酮缩氨基 硫脲稀土配合物的合成,表征及生物活性[J].分子科学学 报,2004,20(1):23—26. [153汪庆祥,焦奎,王学亮,等.2,4,6-三氨基嘧啶在玻碳电极上 的电化学行为[J].青岛科技大学(自然科学版),2004, 25(2):95—97. [16]李启隆,谭学才,胡劲波.抗癌药物伯莱霉素伏安行为及其反 应机理研究[J].高等学校化学,1997,18(1):37—41.