双孢蘑菇制种技术

双孢蘑菇制种技术 一、配制原则和种类 (一)培养基配制原则 ,、培养基:培养基是提供食用菌等生物生长发育所需的营养与特定环境条件的基质，如蘑菇菌是有机营养型中的草腐生菌。制备培养基不仅要考虑它所需要的含碳化合物、含氮化合物、矿物盐类、生长因子，还要考虑水与pH环境，同时还应考虑它们培养方式是固体培养还是液体培养。因此，可以把按菌类生长发育需要比例配制的灭菌营养基质，称为培养基。换言之，培养基必须具备三个条件:含有菌株生长发育所需要的营养物质;具有菌类生长环境条件;经过灭菌，并保持无菌状态。 ,、培养基的选择:在整菌种制备过程中，从母种到原种、栽培种，各个阶段的目的要求有所不同，所选用的培养基的配比也应有所区别。一般母种初生菌丝较嫩弱，分解养分能力差，要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应高。须选用易于被菌丝吸收利用的物质，如葡萄糖、蔗糖、马铃薯、蛋白胨、无机盐类及生长素等为等而原种、栽培种所需数量较多，且菌丝分解能力强，可利用大量农作物秸秆、粪草、棉籽壳、麸皮、米糠等原料作为培养基。 (二)培养基的种类 ,、根据营养物质的来源，可以把培养基分炎天然培养基、半合成培养基和合成培养基。 (,)天然培养基 天然培养基是指用化学成分还不清楚或化学成分不恒定天然有机物配制而成的培养基，如各种农副产品及其下脚料??小麦、大豆、玉米粉、麸皮、米糠、 作物秸秆、木屑、棉籽壳、甘蔗渣等，以及动植物组织的浸出液??牛肉膏、肉汤、马铃薯汁、麦芽汁、豆芽汁等都可以用来配制天然培养基，这种培养基来源广，成本低，营养丰富，适合于在生产上大规模培养菌类使用，但这些天然有机物质因产地、品种、生长期的不同，化学成分不能宣。每批成分也不稳定，不宜用来做精细的科学实验。以分离驯化食用菌培养基 (,)半合成培养基 为了促进食用菌菌丝的生长发育，常在天然培养基中添加适量的无机盐类，或在合成培养基中添加适量的某些天然有机物，就成为半合成培养基。这类培养基种类繁多，应用广泛，也是生长菌种和实际栽培最常用的培养基。 (,)合成培养基 是指采用化学成分已知的有机物(碳水化合物、含氮化合物、有机酸类)或无机物配制而成的培养基。这类培养基组成和含量明确，价格较贵，一般用于在实验室范围内做有关营养、代谢、菌种鉴定等有关于食用菌的生理生化研究。 ,、根据培养基制成后的物理状态，可将培养基分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。 (,)液体培养基 根据食用菌所需的营养物质，扫一定比例配成营养液，叫液体培养基。液体培养基可进行营养源的筛选实验，以及生理生化方面如酶活力等研究，应用液体培养基生产的菌种也可在生产中进行使用。 (,)固化培养基 将各种营养成份按比例配制成营养液后，加入适量固化剂，如琼脂，即可配成固化培养基。利用这种斜面试管可保藏及扩大菌种，同时亦可制成各种平皿固化培养基分离菌种。 (,)固体培养基 利用各种富含纤维素和木质素的农林废弃物如木屑、棉籽壳、 秸秆、玉米蕊等作为主要原料，再加入适量的米糠或麸皮和无机盐类制成固体培养基。该培养基可作为二、三、级菌种生产用的培养基，也可以用它制成发酵草粉保藏菌种用的培养基。 二、一级种培养基 一级种又称母种，其培养基一般用试管作为容器，所以又称试管斜面培养基，这类培养基又常用于菌种分离提纯，扩大，转管及菌种保存等，下面列举蘑菇菌种生产常用配方。 1.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 马铃薯(去皮) 200克 葡萄糖 20克 琼脂 18-20克 水1000亳升 2.马铃薯综合培养基(CPDA) 马铃薯200克 葡萄糖 20克 磷酸二氢钾 3克 硫酸镁 1.5克 维生素B1 0.05毫克 琼脂18-20克 水1000毫升 3.马铃薯酵母膏培养基(PDYA) 马铃薯200克 葡萄糖20克 酵母膏 1.5克 琼脂 18-20克 水1000毫升 4.麸皮葡萄糖培养基 麸皮 50-70克 葡萄糖 20克 琼脂 18-20克 水1000毫升 5.堆肥浸汁葡萄糖培养基 堆肥(干) 100克 葡萄糖20克 琼脂 18-20克 水1000毫升 6.玉米粉综合培养基 玉米粉 20-30克 葡萄糖 20克 磷酸氢二钾 1克 硫酸镁 0.5克 蛋白胨 1克 琼脂 18-20克 水1000毫升 9.E.B.Lamberr 培养基 葡萄糖 10克 硫酸镁 0.5克 磷酸二氢钾 1.9克 琼脂 20克 水1000毫升 适合于双孢蘑菇的担孢子萌发 三. 二、三级种培养基 二、三级种培养基通常采用天然营养物质，如秸秆、棉籽壳、蔗渣等农作物废物，加适量的无机盐类等制成固体培养基，现将常用的培养基配方介绍如下。 1.粪草培养基 发酵麦秆72% 发酵牛粪粉20% 麸皮5% 糖1% 磷酸钙1% 石膏1% 含水量62-65% 适合二级种 2.牛粪粉培养基 发酵牛粪粉98% 碳酸钙2% 含水量62-65% 适合二级种 3.棉籽壳培养基 发酵棉籽壳97% 过磷酸钙1% 碳酸钙1% 石灰1% 适合二,三级菌种 4.羊粪培养基 干羊粪98% 碳酸钙2% 含水量62-65% 适合二级种 5.矿石培养基 膨胀珍珠岩1450克 麸皮1650克 石膏粉200克 碳酸钙50克 水1650克 pH6.2-6.4 适合二级种生产 6.谷粒培养基 麦粒(小麦,大麦,燕麦,高梁等)97% 碳酸钙2% 石膏1% 含水量50-55% pH6.5- 7.0 适合二,三级种 7.小麦稻谷培养基 小麦88% 稻谷10% 碳酸钙2% 适合三级种 8.小麦牛粪粉培养基 小麦88% 牛粪粉10% 碳酸钙2% 适合三级种第一节 培养基的制备 一、消毒与灭菌的概念 在延期界中，微生物无处不有，无孔不入，如制种所用的原料、水、工具、设备、操作的双手和衣着以及空间，都有大量的微生物存在。因此要分离和培养食用菌纯种，首先必须将培养基进行灭菌达到灭菌状态，并对生产过程的各个环节以及环境也必须进行消毒，昼减少其它微生物的存活而造成生产的污染，因此消毒灭菌是菌种生产过程中必须掌握的最主要关键技术之一。 (一)消毒 具有杀死致病微生物的作用或方法，称为消毒。就食用菌菌种生产而言，消毒是指用物理或化学方法杀灭或消除对食用菌生长发育有害的微生物，通常只能消灭物体面或环境中的一部分微生物，有能达到消灭所有微生物。 (二)灭菌 指彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物，以及它们的芽胞和孢子，使物体成为无菌状态。 二、常用消毒和灭菌方法 (一)物理灭菌方法 通过高潮、射线、微波以及器械进行灭菌或除菌的方法均为物理灭菌方法。 ,、热力灭菌 利用高潮杀死微生物的方法，称为热力灭菌。微生物组成的最重要成份是蛋白质、核酸等，当高潮时会引起蛋白质和核酸不可逆的变性或凝固，使细胞失去了生理机能，停止生长发育，直至生化瓜停止而终止生命。此外高温尚可破坏细胞的 其他组成，或者使细胞的脂肪膜受热溶解而形成了极大的孔，导致细胞内含物泄漏而引起死亡，从而达到高潮灭菌的效果。 热力灭菌经常使用两个杀菌指数:热死温度和热死速度。前者指在,,分钟内可以杀死细菌悬液中所有细胞的温度，后者指在一定温度下，杀死所有细胞所需的时间。在同样温度条件下，热死温度高的微生物，其热死速度慢，热死温度低的微生物，其热死速度快。提高灭菌温度，可以加快热死速度。因此，可以通过提高灭菌温度来缩短灭菌时间，或延长灭菌时间以降低灭菌温度。 热力灭菌经济有效，简便易行，是最普遍采用的方法，它可以分为湿热灭菌和干热灭菌两种。 (,)湿热灭菌 指利用热蒸汽杀死微生物。由于蒸汽的穿透力较热空气强，蛋白质、原生质胶体在湿热条件下容易变性凝固，酶系统容易被破坏，蒸汽进入细胞内凝结成水，能放出潜在热量而提高温度，更增强了杀菌力。常用湿热灭菌方法圾如下几种。 A.高压蒸汽灭菌法 利用高温高压蒸汽进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌可以杀死一切微生物，包括细菌的芽孢，真菌的孢子或休眠体等耐高温的个体。灭菌的蒸汽温度随蒸汽压力增加而升高，增加蒸汽压力，灭菌的时间可以大大缩短。因此它是一种最有效的、使用最广泛的灭菌方法。蒸汽压力与蒸汽温度的关系见下表。 压 力 温 度 压 力 温 度 压 力 温 度 磅/英寸2 Kg/cm2 (?) 磅/英寸2 Kg/cm2 (?) 磅/英寸2 Kg/cm2 (?) 1 0.070 102.3 9 0.633 114.3 17 1.195 123.3 2 0.141 104.2 10 0.703 115.6 18 1.266 124.3 3 0.211 105.7 11 0.774 116.8 20 1.406 127.2 4 0.281 107.3 12 0.844 118.0 22 1.547 128.1 5 0.352 108.8 13 0.914 119.1 24 1.687 129.3 6 0.422 109.3 14 0.984 120.2 26 1.696 131.5 7 0.492 111.7 15 1.055 121.3 28 1.82 133.1 8 0.563 113.0 16 1.12 122.4 30 2.109 134.6 高压灭菌所采用的蒸汽压力与灭菌时间，应根据具体灭菌物质而定。液体培养基灭菌时，一般采用1.0Kg/cm2,温度121.30?,灭菌30分钟;母种、栽培种等固体培养基灭菌时，通常采用1.5Kg/cm2,温度129?,灭菌1-2.5小时。 但有些固体培养基导热性差，培养基中耐热性微生物又较多，如制备蘑菇栽培种的河泥烘料培养基，灭菌时间或灭菌压力要有所增加，通常压力为2Kg/cm2,灭菌时间为4小时。 使用高压蒸汽灭菌时，应注意以下几点: ,、灭菌锅内的冷气必须排尽。冷空气的热膨胀系数大，若无菌锅内留有冷空气，当灭菌锅密闭加热时，冷空气受热很快膨胀，使压力上升，造成灭菌锅内压力与温度不一致，产生假性蒸汽压，锅内温度低于蒸汽压表示的相应的温度，致使灭菌有能彻底。特别是使用只装有压力表，没有温度表的灭菌锅时，尤应注意。 排除冷空气的方法有两种:缓慢排气和集中排气。缓慢排气法，即开始加热灭菌时便打开排气阀门，随灭菌锅内温度逐渐上升，锅内的冷空气便逐渐排出，当锅内温度上升到100?,大量蒸汽从排气阀中排出时，即可关闭排气阀，进行升压灭菌。集中排气法，即在开始加热灭菌时，先关闭排气阀，当压力升到0.5Kg/cm2左右时，打开排气阀，集中排出空气，让压力降到零，并有大量蒸汽排出时，再关闭排气阀进行升压灭菌。固体培养基灭菌时可采用集中排气法。液体培养基灭菌时一般不宜采用，以免液体冲出瓶口 ,、灭菌锅内的培养基必须排列疏松，使蒸汽畅通。灭菌锅内蒸汽是否畅通，关系到灭菌温度是否均一。灭菌材料若放得过多、过密，会妨碍蒸汽的流通，影响温度分布的均一，造成局部地区温度较低，甚至形成温度“死角”，达不到彻底灭菌，常常导致以手杂菌污染。 ;、灭菌完毕，应缓慢减压。高压蒸汽灭菌结束后的排汽降压不能太快，若排汽太快，瓶内外的压力差 就会增大，引起瓶塞冲出瓶口;液体培养基灭菌时，液体会突然沸腾，弄脏瓶塞;塑料袋装培养料灭菌时，应让其自然冷却，当压力下降到0.5Kg/cm2左右时，再打开排气阀放气，以免在减压过程中，袋内外产生压力差，把塑料袋击穿，导致以后杂菌污染。 ,、注意棉塞防湿。用棉塞塞的瓶子或试管，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌时，因锅中热蒸汽在锅壁四周和锅盖内侧容易产生凝结水，凝结水沿着锅壁和锅盖下流，弄湿棉塞。潮湿的棉塞在培养过程中，容易生长链孢霉等霉菌，污染培养物。为了防止棉塞潮湿，灭菌时，瓶子的棉塞不能接触灭菌锅壁，瓶子上面就盖铝帽或防水油纸，以免锅盖下面的水流到棉塞上。灭菌结束时，应先排放锅内热水，然后再慢慢排放蒸汽降压。若棉塞潮湿，可在锅中烘烤一定时间再取出来。 B.常压蒸汽灭菌法 采用自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。阿诺氏(Arnold)流通蒸汽灭菌器是微生物技术中常用的设备。我国食用菌菌种生产过程中，有的利用蒸笼灭菌，有的利用钢筋水泥砌成大型的流通蒸汽灭菌灶，一次可灭菌几千瓶母种或栽培种培养料。 利用常压蒸汽灭菌时，灭菌物品在灭菌锅内排列不能过密，要保证蒸汽能在锅内均匀地流通。流通蒸汽的温度一般为100?左右，要杀死耐热性的芽胞， 必须延长灭菌时间，一般为6-8小时。这种专用流通蒸汽灭菌灶的最大优点是:容量大， 结构简单，成本低廉，可自行建造。缺点是灭菌时间长，能源消耗量大，稍不注意就有灭菌不彻底的现象发生。 C.间歇灭菌法 指间歇一定时间，连续消毒几次达到灭菌的方法。此方法运用于不耐高温的(100?左右)培养基的灭菌。欲杀死培养基的芽胞， 可将其在流通蒸汽中消毒20-30分钟,先杀死其中的营养体细胞,然后将培养基在室温或温箱中培养,使芽孢发芽长成营养体,再用流通蒸汽消毒20-30分钟,杀死新长成的营养体细胞,这样连续3次,即可杀死培养基中的全部芽孢,达到无菌状态。 (,)干热灭菌 采用灼烧或干热空气灭菌，称为干热灭菌。虽然干燥主热空气的穿透力不如湿热蒸汽强，但它使用方便，适用于玻璃器皿和瓷器等物的灭菌，故广泛应用于实验室和生产实践。干热灭菌主要有两种类型。 A.火焰灭菌法 即通过火焰高温灼烧进行灭菌的方法。耐热的接种环、接种铲、接种匙、接种针等，通过火焰灼烧，可彻底灭菌，试管口和玻璃瓶口，通过几次火焰，温度可达200?以上，一切微生物和芽孢，可全部杀死，达到无菌程度。 B.干热灭菌法 即利用加热的高温空气进行灭菌的方法。干热烤箱是干热灭菌的常用仪器，它是通过电热丝进行加温和调温的，不仅可以用来灭菌，也可用于器皿等材料的烘干。干热灭菌适用于固体材料灭菌，不适用于液体材料灭菌。由于干热空气穿透力 差，加之微生物蛋白质在干燥条件下，不易凝固变质，故干热灭菌温度，一般要求掌握在160?,维持2小时。但要注意，如果干热灭菌温度超过170?,包装灭菌用品的纸张或棉花布类,会被热空气烤焦，甚至有着火燃烧的危险。 ,、辐射灭菌 利用辐射产生的能量进行杀菌的方法，称之辐射灭菌。生产上应用辐射灭菌方法主要是指此外线灭菌。 紫外线灭菌 紫外线是非电离辐射，波长为136-400纳米，以波长265-266纳米的杀菌为最强。微生物细胞中的核酸碱基对紫外线吸收能力特强，辐射后引起核酸的突变，从而抑制DNA的复制而致死;与此同时， 空气在的一部分氧在紫外线照射下产生臭氧，也具有很强的杀菌作用。另外，紫外线照射微生物细胞后，在有氧的情况下，产生光化学氧化反应，生成过氧化氢(H2O2),能发生强烈氧化作用， 引起细胞死亡而达到杀菌目的。由于紫外线穿透物质的能力很差，一层普通玻璃或水，均能滤去大量的紫外线，所以只适用于空气和物体表面的灭菌，一般要求紫外灯距离照射物不超过1.0米为宜，接种室和接种箱常用紫外灯作为空气和桌面的消毒。 ,、过滤除菌 是利用机械的阻留方法来除去介质中的微生物。在菌种生产上应用的设备主要有超净工作台和空气自净器，它们均恬于空气过滤除菌，超净工作台主要是使操作台面达到局部灭菌，而空气自净器是使接种室的空气经过过滤达到整个空间的无菌状态。 (二)化学灭菌方法 利用化学药品灭菌或创造一个无菌环境，也是非常重要的灭菌手段。许多公演药品可使菌体蛋白质变性，有的可阻碍微生物的某一代谢环节。因此，化学药品可超到杀菌作用或抑菌作用。直接加入培养基能起灭菌作用，又不影响培养基成分的化学药品并不多，根据报道β,丙烷内酯(BPL)和焦碳酸二乙酯(PKE)具有这种作用，但应用甚少。有的具有杀菌和抑菌作用，但加入培养基后阻碍了香菇菌丝体生长发育，也不能被采用。香菇生产中常用的化学药品及具体使用方法如下。 ,、甲醛的杀菌机理是具有强还原作用。甲醛与微生物蛋白质(含蛋白酶)的氨基结合，使蛋白质变性。其反应式为:蛋白,氨基，甲醛(气体)?蛋白,氨基、甲醛。甲醛溶液杀菌力比石碳酸强，1:200的甲醛溶液在6-12 小时内可杀死所有的细菌芽孢;并对真菌孢子及营养体均有极强的杀伤力,不受有机物质的影响。因为它具有腐蚀性,刺激性大,不宜人体使用。常用福尔马林消毒空罐、无菌室或无菌箱等。 使用方法有加热熏蒸法，即利用福尔马林沸点96!0的特点，将福尔马林置于玻璃、陶瓷或金属容器中，用酒精灯或电炉加热，药液蒸发完，立即撤去热源。 加高锰酸钾氧化剂熏蒸法，即甲醛是还原剂，故与氧化剂反应可产生大量热。这种热又将蓁甲醛挥发。具体做法是在坩锅内(或用培养皿)，按每立方米体积加10毫升福尔马林与1.5克高锰酸钾的比例计量,任其甲醛挥发, 关好门窗闷一夜或更长时间,能够达到良好的熏蒸灭菌目的。熏蒸后，室内不断散发刺激鼻眼的臭味。 有必要驱除室内甲醛气味时，可向室内喷洒氨水，氨水浓度为25-28%, 喷的雾滴越小越好,喷氨水的量为熏蒸甲醛的一半,约30分钟左右,氨水与空气中残存甲醛结合,形成白色无臭粉 末。如无氨水，可用氯化铵或硫酸铵加石灰水产生氨气来中和甲醛。铵盐用量每立方米空间为5-6克。 ,、硫磺及其熏蒸灭菌方法 商品硫磺为有光泽的淡黄色粉末(或碎块)，不溶于水，熔点为363?,燃烧后生成二氧化硫。二氧化硫为无色气体，有刺激味，渗透力强，易溶于水，生成亚硫酸，有助于提高灭菌率，同时可杀虫、杀螨。 使用方法是按每立方米空间15-20克计量,将硫磺放置在离地面较高的瓷或金属容器中，点燃硫磺产生二氧化硫，二氧化硫的密度比空气大，很容易下沉，所以一定要注意将装硫磺的容器放在空间较高的位置。为提高灭菌效果，在熏蒸前，应先向空间及墙壁上喷少量水雾，有助于增加二氧化硫与生成亚硫酸，从而提高熏蒸灭菌效果。 硫磺点燃后，对人体呼吸道粘膜、眼结膜有刺激性，应注意防护。二氧化硫对纤维及金属物品有腐蚀作用，因此，熏蒸房屋时应撤出易腐蚀物品。 除熏蒸与内吸外，其他化学灭菌方法均可归纳为表面灭菌。它们对微生物的毒害作用主要是迅速使细胞表面蛋白质、核酸及有关酶类被破坏。 ,、乙醇类 乙醇又称为酒精。70-80%乙醇的杀菌能力较强。高浓度乙醇杀菌能力反而降低，因为95-100%的乙醇具有很强的脱水作用,当遇到微生物细胞时, 细胞表面很快脱水形成一层保护膜,乙醇分子再不易渗透保护膜起到杀菌作用。 如乙醇中加入稀酸或稀碱，杀菌效力增强。在70%乙醇中加1%硫酸或氢氧化钠,可在1-2 天内杀死枯草杆菌芽孢。乙醇只会杀死细菌营养体，在香菇生产中，多用于接种时手的皮肤及器械杀菌。使用时，对表面干燥的物品，用70-75%的乙醇擦拭;对于表面略湿润的物品多采用85%乙醇消毒。乙醇能降低酚、甲醛等杀菌能力， 但能增强硫横及升汞的杀菌效力。 ,、酚及其衍生物 常用的是石碳酸，又名苯酚，纯品为无色或白色针状、块状或三棱形晶体，溶于水，具特殊气味。浓石碳酸能使皮肤变白、手指麻痹并可损坏皮肤与粘膜，对人畜有毒。0.5-1%的石碳酸水溶液作为喷雾剂处理无菌室(箱), 能起到降尘除菌、空气消毒的作用;也可用3-5%的石碳酸水溶液对器械浸泡消毒。在5%石碳酸水溶液中若加入0.85-0.9%的食盐则可增加石碳酸药效,如有乙醇存在时, 则药效大减。 石碳酸杀菌原理是使细菌蛋白质变性，也具有表面活性剂作用，破坏细胞膜的透性，可合细胞内含物外溢。石碳酸水溶液浓度大时是致死因子;反之，则起抑菌作用。 甲酚是酚的衍生物，又名来苏尔(煤皂酚)，是用肥皂乳化的甲酚，杀菌效力比苯酚大,倍，常用3-5%的溶液消毒皮肤、桌面及用具。 ,、石灰与碱类 石灰分为生石灰(CaO)与熟石灰(Ca(OH)2)两种。起杀菌作用的是熟石灰中的氢氧根离子，能水解蛋白质和核酸，使微生物的酶系和结构受到损害，并能分解菌体中的糖类。 使用生石灰时应加水，或生石灰遇到潮湿的物体，均会生成熟石灰，其化学反应式为:CaO+H2O?Ca(OH)2+热量。如果熟石灰长时间曝露在空气中， 可能使熟石灰吸收空气中的二氧化碳而生成有能杀菌的碳酸钙，反应式为:Ca( OH) 2+ CO2?CaCO3+H2O 从反应式中可清楚地看到，如想灭菌只能用生石灰使其与水反应生成熟石灰而杀菌。一般1-3%石灰水就可起很好的杀菌作用。如用0.5%石灰水浸泡稻草,小时或更长时间，也可起到杀菌与软化纤维的作用。菌筒或菌砖上发现霉菌污染时，也可将生石灰直接撒到污染菌面上，杀菌效果良好。 ,、氧化剂与还原剂 高锰酸钾、过氧化氢、卤素(氯、溴、碘)及某些化合物(或络合物)，如漂白粉等均为氧化剂，可以杀菌。亚硫酸及亚硫酸盐等均为还原剂，能通过氧化还原反应起到杀菌作用。 (,)高锰酸钾 强氧化剂，1:1000与1:1250的浓度都具有杀菌作用。0.5-1%的高锰酸钾水溶液于,分钟内可杀死大多数细菌;,,水溶液于,小时内可杀死细菌芽孢。高锰酸钾在酸性溶液中杀菌作用增高，如用,,高锰酸钾和,,盐酸溶液能在30分钟内破坏炭疽芽孢。高锰酸钾遇有机物时被还原成无杀菌作用的二氧化锰。因此，有能用于直接拌料灭菌。高锰酸钾对霉菌杀伤效果很差。 高锰酸钾只局限于对皮肤、粘膜及玻璃器皿消毒用，绝不能用于香菇生产原料(木屑等纤维材料)的直接拌料灭菌。 (,)碘及其化合物(络合物) 3-7%碘溶于70-83%的乙醇中所配制的碘酊, 是皮肤及小伤口的有效 消毒剂。5%与10%碘化钾水溶液也是皮肤有效的消毒剂。 有机碘化物如碘福具有良好杀菌作用，有仅能杀死一般的细菌和真菌，并可使病毒灭活。 (,)漂白粉及其使用方法 漂白粉(氯石灰)是白色粒状粉末，能溶于水，易生成沉淀。高效漂白粉的有效氯含量为40-80%。漂白粉的使用浓度为,,，通常按每立方米空间用,克高效漂白粉计量。使用时将,克高效漂白粉溶于,升水中，静放,小时左右，取其上清液喷雾灭菌。 漂白粉的杀菌原理是漂白粉溶于水后，生成次氯酸和次氯酸盐等，并能释放氧，使细菌蛋白质或酶发生氧化;同时，释放出的氯还能取代蛋白质氨基中的氢离子使蛋白质变性，从而杀灭微生物。 ,、重金属类 一些重金属及其化合物，可使微生物的蛋白合成受破坏，亦可导致酶失活及取代细胞结构上的主要元素，使微生物生长受掏或导致死亡。 常用的表面消毒剂是二氯化示，又名升汞。1:500-1:2000的升汞溶液对多数细菌有匀菌作用。由于升汞对金属器皿有腐蚀作用，对人畜有剧毒，目前又合成了对人体低毒的硫柳汞、袂塔酚(metaphen)等。 在香菇生产中常用的硫酸铜也是防治真菌的良好消毒剂，使用浓度低于,,，喷洒物体表面，主要防治青霉类真菌。如将硫酸铜、石灰、水，按1:1:100 的比例所配制成的波尔多深夜，是菇房、床面等的良好表面消毒剂。 ,、表面活性剂 具有降低表面张力的物质称为表面活性剂。常用的肥皂与十二烷基磺酸钠类(如洗衣粉)的杀菌能力相当于石碳酸的2-3倍。 市售的新洁尔灭是季胺盐类的表面活性剂。化学名称为十二烷基溴化胺，淡黄色，有香味的胶状体。一般可将原液(5%)稀释一倍，把器械或手、以及不能遇热的器具进行消毒。对细菌、病毒有较好的杀灭能力，但对真菌杀灭效果不好。经常使用新洁尔灭会使皮肤干裂，同时对粘膜有刺激性，对铝制品有腐蚀性，对橡胶没有消毒作用。因此，不能用新洁尔灭消毒胶塞进行担子菌菌种保藏。 表面活性剂的杀菌机理是改变细胞透性，使菌全破裂;聚集在菌体表面时，影响细胞代谢，破坏细胞蛋白与酶的活性。 ,、气雾消毒盒 三、消毒与灭菌效果的检查 消毒与灭菌效果好坏，直接关系到菌种成品率的高低。因此，除了要严格把好消毒、灭菌关外，同时还要严格执行检验，两者缺一不可。 (一)培养基灭菌效果检验 ,、试管母种培养基经灭菌后，从高压灭菌锅中不同部位随机抽取,支，放置28?2?恒温箱中培养5-7天,如无霉菌、细菌、酵母等杂菌出现，则认为灭菌彻底。 ,、原种及栽培种培养基经灭菌后，从灭菌锅中上、中、下三层进行取样，每层对角线随机取样,瓶(袋)，放置28-30?恒温培养箱中培养5-7天，检查是否有霉菌菌落生成。如检查是否有细菌没有杀死，必须使用细菌培养基进行检测。细菌培养基:称取牛肉浸膏(或牛肉汁)10克,蛋白胨10克,NaCl15克,琼脂粉14 克, 加蒸馏水1000ml,经加热溶解后,装入试管中,在121?条件下灭菌15分钟,随后排成斜面试管。上述抽取的样品，分别在无菌下取出少量培养基接入细菌培养基，然后在37?培养24小时，检查结果没有细菌菌落产生，说明灭菌彻底。如某一位置试样出现杂菌，可能是锅内有“死角”，也可能是灭菌锅结构不合理，或没有按操作要求堆积， 气撒料，或一次性撒料过厚，或菌种瓶、袋过于拥挤，蒸汽流通不均匀造成;如不分部位，大部分或几乎全部瓶、袋都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，如果是高压灭菌锅出现这种现象，则说明是冷窑没有排除干净所致。 (二)接种室(无菌室)、箱灭菌效果检验方法 ,、平皿法 先制作常任的霉菌培养基，如CPDA、PDA、BSA等，灭菌后，常规制作无菌平皿培养基(简称平板)。检查接种室(箱)灭菌合格与否，随机取几组无菌平皿培养基(每组3-5个平皿)在接种室(箱)台面上不同位置打开置放的平皿， 其中一组不打开平皿盖作为对照，开盖平皿放置,分钟，然后盖上盖，与对照组同时在30?培养72小时,检查在平皿培养基上是否有霉菌菌落。实验组少于,个 菌落，视为灭菌合格。 检查细菌方法同上，一般采用MPSA培养基。不同的是将实验的平皿均放置在37?下培养24小时,至多不超过48小时。 ,、试管法 将上述常规真菌与细菌培养基斜面各取3-5支为一组,放置接种室(箱)内,按无菌操作将其中实验组棉塞打开,经30分钟后,再将无菌棉塞塞好,与对照组同时放在30?和37?进行(细菌与霉菌)培养。细菌在培养24-28小时后观察， 霉菌在培养72小时后观察,实验组均不长任何菌落,视接种室、箱灭菌良好。 菌种分离即是进行蘑菇菌丝的纯化过程，它是制种工作的重要环节，通俗讲是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。蘑菇菌种的分离方法有三种:即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。 一、孢子分离法 蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子(是指其细胞核已经地核配过程)分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。 (一)采集孢子 ,、种菇的选择 采集孢子首先要选好种菇即分离用的子实体。一般蘑菇种菇要求是第一潮菇，出菇较早，单生，个体健壮，特征典型的子实体，经过仔细的观察筛选后在菇床上做个记号，让种菇充分生长，直至即将破膜时将菇采摘进行孢子弹射。 ,、孢子弹射收集 种菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。随后用无菌刀切掉多余菌柄(约留下1.5-2cm即可)，把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩(如图 所示)。这套孢子收集装置需事先进行高压灭菌消毒。把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20?的室内,经24-48小时左右， 可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并在温度下进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。 (二)孢子分离 ,、多孢分离法 即把多个孢接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易，在过去的蘑菇制种中应用较为普遍。 (,)斜面划线法:按无菌操作，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力， 以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24?恒温培养箱中培养，待孢子萌发后(一般约15-20天)，挑选萌发快，长势旺的菌落， 转接于新试管培养基上再行培养。 (,)涂布分离法:按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴1-2滴到PDA试管或培养皿培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培养基上经24?恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称，生长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即为母种。 ,、单孢分离 就是将采集到的孢子群单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种的方法， 单孢子分离的方法，按分离的手段可分为以下三种。 (,)稀释分离法:这是通过不断稀释孢子悬浮液，使孢子分散最终孢子浓度控制在300-500个孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入平板均匀涂布，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，其步骤如下: ?制备无菌水试管:取10支试管,其中1支装100毫升蒸馏水,其它9支装9毫升蒸馏水,经高压灭菌即成无菌水。 ?制孢子悬液:取一小块收集有孢子的滤纸条，浸入10毫升无菌水试管中, 摇振使孢子分散成悬液,用无菌1毫升移液管吸取1毫升孢子悬液于第2支试管中, 摇振使其分期,再从第2支试管中吸取1毫升注入第3支试管中, 如此反复稀释直到孢子浓度达到300-500个孢子/毫升,备用。 ?制培养基平板:配制PDA培养基,装入三角瓶中进行高压灭菌, 准备倒平板的培养皿也经过高压灭菌备用,待已灭菌的PDA冷却至50-60?时,在无菌操作下倒15-20 毫升PDA至培养皿中,培养皿放平,昼使培养基表面光滑,厚度一致。 ?孢子涂布:在无菌操作下，吸取0.1毫升的孢子悬浮液滴在平板培养基表面上,使用T氏棒把孢子均匀涂布在平板上,盖上刺激菌丝培养皿,放置于24-25?恒温箱中培养。 ?挑选单孢子萌发菌落:一般孢子经过,天的培养开始萌发长出菌丝，培养皿经过显微镜的镜检确定孢子萌发的菌落是由单个孢子萌发成长而成的，可使用打孔器进行打孔把该菌落移接至新鲜的PDA斜面试管中继续培养。 打孔器的外径应小于显微镜的视野范围，而且打孔之前须检查该菌落周围是否有孢子或其它菌落，昼使打孔不会触及周边的孢子或菌落，确保纯种。 (,)毛细管法:孢子悬浮液经过稀释，使用毛细滴管把孢子悬浮液滴一小滴于皿盖内，昼使每一滴只含有一个孢子，从而达到单孢子分离，其方法如下: ?孢子悬浮液制备同稀释分离法，孢子浓度控制在200-300个孢子/毫升。 ?毛细滴管制备:取洁净的玻璃管在酒精喷灯上先拉成外径1毫米的细管, 稍冷却后再加热并迅速拉长,使管尖内径约200微米,剪断即成毛细滴管,在滴管后端塞棉花, 装入消毒盒中后进行灭菌备用。 ?点样镜检:用毛细滴管吸取经稀释的孢子悬浮液约0.1毫升(可滴30滴),在无菌操作下,快速点于皿盖内壁的标记圈中央,滴液应小于低倍镜的视野, 点样后的培养皿仍盖在有水琼脂的皿底上,贴胶布固定后再用低倍锐检查皿盖内壁的的液滴,确定是单孢者,即在皿盖上标上记号。 ?培养基推贴及刺激培养:使用接种针取一小块PDA培养基(约2×2毫米方块) 推贴至标记为单孢子的液滴,使液滴中的孢子能够吸附到培养基边缘。 将事先培养好蘑菇气生菌丝的平板培养皿盖取下，套在菌丝平板的底部，再把已分离并推贴好的培养基的皿盖罩在套有菌丝平板的玻璃皿上，使两个皿盖对接，贴胶布封口(要留0.5厘米缝用作通气),这样就形成一个刺激单孢子萌发的培养室,置培养箱中24 ?下培养,待单孢子萌发,及时撕下胶布,用接种铲挑取已萌发的单孢菌丝贴块,移接到新鲜PDA斜面试管中,置24?恒温箱中培养,即可区得单孢纯种。 (,)器械分离法:应用显微操作器，直接挑选单孢子，移至PDA 平板中进行孢子刺激萌发培养,获得单孢纯种。 ?孢子悬浮液制备:同稀释分离法，孢子浓度控制在1000个/毫升; ?平板涂布:将稀释后的孢子悬浮液滴0.1毫升于平板上,用无菌的T氏棒进行均匀涂布,每个平板含孢子大约100个左右; ?镜检分离:待涂布均匀的平板琼脂表面水分干燥后即可于显微镜下观察,当在视野中心见到孢子,而视野周围无其它孢子时,可用显微操作器操纵玻璃针把孢子从培养基表面挑取,随后把孢子转移至PDA平板的表面上,进行孢子萌发培养,孢子萌发培养须使用蘑菇气生菌丝刺激培养,才能提高萌发率,培养的具体操作方法与涂布分离法相同。 (,)单孢子菌落接待:当孢子经过10天的刺激培养, 肉眼可见到菌丝生长而成小菌落,应及时用打孢子器把该菌落分离,每天都应观察孢子萌发情况, 如果不及时把菌落移接,该菌落会快速生长而影响较迟萌发单孢子的分离。 二、组织分离法 组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。组织分离系一种无性繁殖法，双亲的染色体没有经过重组，因此组织分离基本上可保持亲本的生物不特性，棒操作简便，取村广泛，在过去传统的稳定菌株中常采用此方法进行菌种的分离，退化不明显，但是随着蘑菇杂交菌种的应用，由于杂种本身所具有的不稳定，组织分离常造成菌株的退化，目前生产上很少采用，只是进行野生菌株分离时，才比较常用。其方法如下: ?挑选种菇:其标准与孢子收集要求相同; ?菇体消毒:将子实体菌柄基部切除,置接种箱内,用75%酒精对菇体表面进行消毒; ?组织分离:解剖刀经火焰灭菌,在菇柄中部纵切一刀, 用手掰开菌再用接种铲在菇盖与菇柄交界处切五个小方块,随后挑取一小块组织,迅速移接到PDA斜面培养基上,置24?下培养,待组织块长出菌丝无污染即为纯种。 一、一级种的生产 一级种的生产指试管母种的扩大繁殖。一般由自己分离培养获得的母种，或从专门从事菌种研究部门引进的母种都要进行扩大繁殖，以增加母种数量，再用于繁殖原种。母种转管扩繁次数不宜过多，否则会降低菌种的生活力，影响产质量。对于没有母种生产经验缺乏母咱质量鉴别能力的制种单位，昼不进行一级种的生产。 ,、培养基配制 (,)马铃薯葡萄糖培养基 ?配方参见上述一级种培养基; ?制作方法:选择质量好的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分，切成1-2 毫米厚薄片。称取200克,加水1000毫升,煮沸后,小火保持30分钟。然后用八层沾湿纱布过滤,滤液中加入预告浸泡拧干的琼脂,继续加热, 并不断用玻璃棒搅拌直至琼脂完全溶化,加葡萄糖搅匀,最后用清水补足至1000毫升,即可进行分装。 (,)综合马铃薯培养基 ?配方参见上述一级种培养基; ?制作同PDA培养基,在加入葡萄糖同时加入磷酸氢二钾,硫酸镁,维生素B1等。 (,)堆肥浸汁葡萄糖培养基 ?配方参见上述一级种培养基; ?制作方法:先把堆肥剪碎成1-2厘米长,加入水1000毫升煮沸后,用小火保持30 分钟,随后的过程同上。 ,、分装 上述制备的母种培养基，趁热时尽快分装试管。用下口瓷量杯或用玻璃漏斗夹在滴定架上，下接一段乳胶管,用弹簧夹夹隹胶管,左手握试管, 右手控制培养基流量,使每支试管装量相当于试管长度的1/4左右。 ,、塞棉塞:棉絮可用未经脱脂的原棉。一种方法是用手把棉絮做成棉塞塞入试管，松紧度以检查时用手抓隹棉塞不脱落为度。棉塞要紧贴管壁不起皱纹，棉塞塞入管中的部分约为,厘米左右，外露部分约占棉塞总长的1/3左右。 另一种方法是事先把棉絮用纱布包扎成塞子，规格是根据不同试管大小而定，松紧度以及塞入试管的要求同上。 ,、灭菌:将制好的试管培养基用纱布包扎成一捆，在棉塞上盖上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞，随后放入手提式高压锅中进行灭菌，灭菌温度达121?维持30分钟,具体操作要求参照高压蒸汽灭菌法。停火自然降压至零后， 打开高压锅盖。 ,、摆斜面:将灭菌后的试管趁热放入摆斜面的专用木框内，木框底部前边支一小木块使之稍倾斜， 使木框内的试管培养基摆成斜面，一般长度的为试管的2/3即可,摆好斜面后在上面盖一保温棉,防止试管冷却过快产生太多的冷凝水。 ,、检验:制好的斜面要进行灭菌质量检查。随机抽取数根已灭菌的试管培养基放在28-30?下进行三天空白培养,检查确实没有污染杂菌,斜面才能正式接种使用。 ,、接种:接种前，把培养基放入接种箱中进行消毒，消毒要求按前述进行。接种时，手和接种针用75%的酒精棉球揩擦,点燃酒精灯,使火焰周围空间形成无菌区， 左手平行并排拿起母种试管和供接种用的斜面试管，两支试管斜面要向上，管口要齐平。右手大拇指和食指持接种针，在酒精火焰上灼烧灭菌。将左手试管移至火焰旁，用右手的小指、无名指和手掌，在火焰旁分别夹下两试管的棉塞，将试管口在火焰上稍微烤一下，以杀灭管口上的杂菌，随后将管口移至距火焰1-2厘米处， 用冷却了的接种针将母种纵横切割成许多小方块，然后挑取一小块，迅速移入被接咱的试管斜面的中前部，轻轻抽出接种针，再烤一下试管口，迅速塞上过火焰的棉塞，如此连续操作，,支母种一般可扩接试管30-40支。 技术要点:整个操作过程均须在火焰旁进行无菌操作，母种上的接种块以及周边已老化的世界经济 要移接扩管，尽量挑选菌龄短的菌丝块进行生产。 ,、贴标签培养:试管从接种箱取出之前，应逐支试管正面的上方贴上标签，写明菌种编号、接种日期，随后把试管置培养箱(室)中24?下培养。 二、二级种的生产 二级种是由一级种繁殖而来，常称为原种主要用于繁殖三级种(栽培种)，以满足大量繁殖栽培种的需要。 ,、培养基配制 (,)粪草培养基: ?配方见上述; ?制作:把发酵麦秆切短，大约为3-5厘米,加入粉碎牛粪粉,麸皮,石膏,碳酸钙,石灰,充分拌匀,加水调湿使培养基均匀吸水至含水量达65%左右,随后铲成一堆让培养基水分平衡2-3小时,即可装瓶。 (,)发酵牛粪粉培养基 ?配方见上述 ?制作:发酵后晒干牛粪粉经过粉碎过筛(筛孔0.5×0.5厘米)，拌入碳酸钙，用1%石灰水调整含水量达65%左右,pH值约为8.5,堆成一堆使牛粪粉水分平衡, 装瓶前再搅拌均匀。 (,)发酵棉籽壳培养基 ?配方见上述 ?制作:棉籽壳80% ,牛粪粉20%,石膏1%,石灰2%,混匀后加水调湿含水量达70%, 进行建堆发酵,堆宽1.5米,高1.2-1.5米,长度根据数量而定,当料温达65-70 ?时可进行翻堆,一般3-4天翻一次,每次翻堆时应补充1%石灰水,含水量控制在65-70%之间, 经过4-5次翻堆,棉籽壳长满大量高温放线菌而腐熟,这时已适合蘑菇菌丝的生长,腐熟棉籽壳晒干备用。制种时把腐熟棉籽壳按配方要求与其它辅料充分拌匀，用,,石灰水调节含水量达65%左右，堆成一堆使水分充分平衡均匀， 装瓶前再搅拌均匀即可。 (,)羊粪粉培养基 ?配方见上述 ?制作同发酵牛粪粉培养基 (,)矿石培养基 ?配方见上述 ?制作:把培养料混合均匀，用,,石灰水调整含水量达60%左右,搅拌均匀即可装瓶、菌种质量标准 ,、一级种(俗称母种):在同一种培养基上具有原菌株的菌落形态特征，无病虫杂菌，菌丝洁白，生 长健壮有力，边缘整齐，不发黄，不老化，菌龄掌握在刚长满斜面即用于扩接原种或继代培养。 ,、二级种(俗称原种):无感染病虫杂菌，菌丝洁白，粗壮浓密，均匀布满瓶周，外见颜色一致，无不均匀斑，培养基由棕黑色转为淡棕黄色，有蘑菇特有香味，菌丝不萎缩，不发黄，接种后应在40-50天长满瓶,菌龄掌握在菌丝长满瓶10天左右使用。 ,、三级种(俗称栽培种):无感染病虫杂菌，菌丝洁白玉米黄，粗壮有力，均匀布满瓶周，外观颜色大体一致，无明显不均匀斑，培养基成淡棕黄色，有蘑菇特有香味，培养基不萎缩，不吐黄水，接种后菌丝应在30-45天长满瓶,菌龄掌握在菌丝长满瓶后15天内使用。 二、菌种质量鉴定: ,、直接观察 首先用肉眼观察包装是否合乎要求，棉塞有无松动，试管、玻璃瓶或塑料袋有无破损，棉塞和试管、瓶或袋中有无病虫侵染，菌丝色泽是否洁白均匀，有无发生老化。然后在瓶塞边作深吸气，闻是否具有蘑菇菌种特有的香味，原种和栽培种可取出小块菌丝体观察其颜色和均匀度，并用手指捏料块检查含水量是否符合标准。 ,、显微镜检查 在载玻片上滴一滴蒸馏水，然后挑取少许菌丝置水滴上，让菌丝体充分展开，盖好盖玻片，再置显微镜下观察。也可通过菌丝体染色后镜检观察。蘑菇菌丝体应粗壮，菌丝节较长，呈分枝状，说明是正常菌种，如果菌丝节很短，分枝很浓密，菌丝较纤细，生长缓慢，一般为不正常菌种。 ,、菌丝生长速率测定 将所获的菌种，转接至PDA 培养皿中央, 待菌丝身皿边辐射蔓管时, 用直径0.5cm的打孔器,经灭菌后打取边缘菌丝,边同培养基重新接入PDA 培养皿中央进行培养,每隔24小时,测定菌落直径,直至菌落覆盖全皿为止,从而耱出菌丝平均生长速度。 ,、耐高温测定 先将母种试管数支置于24?下培养,10天后取出部分试管置30?下培养,24小时后再放回24?下培养,经过高温的处理,如果菌丝仍然健壮,旺盛生长,则表明该菌种具有耐较高温度的优良特性,也可将母种试管移接至草基试管培养基中,置24?下培养5天正常生长后,把试管置28?下进行培养, 如果菌丝能较正常生长也表明该品种具有耐较高温度的优良特性。 ,、 吃料能力鉴定 将试管母种接入新鲜配制的装在试管中的粪草培养基中， 置24?下进行培养,5天后观察菌丝生长情况,如果菌种块能很快萌发,并迅速向培养料中生长伸展,则说明该品种的吃料能力强;如果菌种萌发后生长缓慢, 迟迟不向四周和料层深处伸展,则表明该品种对培养料的适应能力差,是劣质菌种。 ,、生理特征测定 蘑菇菌种的生理特征测定包括酶活力测定和遗传两方面。酶活力测定主要是进行纤维素酶活力的测定，遗传分析主要是进行酯酶同工酶的检测，以及RAPD检测等,分析该品种的遗传物质是否保持原有品种的特征带,如果遗传分析发现主要标记酶带或扩增带发现变异说明该品种有可能出错或已发生变异, 是劣质菌种。 三、菌种的退化与复壮 ,、菌种的退化 菌种在传代过程中，因遗传物质发生变异而引起的使原有的优良性状渐渐消失或变坏，出现长势差、出菇迟、产量不高、质量不好、子实体丛生等现象。这些现象人们泛称为“退化”。“退化”是一个群体概念，即栽培中子实体群体中有少数子实体与亲本不同，不能算退化，只有相当一部分乃至大部分个体的性状都明显变劣，群体生长性能显著下降时，才能视为菌种退化。菌种退化往往是一个渐变的过程，菌种退化只有在发生有害变异的个体在群体中显著增多以至占据优势时才会显露出来。因此尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种呈现“退化”却需要较长的时间。 ,、菌种发生退化的原因 (,)菌种混杂 在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致不同品种的菌丝体混杂在一起， 菌丝生长发生变异，导致原有品种生产性状的改变，常常表现出产量下降、质量变劣等。 (,)有害突变的发生 一般来说，一个正常菌株经过多代移植，不会导致遗传性状的改变。但是如果一个菌株的菌丝细胞中发生有害突变，而且突变体能适应外界环境条件。那么，随着移接次数的增加，有害突变体在菌丝细胞群中所占的比例会逐渐增大。这样，该菌株的生产性能就会随之恶化，退化现象就逐渐显现出来。 (,)杂交菌株的双亲核比例失调 杂交菌株的菌丝体在转管过程中，受到外界环境、营养条件等改变的影响，其中一个亲本的核发育正常逐渐占据优势而另一亲本的核可能不适应而逐渐减弱，这样导致双核比例的失调，随着扩管代数的增加，核比例失调逐渐扩大，最终导致在栽培中表现出退化现象。 (,)病毒的感染 菌种感染病毒后，病毒不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且会通过带毒孢子传染下一代。当菌种携带一定浓度的病毒粒子，在栽培中都会表现出明显减产，菇质量下降等退化现象。 四、防止菌种退化的措施 (,)要防止菌种的混杂，在菌种转管，进行出菇试验等工作中，均应加强品种隔离，减少品种间的混杂，以保证优良品种的遗传组成在较长时间内能保持足够的稳定。 (,)控制菌种传代次数 菌种传代次数越多，产生变异的机率就越高，因此菌种发生退化的概率就会越多，生产中应严格控制菌种的移接代数。 (,)采用有效的菌种保藏方法保存菌种 菌种保存应是短期、中期和长期三者相结合，根据不同的要求从不同保藏方法中进行扩和移接，确保菌种能长期保持该品种的原有优良性状。 (,)创造菌种生长良好营养条件和外界环境 菌种培养基的营养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化的发生。营养不足和过于丰富对菌种生长均不利。菌种的生长繁殖受到物理、化学、生物等外界条件的影响，如条件适宜，菌种生长正常，不易退化，不相适宜，则会引起菌种的退化。比如芳香族化合物，能诱发绒毛状菌丝体成扇形菌落的形成，这种菌丝体在料床上易形成致密的白斑，导致产量下降。 (,)对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕。对有疑问的菌种要及时检验。确证已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体及子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。 ,、菌种的复壮 (,)菌丝尖端分离进行提纯复壮，在显微镜下应用显微操作器把菌丝尖端切下转移至新瓶的PDA培养基上培养，这样可以保证该菌种的纯度， 并且可以起到脱病毒的作用，使菌种保持原有品种的遗传物质，恢复原来的生活力和优良种性，达到复壮的目的。 (,)适当更换培养基，长期在同一培养基上继代培养的菌种，生活力可能逐渐下降。将碳源、氮源、碳氮比、维生素、矿物质营养作适当调整，对因营养基质不适而衰退的菌种，有一定的复壮作用。 (,)菌种分离，要有的把无性繁殖和有性繁殖的方法交替使用，反复进行无性繁殖菌种会不断衰退，而经有性繁殖所产生的孢子，是食用菌生活史的起点，具有丰富的遗传特性，因此必须定期进行蘑菇菌株的单孢分离筛选，从中优选出具有该品种原来优良性状的新菌株，逐渐替代旧菌株，这样就可不断地使该品种得到恢复，长期使用。 一、概述 蘑菇菌种和其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性。遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征 以及不污染杂菌和发生虫害。能够长期在生产上和研究上应用。 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。菌种保藏的原理是:通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。 二、保藏方法 (一)斜面冰箱保藏法 这是蘑菇菌种的一种短期保存法，因为它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察保藏菌种的情况，因此也是常用的菌种保藏方法。 ,、保藏方法 蘑菇菌种斜面冰箱保种一般使用PDA斜面培养基即可。菌种移接后，放在22-24?温度下培养,要勤检查,当菌丝健壮地长满试管时,及时挑选无污染的培养斜面,棉塞用硫酸纸包扎后放置在4?的冰箱中保藏。一般2-3个月转管一次。 ,、注意事项:由于斜面冰箱保藏是在4?下进行,微生物单孢分离物活动并未停止,需要经常转管移接,因此对于保藏所用的斜面菌种质量要求较高，其菌丝形态、菌落特征应保持原有特性，操作人员必须对斜面菌种质量应具有有一定的鉴别能力，所挑选的菌种才能适合保藏，其次菌种的菌龄不能太幼也不能太老，否则冰箱保藏后转管扩接易造成退化。再则冰箱温度应控制在2-4?之间,尽量恒温使菌丝体处于稳定的生理状态。 (二)粪草管冰箱保藏法 ,、保藏方法:粪草管的培养基是由腐熟麦秆粉100,腐熟牛粪粉25,麸皮8, 石膏粉1%,碳酸钙2%,含水量65%左右,pH7.5制备而成,调配后装入试管中,经高压灭菌后,接入菌种块,放在22-24?温度下培养。要勤检查是否有污染，当菌丝健壮地长满草基试管时，及时挑选生长正常无污染的试管，棉塞头用硫酸纸包扎后放置在2-4 ?的冰箱中,该保藏方法为中期保藏，一般2-3年转管一次。 ,、注意事项:由于粪草管可保藏2-3年时间,因此如何防止粪草管的水分损失是该保藏方法时间长短的关键所在,一方面培养基含水量不能低于62%, 另一方面棉塞用硫酸纸包扎后可加些蜡进行封口,防止水分蒸发。 再则有条件应把试管保藏在具有保湿的冰柜或冰库中，温度控制在2-4?,湿度控制在90%左右。 (三)液体石蜡保藏方法 液体石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与 空气接触，抑制菌丝的单孢分离物，可能使其处于休眠状态，推迟细胞衰老，延长菌丝的保藏，一般可保藏5-7年，是一种中长期的菌种保藏方法。 ,、保藏方法:液蜡保藏蘑菇菌种的培养基为PDA斜面即可。将菌种块移接到PDA斜面上,在22-24?下培养15-20天,然后用液体石蜡封藏保存。液体石蜡要选化学纯的，在121?下高压灭菌30分钟,再将液体石蜡在160?烘箱中加热1-2小时。亦可将高压灭菌后的液体石蜡放置在40-60?温箱中,使灭菌后的液体石蜡层出现乳白色直至变成完全透明的无色为止,目的是将高压灭菌时侵入液体石蜡中的水蒸发干净。 将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1.0厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，置室温中保藏。 ,、注意事项:菌丝的培养时间不能太短，为防止菌丝体的进一步发育，可适当延长菌龄或让试管先置在冰箱中(2-4?)2天后再加入液体石蜡。倒入的液体石蜡要超过斜面尖端1.0厘米左右,如过低液体石蜡挥发后会露出斜面, 从而导致斜面培养基的干涸,缩短了保藏时间。烘烤液体石蜡应乇底，尽可能把水分蒸发干净， 防止水蒸汽蒸发导致棉花塞潮湿长霉而影响菌种的保藏。 (四)滤纸保藏法 将蘑菇孢子吸附在滤纸条上，干燥后放入冰箱进行保藏，由于该保藏是有性的孢子，一般不用于生产中，主要是起到保藏种质资源的作用及菌种的选育，根据福建省蘑菇菌种研究推广站的滤纸孢子保藏试验，用该方法已保藏蘑菇菌种达10年以上,孢子成活率约为50-80%之间。 ,、保藏方法:孢子收集方法同单孢子分离的孢子收集，当滤纸条上收到有相当数量孢子后，用无菌镊子将滤纸条无菌操作放入无菌试管中，将该试管放在抽真空的干燥器中1-2天,除去滤纸条上水分使之充分干燥,随后把试管口封好,粘好标签, 放在冰箱中保藏。 (五)真空冷冻干燥保藏法 真空冷冻干燥简称冻干。这种方法是利用低温使孢子先冷冻，然后再在真空条件下，使孢子中的水分升华排出，孢子处于休眠状态，但仍保持原有活力，是一种长期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具体操作如下。 (,)选用内径8mm,长120mm的中性玻璃管作为制安瓿管的材料。将玻管用2% 盐酸浸泡8-10小时,再用蒸馏水洗2-3次后,置烘箱中烘干。将印有菌号、编号、 制作日期的标签放入安瓿管中，塞好棉塞，进行干热灭菌。 (,)用接种铲将收集的蘑菇孢子铲入盛有3ml无菌脱脂牛奶的试管中,稍加摇动, 制成孢子悬浮液。用无菌吸管将孢子悬浮液移入安瓿管的球形部分，每管约0.2ml,然后将管口通过火焰,用无菌镊子取少许无菌棉花塞于安瓿管口。 (,)将安瓿管放入无水乙醇与干冰混合的冻装置，温度可达-65,-70?预冻5 分钟左右,也可在低温冰箱(-40)预冻30-60分钟。然后取出放入真空干燥器中， 用高真空活塞油封好立即抽真空，并随时用真空火花检漏仪检查真空度，发现有微小漏气处，要迅速用真空泥涂住。一般真空度应维持在10.7千帕以下,如抽真空10 分钟后仍达不到此真空度,说明真空系统不佳,可能会造成融化而失败。真空干燥器外面用1:3的盐冰水保温,其效果会好些,真空度稳定,一般抽7-8小时,可完全将安瓿瓶中水升华至干。此时应关闭缓冲瓶前的三道阀门，然后再断电。抽干后的安瓿瓶颜色应是白色，如果浅黄色或不成凹状，多数都因为真空度达不到要求而造成融化失败的结果。 (,)冻干好的安瓿瓶要进行真空熔封。可用一个顶端多歧管或一个,型管，每个分支口都接入真空橡皮管以便将安瓿管接在橡皮管内，然后抽真空，边抽真空边用煤气喷灯熔封。熔封的安瓿 瓶要进行检漏，可用高真空火花检漏仪检查。安瓿瓶内呈蓝色荧光，说明真空封口良好，也可用微带红或蓝的清水浸泡安瓿瓶，经一昼夜安瓿瓶内无颜色水浸入，则为封口合格。 (,)菌种安瓿瓶经无菌检查和存活率检查合格后，置2-8?冰箱内保藏,一般蘑菇菌种可保藏8-10年。 (,)复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3-0.5ml的无菌生理盐水或1% 麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿瓶的封端加热，在浸有来苏尔等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。安瓿瓶加入生理盐水后菌种即自行溶化，摇动后即成孢子悬浮液，可接入PDA培养基上,进行萌发培养。 (六)液氮超低温保藏法 液氮超低温保种是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿瓶内，将该安瓿瓶放入液氮(-196?)中进行保藏,由于菌丝体处于-196?,其代谢降低到完全停止的状态。所以不需定期移植。从理论上讲，菌丝体可以无限期地存活。蘑菇菌种的液氮保种从1970年开始进行试验,至今已有20多年的历史,经过大量的试验证明液氮保种是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。随着方法的不断改良，现人介绍近年来应用的一种最简便的液氮保种方法。 (,)菌种制备 菌种在PDA培养基平板上于22-24?下培养10-15天,菌丝体充分生长后,用打孔器(直径2-4mm)打成小孔,或用接种针把菌丝培养物切成2×4mm 长方形小块。 (,)安瓿管的制备 把直径4-6mm 的聚乙烯塑料管(也可用饮料吸管)截成小段做成安瓿管。每节大约60mm长,一头用热合机封好。然后用牛皮纸包装进行121?下高压灭菌30分钟。 (,)保护剂 10%的甘油水溶液进行121?下高压灭菌30分钟可作为冷冻保护剂。用量为每安瓿上留有5-10mm的空间,用无菌注射器从管底注入,以防产生气泡。随后，且无菌接种针从安瓿管口放入5-8块菌种块，热合封好安瓿。 用记号笔在发瓿管外写上标签，最后在桌 上用一定的力按 压，以检查安瓿是否渗漏。 (,)液氮保藏 把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中(在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中)，盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后,把 按瓿管浸入液氮中进行长期保存。 (,)恢复培养 如果拟取用液氮保存的菌种，可将安瓿管取出后立即放入35-40?的温水中迅速解冻,为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,表面干燥后, 用火焰烧过的剪刀在安瓿的一端剪开,用无菌接种针把菌块移接至PDA培养基上,置22-24?培养。