丙烯酰胺生产菌株的基因工程改造策略-于慧敏

丙烯酰胺生产菌株的基因工程改造策略 于慧敏,沈忠耀 清华大学化工系生物化工研究所北京100084 Email: yuhm@tsinghua.edu.cn; szy-dce@tsinghua.edu.cn 美国和英国的研究人员在2006年1月出版的Science上发表文章称:工业生物技术是一种新的工业制造概念……并将成为一种新的制造技术典范[1]。采用以微生物酶或细胞为主体的工业生物技术生产大宗化学品和能源、材料、医药产品,已经成为全世界——尤其是我国解决资源、能源和环境危机的重要手段[2]。工业生物技术的核心是生物催化,生物催化的核心则是生物催化剂——酶,通常以固定化酶或含酶游离细胞、固定化细胞的形式应用。素有“百业助剂”之称的聚丙烯酰胺在石油、水处理、造纸等领域应用非常广阔,为此,其单体——丙烯酰胺的生物法生产工艺倍受关注[3]。该生物法工艺利用微生物腈水合酶催化水合丙烯腈生成丙烯酰胺。然而,现有的生物法工艺中仍然存在菌种(含腈水合酶)的热稳定性和产物/底物耐受性差、有副产物生成,从而能耗和成本高等问题。为此,本课题组将基因工程方法和化学工程技术有机地结合起来,提出了采用基因工程策略解决化学工程问题的新思路。在中空纤维膜反应器耦合游离细胞催化水合工艺基础上,提出并实施了一系列针对丙烯酰胺生产菌株的全局调控和基因工程改造策略。其中,最主要的有: (1)敲除生产菌株基因组中的主要副产物生成基因 腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶一起,构成了主要的腈代谢酶系,存在于丙烯酰胺生产菌株中。其中,酰胺酶可以将产物丙烯酰胺进一步水合生产丙烯酸副产物,腈水解酶则可以将原料丙烯腈直接水合生产丙烯酸。因此,在生物法生产丙烯酰胺的过程中,副产物积累问题一直困扰丙烯酰胺的生物法生产工艺。可行的解决措施包括:控制低温水合工艺(15℃左右)、分离纯化腈水合酶并采用酶法生产丙烯酰胺、采用不含酰胺酶和腈水解酶的新宿主重组表达腈水合酶以及采用基因同源重组策略敲除现有野生菌株中的酰胺酶基因,等等。清华大学化工系成功克隆了诺卡氏菌和红球菌中的腈水合酶和酰胺酶基因,实施并比较了游离酶水合、重组大肠杆菌水合以及红球菌中酰胺酶基因敲除突变株水合等策略,获得了优选的重组红球菌生产菌株。与野生菌株相比,突变株红色红球菌TH3的腈水合酶活性提高了25%,酰胺酶活性降低了60%。18℃连续水合6小时,丙烯酰胺累积量提高了23%,而副产物丙烯酸降低了85%。对酰胺酶基因敲除突变株的工业化性能评估表明,该菌株在10吨发酵罐中30-36h时的酶活水平可以达到1500-1700万工厂单位;最高使用批次可以达到9批,各批平均丙烯酰胺产物浓度为32.5%。 (2)采用转座子插入敲除和全局转录调控新方法,构建高耐受性生产菌株 转座子(transponson,Tn)是一种能够进行复制并将一个或多个拷贝插入到新位点的DNA序列单元。它能够随机插入到细菌染色体的许多位点上,使得插入位置的基因失活或突变。采用转座子对目标基因组进行随机敲除,构建基因敲除突变库,进一步对目标突变库进行高通量筛选,获得所需要的表型,是近来反 向代谢工程的研究热点之一。通过应用TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR)等方法,可以特异性地扩增含转座子IS序列的被敲除基因,从而鉴别或发现重要的代谢途径相关基因。本课题组已经成功建立了红球菌体系中转座子基因插入敲除的方法,以及抗生素-底物/产物浓度两步高通量筛选方法,并成功获得了底物耐受性显著提高的突变株。 传统的基因与代谢工程研究方法几乎完全依赖于单个目标基因、或多个独立目标基因的敲除与高表达策略,以及对特定转录因子或DNA结合模体的重组修饰。微生物的RNA聚合酶(RNAP)同时控制成百上千个功能基因的转录。面向RNA聚合酶实施突变的全局转录机器工程新方法可以改变RNAP对不同启动子的转录偏爱性,从而在强化某些目标基因转录的同时,抑制另一些非目标基因的转录,最终在全局转录水平上快速获得优选的目标表型。根据获得的目标表型,反过来即可获得实现该表型的基因型。在此基础上,进行新一轮的突变和筛选,即可进一步强化目标表型,包括细胞的产物耐受性、底物耐受性和热稳定性,以及合成目标产物的特性,等等。全局转录机器工程为重组细胞的改造提供了全新的思路和策略,使得快速、高效获得能够稳定遗传的全局最优目标表型成为可能。本课题组成功克隆了红色红球菌R. ruber TH3中编码RNA聚合酶σ70转录因子的sigA基因,对其进行了大规模随机突变,将基因突变库引入大肠杆菌-红球菌穿梭质粒,获得质粒突变库。进一步采用电穿孔转化法将质粒库转入红球菌宿主,获得了重组红球菌的菌株突变库。。在此基础上设计了高通量的致死初筛、两轮复筛的筛选;最终成功获得了底物丙烯腈耐受性明显得到改善的突变株AN10-9;产物丙烯酰胺耐受性明显得到改善的突变株AM8-16;丙烯腈和丙烯酰胺耦合耐受性得到明显改善的突变株M4N1-59。 (3)应用生物信息学辅助理性设计,改造腈水合酶的热/底物/产物耐受性。 课题组在研究中发现,菌株的突变和驯化可以在一定程度上强化细胞的耐受性和热稳定性;腈水合酶自身的三维结构稳定性则是决定丙烯酰胺生产菌株的催化性能的另一个关键要素。为此,课题组首先采用半经验的量子力学方法对腈水合酶的催化机制进行了解析;采用分子动力学方法对腈水合酶的热稳定性进行了分子模拟;通过对嗜热腈水合酶的热敏感区域搜索和盐桥分布、结构稳定性研究,提出了引入盐桥改造腈水合酶热稳定性的蛋白质工程策略。预期改造后的腈水合酶将可以实现在较高的水合温度下进行丙烯酰胺的水合生产,从而显著降低丙烯酰胺的生产能耗。 主要参考文献: 1.Ragauskas AJ, et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science, 2006, 311: 484-489. 2.张晓强等(国家发展和改革委员会高技术产业司,中国生物工程学会编写). 中国生物 产业发展报告2006. 化学工业出版社. 3.沈寅初,张国凡,韩健生.微生物法生产丙烯酰胺[J].工业微生物,1994,24(2): 24~32. 继续阅读