番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究

番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 文库 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 Zhejiang A&F University Dissertation for the Degree of Master The Screening and Safety Evaluation of the Fungicide Seed Coating Formula and Its Effects on Damping-off in Tomato Seedlings Candidate: HE Mei-wen Adviser: ZHU Zhu-jun, Professor Specialty: Horticultural Science Date of Submission: May 30th, 2014 Zhejiang A&F University Lin’an, zhejiang province, P.R.China May, 2014 万方数据 独独 创创 性性 声声 明明 本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果， 也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名: 日 期: 论文使用授权的说明论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、 使用学位论文的规定， 即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。? 不保密, 本学位论文属于不保密。 ? (请在方框内打“?” ) 学位论文作者亲笔签名: 日 期: 指导教师亲笔签名: 日 期: 万方数据 摘要 番茄(Solanum lycopersicone)是全世界最为普遍的果菜之一，在我国广泛栽培。猝摘要 I 倒病是番茄苗期重要病害，在世界范围内普遍发生，造成十分严重的经济损失。本文以‘合作 903’番茄种子为材料，研究了杀菌剂包衣处理对番茄种子活力和幼苗质量的影响，以及对苗期猝倒病的防控效果。主要内容和结果如下: 1、采用常规组织分离法分离了番茄猝倒病病原菌，经形态学观察、核糖体 DNA内转录间隔(ITS)区序列分析和致病力测定等鉴定，明确了引起本地番茄猝倒病的主要致病菌为瓜果腐霉菌。病原菌落在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上呈辐射状，菌丝透明无隔，分枝繁茂，藏卵器光滑，卵孢子不满器，符合瓜果腐霉菌的典型特征;病原菌核糖体 DNA-ITS 区序列与 GenBank 中瓜果腐霉的 ITS 区序列同源性均为 99%。 2、采用菌丝生长速率法测定了市场上广泛用于防治猝倒病的几种杀菌剂对瓜果腐霉菌的室内毒力， 筛选出精甲霜灵和吡唑醚菌酯用于包衣番茄种子防治瓜果腐霉菌引起的苗期猝倒病。 精甲霜灵和吡唑醚菌酯单剂对瓜果腐霉菌菌丝生长的半有效浓度(EC50)分别为 0.0003、3.4027 μg?mL-1，吡唑醚菌酯与精甲霜灵 1:1 复配制剂的 EC50值为 0.0002 μg?mL-1。 3、采用发芽试验、氧敏感(Q2)技术和基质土出苗试验检测了包衣种子的安全性，结果表明，0.6%精甲霜灵包衣处理提高了番茄种子的活力，促进番茄幼苗生长(P<0.05) ;低浓度吡唑醚菌酯包衣处理抑制了幼苗株高生长，促进幼茎增粗，表现出一定的壮苗效应;精甲霜灵与吡唑醚菌酯 1:1 复配包衣处理总体上抑制了番茄幼苗生长。 4、采用人工接种病原菌方法，研究了包衣种子对瓜果腐霉菌引起的苗期猝倒病的防控效果。人工接种致病菌情况下，不包衣种子(CK)出苗率为 36%、发病率为42.6%、 成苗率为20.7%， 0.6%精甲霜灵包衣处理组幼苗出苗率为88%、 发病率为2.3%、成苗率为 86%，与 CK 相比均达到极显著性差异水平(P<0.01) 。吡唑醚菌酯包衣处理组成苗率均低于 80%，防病保苗效果较差。 关键词关键词:番茄，种子包衣，猝倒病，杀菌剂。 万方数据 文库 文库 ABSTRACT II ABSTRACT Tomato (Solanum lycopersicone) is one of the most popular vegetables in the world, widely cultivated in our country. Seedling damping-off is a serious and worldwide disease in tomato, causing severe damage every year. In this paper, with seeds of a tomato cultivar ‘Hezuo 903’, we investigated the effect of fungicides coating treatment on seed vigor, seedling quality and the control of seedling damping-off disease. The main contents and results were as follows: 1. The pathogen of tomato seedling damping-off was isolated through general tissue separation. It was identified as Pythium aphanidermatum by morphological observation, polymerase chain reaction (PCR) of ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) regions as well as pathogenicity test. This pathogen exhibiting radiate colonial morphology on potato dextrose agar (PDA) medium, had hyaline, nonseptate and branched hyphae, smooth archegonium and aplerotic oospore, which are accorded as the typical characteristics of Pythium aphanidermatum. The sequence of its ITS region was 99% homology with that of Pythium aphanidermatum accessed in GenBank. 2. The laboratory toxicities of several fungicides widely used in controlling damping-off disease were tested with the method of mycelial growth rate. Mefenoxam and pyraclostrobin were screened out for seed coating to control seedling damping-off caused by Pythium aphanidermatume. Effective concentration reducing mycelial growth to 50% (EC50) of mefenoxam and pyraclostrobin to Pythium aphanidermatum was 0.0003 and 3.4027 μg?mL-1 respectively. When combined these two fungicides at 1:1 ratio EC50 reduced to 0.0002 μg?mL-1. 3.The safety of coating seeds was evaluated by the Q2 oxygen sensing technology, paper bed germination test, and the pot germination experiment. Film coating with 0.6% mefenoxam significantly increased seed vigor and promoted seedling growth(P<0.05). Seed coating with low concentration pyraclostrobin inhibited seedling height while promoted stem diameter, which showed a slight effect for cultivating strong seedling. As a whole, seed coating with a combination of mefenoxam and pyraclostrobin at 1:1 ratio 万方数据 ABSTRACT III inhibited seedling growth. 4. The control effect on seedling damping-off disease caused by Pythium aphanidermatum was studied through an artificial inoculation test. In the artificial inoculation condition, the average emergence rate, incidence percentage of seedling damping-off disease and seedling rate for mefenoxam 0.6%, were 88%, 2.3% and 86.0%, respectively; which had reached an extremely remarkable level(P<0.01) compared with untreated control 36%, 42.6% and 20.7%. The seedling rates for pyraclostrobin 0.1%, 0.2% and 0.4% were all below 80%, which meant unsatisfactory effect for controlling damping-off disease and keeping seedlings. Key words: Tomato, Seed coating, Damping-off, Fungicide. 万方数据 目录 IV 目目 录录 摘 要 ................................................................... I ABSTRACT .............................................................. II 引 言 ................................................................... 1 1 文献综 述 ............................................................. 2 1.1 番茄猝倒 病 ...................................................... 2 1.2 种子包衣技 术 .................................................... 3 1.2.1 种子包衣技术研究进 展 ....................................... 3 1.2.2 种衣剂组成、类型及功 效 ..................................... 5 1.2.3 种子包衣技术面临的问及对策分 析 .......................... 7 1.3 我国蔬菜作物种子包衣研究概 文库 文库 况 .................................... 8 1.3.1 瓜类蔬菜种子包衣 .......................................... 8 1.3.2 豆类蔬菜种子包衣 .......................................... 9 1.3.3 茄果类蔬菜种子包衣 ........................................ 9 1.3.4 根菜类和叶菜类种子包衣 ................................... 10 1.4 选题依据、目的及内容 ........................................... 10 2 番茄猝倒病致病菌的分离鉴定 .......................................... 12 2.1 材料与方法 ..................................................... 12 2.1.1 试验材料 .................................................. 12 2.1.2 试验方法 .................................................. 12 2.2 结果与分析 ..................................................... 14 2.2.1 病原菌形态特征 ............................................ 14 2.2.2 病原菌的致病性 ............................................ 15 2.2.3 病原菌核糖体 DNA-ITS 区 .................................... 16 2.3 讨论 ........................................................... 16 3 杀菌剂毒力分析及番茄种子包衣配方筛选 ................................ 18 3.1 材料与方法 ..................................................... 18 3.1.1 试验材料 .................................................. 18 3.1.2 试验方法 .................................................. 18 3.2 结果与分析 ..................................................... 20 3.2.1 杀菌剂毒力测定与分析 ...................................... 20 3.2.2 包衣种子效果评价 .......................................... 21 3.3 讨论 ........................................................... 22 4 包衣番茄种子安全性检测 .............................................. 24 4.1 材料与方法 ..................................................... 27 4.1.1 试验材料 .................................................. 27 4.1.2 试验方法 .................................................. 27 4.2 结果与分析 ..................................................... 29 4.2.1 包衣处理对番茄种子发芽率、发芽势及籽苗质量的影响 .......... 29 4.2.2 基础配方包衣对番茄种子活力的影响 .......................... 31 4.2.3 杀菌剂包衣对番茄种子活力的影响 ............................ 32 4.2.4 包衣处理对番茄种子出苗率及幼苗生长的影响 .................. 35 万方数据 目录 V 4.3 讨论 ........................................................... 41 5 杀菌剂包衣种子对番茄苗期猝倒病的防治效果 ............................ 42 5.1 材料与方法 ..................................................... 42 5.1.1 试验材料 .................................................. 42 5.1.2 试验方法 .................................................. 42 5.2 结果与分析 ..................................................... 43 5.2.1 杀菌剂包衣对基质接种病菌情况下番茄出苗率的影响 ........... 43 5.2.2 杀菌剂包衣对基质接种病菌情况下番茄病苗率的影响 ........... 45 5.2.3 杀菌剂包衣对基质接种病菌情况下番茄成苗率的影响 ........... 47 5.3 讨论 ........................................................... 47 6 全文结论 ............................................................ 49 参考文献 .............................................................. 50 作者简介 .............................................................. 55 致 谢 ................................................................. 56 万方数文库 文库 据 引言 1 引言 种子包衣技术是由传统种子处理技术如浸种、 拌种技术演化发展而来的新型种子加工技术，它结合了种子精选、植物保护、农药肥料等多种学科，具体是指在种子表面包裹一层厚度均匀的薄膜或壳状厚膜形成种衣剂，依靠种衣剂各成分发挥不同功效。目前国内外市场上种衣剂产品多种多样，涉及作物种类从最初的小麦、棉花、大豆、玉米、水稻到各类蔬菜、中草药、林木等，功能类型也从最初单一的农药化肥型向多功能复合型发展。种子包衣技术作为近年来农业部重点推广的高新科技成果，凭借种衣剂含药毒性低、用量少及效益高等优点，为我国建设资源节约型和环境友好型社会作出了重大贡献。但目前我国种衣剂产量远远不足以满足生产需要，其中尤以蔬菜作物、药材及林木类种子包衣技术的研究和推广应用更为迫切，国家应加大种子加工产业的扶持力度和资金投入，提高种子包衣率，完善包衣种子质量监督体系，促成种子包衣技术在整个农业生产中的推广及应用，推进我国现代化农业建设。 21 世纪以来，随着设施农业在我国的迅猛发展，设施栽培在实现蔬菜周年供应中的重要作用毋庸置疑。然而，设施内环境的高温高湿条件同时也导致了蔬菜病虫害的大量发生，尤其是一些土传或种传病害的猖獗，给设施农业生产者造成了严重的经济损失，极大地制约了我国设施蔬菜的可持续发展。现阶段如何采取简单有效的技术措施，在苗期控制病害的发生及蔓延，减少农业生产者的经济损失，已经成为各地设施蔬菜生产发展中亟待解决的问题。 基于我国种子包衣技术现阶段的发展特点， 为了早日解决好蔬菜生产发展中存在的实际问题，本论文以番茄为研究对象，对番茄种子包衣处理防治苗期猝倒病相关技术开展了初步研究，以期探索出适用于番茄生产、对 4 个部分: 1、 分离鉴定本地苗期病害有较好防治效果的种子包衣技术。 本文主要研究内容分为 番茄猝倒病致病菌; 2、筛选对番茄猝倒病致病菌具有较强毒力的杀菌剂，制成含药种衣剂并包衣番茄种子;3、检测包衣种子安全性，测定包衣种子的发芽率、活力和出苗率，考察幼苗质量。4、采用人工接种病原菌的方法，对包衣番茄种子进行抗病试验，筛选出对番茄苗期猝倒病有较好防治效果的种子包衣配方。 万方数据 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 2 1 文献综述 番茄(Solanum lycopersicone)别名西红柿、洋柿子、番柿等，属茄科番茄属一年生或多年生草本植物，喜温暖，怕寒冷，不耐热。据考古学的发现，番茄的驯化地是墨西哥和中美地区，到 16 世纪番茄才作为观赏植物传入欧洲，到 17 世纪逐渐为人们食用，并被大面积栽培。番茄传入中国的时间，明朝王象晋在《群芳谱》 (1621)中有“火伞火球” 、 “最堪观”的关于番柿的记载，说明当时番茄已传入中国，而且也是作为观赏植物[1]。番茄营养价值高，鲜食口感好，据测定，番茄中含有糖类3.0%~5.5%、有机酸 0.15%~0.75%、蛋白质 0.7%~1.3%、维生素、胡萝卜素以及丰富的磷、钙等，其中维生素 C 含量相当于苹果含量的 2.5 倍，西瓜含量的 10 倍[2]。番茄也能加工成果汁、果酱、果泥、罐头等，市场需求大，发展前景广。此外，番茄具有适应性广、栽培容易、供应期长等优点，虽然栽培历史不长，但发展迅速。1961年我国番茄种植面积为 30 万 hm2，产量为 483 万 t，到 2005 年我国番茄种植面积为145 万 hm2， 产量为 3164 万 t， 番茄种植面积和产量分别比 1961 年增长 3.83 倍和 5.55倍。我国加工番茄种植和加工主要分布在新疆、内蒙古和甘肃，其中新疆种植面积占到全国的 80%以上，2009 年新疆加工番茄种植面积达到历史最高值 7500 hm2，内蒙古种植面积约为 2000 hm2，甘肃种植面积为 650 hm2[3]。 1.1 番茄猝倒病 猝倒病俗称“倒苗” 、 “卡脖子”和“小脚瘟” ，多发生在苗床，是一种土传真菌引起的世界性病害，主要由瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum) 、德里腐霉(Pythium debaryanum) 、终极腐霉(Pythium ultimum)侵染所致，刺腐霉(Pythium spinosum)、疫霉属(Phytophthora infestans)及丝核菌属(Rhizoctonia spp.)的一些种也能引发此病[4-5]。猝倒病病原菌主要以卵孢子在土壤或植物残体中越冬，条件适宜时卵孢子萌发产生游动孢子侵染寄主，或直接萌发产生芽管侵入寄主;也有以菌丝体在土壤中的病残体上越冬的类型，第二年春季菌丝生长产生孢子囊，随后产生游动孢子侵入寄主植株。病原菌借灌溉水、文库 文库 雨水、农具和农事操作者传播。猝倒病的病原菌生长适温为15 ?左右，适宜发病土温为 10 ?左右，所以早春苗床温度低、光照弱、湿度大，极易导致猝倒病的发生和蔓延，猝倒病一旦扩散，常常造成成片死苗。此外，苗床播种过密、间苗或分苗不及时、土壤贫瘠、浇水过多等均易造成猝倒病的流行。据研究，我国番茄苗期猝倒病的发病率和严重度呈现逐年增加的趋势， 引起苗期猝倒病的主要病原菌因地区而异[6]。据报道北方蔬菜上引起猝倒病的病原菌主要是由鞭毛菌亚门真菌的瓜果腐霉菌， 辣椒疫霉以及烟草疫霉等引起[7-8]。 秦大宗[9]报道西南地区引起番茄猝倒病的主要病原菌为终极腐霉， 王汉荣[10]调查了浙江省无土栽培系统内果菜类病害万方数据 1 文献综述 3 发生种类，发现引起番茄等茄科蔬菜的病原菌是瓜果腐霉菌。 土传病害病原体生活在土壤中， 条件适宜时引起发病， 一旦扩散将导致成片死亡。近年来，随着保护地栽培和集约化生产的快速发展，土传病害的发生也越来越严重，而对于土传病害的防治，没有任何一种单一的防治措施能取得良好的效果。生产上应综合农业防治、生物防治和化学防治等多种手段防控土传病害，其中，化学防治使用时期灵活、操作方便，效果最为显著。猝倒病是蔬菜生产中一类重要土传病害，目前常用的防治方法有:播前进行土壤消毒、药剂拌种或浸种，加强苗床管理，采用生物拮抗制剂，选用抗病品种等。陈文瑞[11]用麦麸,砂子培养哈茨木霉，其防治温床番茄猝倒病的效果优于敌克松，与五氯硝基苯效果不相上下。近年来，国外对生物防治方法较为重视，报道较多[12-14]。 1.2 种子包衣技术 种子包衣技术是由传统种子处理技术如浸种、 拌种技术演化发展而来的新型种子加工技术，它结合了种子精选、植物保护、农药肥料等多种学科[15]，具体是指在种子表面包裹一层厚度均匀的薄膜或壳状厚膜形成种衣剂， 依靠种衣剂各成分发挥不同功效。种衣剂由两部分组成，即农用活性成分和非活性成分。农用活性成分包括植物生长调节剂、农药、肥料、微生物等，在种衣剂使用过程中发挥着主要作用;非活性成分包括成膜剂、着色剂、分散剂、乳化剂、稳定剂等，在种衣剂形成及使用过程中起辅助作用。种衣剂以薄膜或厚壳的形式包裹于农作物种子表面，本身用药少，对环境和植物毒性低，且能保证较高的效益[16-17]。我国农业部自“九五”期间就把种子包衣技术列为重点发展项目，提出全国各地要重视良种精选和种子包衣，逐步实现社会统一供种。 “九五”之前，种子包衣技术的推广面积只占种植面积的 23.5%， “九五”期间，种子包衣技术取得了显著的经济效益和社会效益，全国总计推广种衣剂面积 1.2 hm2，粮食增产 40 万 t，极大地加深了农业生产者对种子包衣技术的了解，扩大了种衣剂的接受面和受益群。 然而， 种子包衣技术在我国的发展并未达到十分喜人的程度，据农业部报道，“十五”、“十一五”期间，我国种衣剂的推广应用面积呈现下降趋势，近几年种衣剂总计应用面积不达 150 万 hm2[18]。我国应加快推广种子包衣技术的步伐，生产更多高质量的农作物种子，推动种子加工产业的快速发展。 1.2.1 种子包衣技术研究进展 1.2.1.1 国内种子包衣技术研究进展 早在西汉年间我国就有关于种子处理的相关记载[18]， “种子包衣”的概念是随着种子处理技术的发展而逐渐形成的。虽然我国古代劳动人民很早就有种子包衣的实践，但种子包衣技术真正意义上的研究是从 20 世纪 70 年代末才逐步开始的。1976万方数据 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 4 年，甜菜糖业研究所最早报道了对甜菜种子包衣处理的研究;1981 年，中国农业科学院土壤与肥料研究所成功地研制出适用于牧草种子的丸粒化包衣技术[19]。 在我国种子包衣技术早期发展中最值得关注的， 当属原北京农业大学李金玉教授及其团队的种子包衣研究。1983 年，李金玉教授借鉴国外先进种子包衣技术，开展了一系列探索与实践性研究，涉及种衣剂产品配方筛选、种衣剂制造工艺及应用效果，研制出了用于防治如棉花、大豆、玉米、水稻、花生、西瓜等多种作物病虫害的复配型种衣剂，以及系列药肥种衣剂产品[20-22]。1991 年，天津北方种衣剂中试厂研制的种衣剂取得第一个农药登记证[23]，随后我国种衣剂产品逐步进入商品化、规范化、化发展阶段，并在全国范围内大面积推广应用。据相关资料统计，1994 年至 1995 年间，我国种衣剂产品推广面积总计达到 800 万 hm2，其中玉米种衣剂推广应用面积最大，约为446 万 hm2，其次为棉花种衣剂，约为 167 万 hm2，小麦和大豆种衣剂分列第三、第四，推广应用面积分别为 73 万 hm2和 60 万 hm2[24]。1995 年之后，随着我国“种子工程”的实施，中央财政资金、地方各级财政资金和信贷资金的大量投入，以及种衣剂推广应用使农作物增产文库 文库 明显收获的认可，推动种衣剂产业进入高速发展阶段。1998年种衣剂产量在 1.2 万 t 以上，推广面积在 2500 万 hm2以上;1999 年生产量在 1.5万 t 以上，推广面积在 3250 万 hm2以上;2000 年生产量约 1.8 万 t，推广面积 3800万 hm2;2001 年生产量已达 2 万 t，推广应用面积近 4000 万 hm2[25]。据农业部统计资料介绍，2005 年我国获准登记且仍在有效使用期限内的种衣剂产品共有 299 个，玉米种衣剂产品为 117 个，约占到总登记数的一半，蔬菜类种衣剂产品研发相对较晚，仅有甜菜、油菜、豇豆有 1~3 个种衣剂登记产品[25]。2011 年，种子包衣技术在我国各地多种作物如玉米、小麦、棉花、水稻等上得到了大面积推广应用，我国已研制出了几十余种适用于多种作物种子的固定配方种衣剂产品，建成 50 多家具有一定规模的种衣剂厂[18]。我国种子包衣技术研究起步晚，发展较快，但种衣剂产品的总量还远远不能满足我国现阶段的生产需要， 种子包衣量不到种子生产总量的 10%， 蔬菜作物、中药材及林木类种子的包衣技术研究及推广应用极为迫切[26]。 1.2.1.2 国外种子包衣技术研究进展 国外种子处理技术的发展已有数百年，其发展速度之快、加工工艺之精湛，推广应用面积之广，是我国现阶段所不能企及的。19 世纪 60 年代，美国的 Blessing 采用面糊包衣粒径较小的棉花种子，使其体积均匀增大，利于人工或机械播种。1926 年，美国的Thornton 和Ganulee首先提出种子包衣问题。 20世纪30年代， 英国的Germains公司首先研制出种子包衣剂，并成功用于谷物类种子[27]。20 世纪 50 年代，种子包衣技术随着农药工业即各类杀菌剂和杀虫剂的快速发展，而呈现出惊人的飞跃，大量农药型种衣剂商业化并推广应用，给农业生产者带来了显著的经济效益。1984 年，日本住友化学株式会社开始蔬菜工厂化包衣试验， 并将包衣莴苣种子作为蔬菜丸化包衣万方数据 1 文献综述 5 技术的代表投入农业生产， 此举动开启了蔬菜作物包衣技术的普及、 推广和应用阶 80 年代，国外种子包衣技术已经进入成熟发展阶段。随着种子包衣机械设备的更新与段。20 世纪 完善， 目前国外农业发达地区的种子包衣技术普及和应用都达到了较高的程度，包衣作物涵盖了禾谷类、蔬菜、花卉、药材及林木类等粮食作物和经济作物。种衣剂的功效也从最初利于机械播种的简单型，发展到兼具防治病虫害、促进植物生长和提高作物抗逆性等多种功能的复合型[28]。 种子包衣技术作为种子生产业中一种重要的加工工艺，为全球农业生产做出了巨大贡献，带动了整个行业的快速发展，也将在未来的发展道路上得到更多国家的重视。 1.2.2 种衣剂组成、类型及功效 种衣剂具有提高种子活力和促进植物生长[27,29-30]， 提高种苗对逆境胁迫的耐受能力[31-33]，防治苗期病虫害和提高产量[34-37]等优点。对于种衣剂的作用机理，目前比较认同的是，农作物种子经包衣处理后，种衣可包被超过 90%的种子表面，包衣种子播种后，种衣成分随着种子吸水而分散在种子外围，形成保护圈，抵抗土壤环境中病菌和虫害的入侵。包衣种子突破种皮长出胚芽后，胚根生长加快，种衣剂中的农用活性组分被根部吸收，在幼苗体内传导，发挥药效[27,32,37]。不同类型的种衣剂功效不同，作用机理也不一样，在研究种衣剂的作用机理之前，首先应该了解种衣剂的组成、类型及各类种衣剂的主要功能。 1.2.2.1 种衣剂组成 种衣剂由农用活性成分和非活性成分组成。活性成分包括杀虫剂、杀菌剂、常量或微量元素肥料、人工合成植物生长调节剂和有益微生物等，不同活性成分发挥的功效不同，因此，在活性组分无交互抗性的前提下，多种活性组分复配可以制成复合型多功能种衣剂。目前，可供种衣剂配制选择的农药种类很多，但仍以杀虫剂和杀菌剂两大类为主，常用的有百菌清、敌克松、福美双、甲霜灵、噁霉灵、五氯硝基苯、甲基立枯磷等; 可供选择的肥料也越来越多， 通常根据作物生长及土壤肥力情况来选择，常用的常量肥料有尿素和磷酸二氢钾，微量肥料多用硼肥、钼肥、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰等。 种衣剂中的植物生长调节剂主要起到调节种子发芽， 改善苗期质量的作用，常用到的有萘乙酸(NAA) 、生长素(IAA) 、赤霉素(GA3) 、玉米素(ZT) 、激动素(KT) 、脱落酸(ABA)和乙烯利等[38]。有益微生物如固氮菌、根瘤菌、芽孢杆菌、木霉菌等在种衣剂中的应用不仅促进了作物健康生长，还避免了农药对作物生长、土壤环境和人体的危害， 目前这类以微生物为活性成分的生物型种衣剂的研究和开发已经得到许多国家和地区的重视。 除了农用活性成分外，种衣剂的制成少不了非活性成分的辅助作用。非活性成分主要包括成膜剂、着色剂、分散剂、乳化剂、稳定剂等，其中以成膜剂最为关键，性能良好的成膜剂能使种衣剂迅速成膜包被种子，并具有一定的牢固性。研究人员采用万方数据 文库 文库 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 6 天然物质壳聚糖[39-40]作为成膜剂，取得了较好的包衣效果，还有用如淀粉、木质素、腐殖酸、羧甲基纤维素钠等。配套助剂中分散剂、稳定剂和乳化剂都是维持整个种衣剂胶体系统的关键组分， 分散剂配合稳定剂促进种衣剂中的其它助剂和活性成分稳定地分散至整个系统，乳化剂促进不同粘度组分融合。此外，种衣剂中非活性组分还有颜料、防腐剂、防冻剂等[38]。 1.2.2.2 种衣剂类型 种衣剂的分类没有指定的，随着种衣剂产品的多样化发展，种衣剂的分类方法层出不穷。例如，禾谷类种衣剂中按作物适用类型可分为旱田型种衣剂和水田型种衣剂。目前种衣剂常用的分类方法有两种:按组成分类和按用途分类，前者在市场上较为通用，后者则更符合生产者的意愿。按用途分类划分，可将种衣剂分为五大类:物理型种衣剂、化学型种衣剂、生物型种衣剂、特异性种衣剂和综合型种衣剂[38]。 物理型种衣剂是发展最早的种衣剂，其最初目的只是为了便于播种，所以这类种衣剂主要成分是填充材料和粘合剂，其适用作物一般是粒径较小(通常指千粒重在10 g 以下的种子)的蔬菜、花卉或牧草等，一方面使种子体积增大，防止灌溉流失，另一方面使种子形状统一规整，便于机械播种[27,41]。 化学型种衣剂又可分为单一型和复合型。 单一农药型种衣剂是最常用且针对性较强的一类种衣剂，这类种衣剂的活性成分通常是某些杀虫剂、杀菌剂、除草剂，有效期至少在一个月以上，可保证种子出苗后药剂仍发挥作用。复合型化学种衣剂是指含有如杀菌剂、植物生长调节剂、微量元素肥料等多种化学成分的种衣剂，该类种衣剂由于复合成分多，功能较为全面，一般兼备促进作物生长和防治病虫害的功效，复合型种衣剂适应性广，已经成为目前种衣剂的主流。 生物型种衣剂是研究人员利用生物菌类之间的拮抗作用原理， 通过添加有益生物菌或其分泌物作为活性成分研制成的种衣剂。 生物型种衣剂中的有益微生物或其分泌物[42]通过抑制有害病菌入侵和生长实现防病目的， 避免了化学农药引起的土壤、 6 个国家注册登记环境、农产品等一系列污染问题。据报道，木霉属真菌类生物制剂世界上至少有 [24]，我国浙江省种子公司开发的根菌类生物型种衣剂在油菜、棉花、水稻等一些作物上已经得到了推广作用[43]。 为了解决生物种衣剂的单一作用问题， 人们已将孢子悬浮液或干粉与真菌拮抗剂一起用于种子包衣[44]。 生物型种衣剂安全性高， 且利于环保事业，近几年越来越多的国家将种衣剂的研究重点从化学型转向生物型。 特异型种衣剂是指添加某些特殊化合物制成的种衣剂， 这类种衣剂通常用于特定或特殊的目的，如:抗低温、蓄水抗旱、抗酸碱等。研究者用抗冻剂包衣处理玉米种子，提高了玉米种子抵抗低温的能力;用吸水性强的高分子聚合物制成种衣剂，增强了包衣种子的抗旱性; 用石灰处理生长于酸性土壤中的牧草种子， 促进了牧草的生长，增加了牧草的总产量[30]。 万方数据 1 文献综述 7 综合型种衣剂是目前国内外种衣剂的主要发展方向之一，是物理型、化学型、生物型、特异型四类种衣剂的综合应用型。 1.2.2.3 种衣剂的功效 种子包衣技术的快速发展与种衣剂所具有的功能密不可分， 而种衣剂的功能又与其组分紧密相连。经过包衣丸化处理的种子，便于机械播种，播种用种量一般可减少1/3~1/5，播种后 40 d~50 d 不需喷施农药，节约劳动力，降低生产成本[27]。以化学农药为主要成分的种衣剂主要功效是防治作物苗期病虫害，促进作物幼苗生长，防治效果依药剂不同表现出一定的差异。以有益微生物为主要成分的生物型种衣剂，在应用初期往往能收获明显的防治效果，但随着使用时间的推移，生物型种衣剂中的有益微生物失活或与针对的有害微生物之间的拮抗作用减弱，加之该类种衣剂不含农药，其防治效果可能会显著降低。 1.2.3 种子包衣技术面临的问题及对策分析 我国自推广种子包衣技术以来，已有 30 多年的发展经历，目前种衣剂的应用范围越来越广，但是由于我国农业发展的复杂性，种子包衣技术的健康发展仍面临诸多困难，与国外发达国家发展水平相距甚远，还有许多亟待解决的问题。 1.2.3.1 种子包衣技术面临的问题 我国种子包衣技术发展到今天，虽然取得了不少显著的成效，但仍面临着许多突出的问题，现将这些问题和困难概括为以下五点[16-18,,45]。 第一，种衣剂产品结构不合理，发展不平衡，类型较为单一，新型种衣剂产品开发数目少。第二，种子包衣技术不高，设施设备落后，没有完善的规范化、制度化生产管理体系，种衣剂产品总体质量不高，存在分层、沉淀和包衣不牢固等现象，种衣剂产品安全性较差。第三，种衣剂的作用机理研究不够深入，种衣剂配方中各组分的作用及有效性缺乏科学理论依据，往文库 文库 往导致盲目包衣，花费成本高，收获效益低。第四，包衣种子贮藏技术有待跟进，包衣种子使用有效期短、失效快。第五，国家宏观调控方面，与种子包衣相关的法律法规较少，由于缺少专门的管理规章制度，种衣剂质量问题时有发生。 1.2.3.2 对策分析 作为农业大国，我国应该致力于生产规范化、高质量的种衣剂，应该加快推广、普及种子包衣技术，应该努力实现禾谷类、蔬菜类、花卉、林木等多种粮食作物和经济作物种子的统一包衣，为种子产业发展清除障碍，推动现代化农业建设大业阔步向前。具体分析我国现阶段种子包衣技术面临的问题，相应的对策可概括为以下四点。 首先，针对我国种衣剂产品结构不合理的问题，我国应该在保证禾谷类粮食作物万方数据 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 8 种衣剂总量的前提下，扩大对蔬菜、花卉、中药材、林木类等经济作物种衣剂的研究及推广应用。其次，积极引进国外先进包衣设备，鼓励自主开发高水平种子加工工艺技术，提高我国种衣剂的整体质量及市场竞争力。再次，开发新型特殊功能种衣剂，如开发适用于干旱地区的保水抗旱型种衣剂，开发某种病虫害专用型种衣剂，高效防治作物苗期病虫害。 最后， 宏观调控上， 国家相关部门应加大对种子包衣技术的宣传，制定种衣剂生产管理相关法律法规，完善种衣剂产品质量监督体系。 1.3 我国蔬菜作物种子包衣研究概况 蔬菜是人们生活不可缺少的重要食品，蔬菜产业关系国计民生，是现代农业的重要组成部分。种子包衣技术应用在大田作物上取得显著成效后，国内外研究者便将这项技术延伸至蔬菜种子。国外蔬菜种子包衣以丸粒化包衣为主，经过 70 年的发展，部分小粒蔬菜种子如甜菜和莴苣基本实现丸粒化。 我国种子包衣技术在大宗农作物种子领域取得明显效益后，蔬菜种子包衣的研究应用也陆续取得成功。 1.3.1 瓜类蔬菜种子包衣 在各类蔬菜作物中，瓜类种衣剂研究最早，相应的技术运用也最为成熟。1992年，李金玉教授研制的药肥复合型种衣剂 9 号和 10 号[22]对西瓜连作死苗具有显著防效，经包衣处理后，西瓜苗期生长表现好，产瓜多。吴学宏等[46]运用有效成分为咯菌腈的 2.5%适乐时悬浮种衣剂包衣处理西瓜种子，对西瓜种子发芽率、幼苗的子叶宽度、侧根数和百株鲜重无显著影响，幼苗子叶长度和株高分别增加 4.8%和 7.5%，植株体内丙二醛的积累下降了 7.7%，可溶性蛋白含量增加了 2.2%;过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸的含量分别较对照提高了 62.9%、46.5%、35.6%和44.1%，与不包衣对照相比差异显著。孟焕文等[47]比较了放线菌剂和种衣剂对西瓜苗期土传病害的防治效果，放线菌剂拌土处理防效高于种衣剂包衣处理，前者处理西瓜幼苗长势较好，但操作工序不如种衣剂包衣处理简单方便。除了西瓜之外，黄瓜种衣剂的研究也开展得较早、较多。1998 年，原西北农业大学研制的“黄瓜种衣剂 1 号”提高了种子的抗冷能力和发芽率，促进了黄瓜幼苗的生长，同时对苗期枯萎病的防效高达 77.8%[48]。以天然物质壳聚糖[49-50]包衣处理黄瓜种子的试验研究表明，适量的天然物质包衣黄瓜种子对种子的发芽力无不良影响， 对黄瓜幼苗生长具有一定的促进作用。杨文清等[51]用赤霉素作为激素添加剂包衣黄瓜种子，结果表明，赤霉素包衣处理对黄瓜种子的发芽能力无不良影响，促进了黄瓜幼苗下胚轴的伸长生长，子叶干重显著提高。近年来出现不少使用杀菌剂[52-53]、杀虫剂[54]包衣黄瓜种子的报道，但应用效果并不是十分理想，可见农药型种衣剂还需进一步研究和改善。2010 年，曾德芳和吴珊[55]研究报道的环保型黄瓜种衣剂以天然高分子多糖为主要原料， 添加微量元素肥料和生物抑菌剂，经过包衣试验表明，环保型种衣剂不仅安全无污染，而且具有明显万方数据 1 文献综述 9 的经济效益。 1.3.2 豆类蔬菜种子包衣 豆类蔬菜种衣剂研究方面， 1993 年徐跃进等[56]用北农种衣剂 6 号和 10 号包衣豇豆种子，试验结果表明，两种种衣剂均能促进豇豆种子发芽和幼苗生长，对苗期病虫害有较理想的防治效果，但不同种衣剂在不同豇豆品种上的防病保苗效果存在差异。2000 年，江汉大学农学系联合武汉市蔬菜种子公司，用 11 种种衣剂包衣 6 种蔬菜种子，其中豇豆种子在用 1.0%~1.2% NAD 种衣剂处理时，成衣效果好，可促进种子萌发，提高幼苗素质[57]。2001 年，运光荣等[58]用氨化木质素辅助丸粒化种子包衣剂，该种衣剂丸化包衣豇豆后，促进了豇豆幼苗的生长，相比不包衣处理，产量提高了40.0%。2002 年,李爱萍等[59]用分别含有克灵福和克灵啉的种衣剂包衣蚕豆种子，研究了两种药剂对蚕豆苗期虫害的防效， 同时探索了药剂包衣蚕豆种子时较为理想的药种比以及包衣种子的贮藏技术，试验结果表明,以 1:100 药种比包衣中粒型蚕豆，文库 文库 包衣效果较佳;包衣蚕豆种子小包装密封贮藏 9 个月，仍可保持较高的发芽率;克灵福包衣处理蚕豆种子对苗期蚜虫具有显著的防治效果，包衣蚕豆种子播种 45 d 后对蚜虫的防效依然可以达到 100%。陈小央[60]用根瘤菌包衣蚕豆种子，大田试验中增产4.96%~7.50%。 1.3.3 茄果类蔬菜种子包衣 茄果类蔬菜种衣剂研究方面，1997 年原西北农业大学园艺系孟焕文等[61]用自主研制的“茄种衣剂 1 号”包衣自繁的“二民茄子” ，缩短了种子的发芽天数，提高了茄子的发芽力，促进了茄子幼苗的生长。2002 年，西南农业大学园艺系刘朝贵等[62]探索了海藻酸钠复合琼脂作为包衣材料的成膜特性， 同时研究发现百菌清包衣处理对辣椒和茄子苗期病害具有明显的防效。 李明等[63]用含有生物型杀菌剂和植物生长激素的种衣剂包衣辣椒种子，对包衣种子的发芽率、成苗数无显著影响，促进了辣椒幼苗的生长，提高了辣椒苗的根系活力及过氧化物酶含量。2004 年，李海燕等[64]报道的2%甲霜灵种衣剂对辣椒疫病防治效果达到 98%，30 d 后防效降低。熊海蓉等[65]测定了辣椒种衣剂 XFY-2 的 PH 值、粘度、成膜性、成膜时间、包衣均匀度、包衣脱落率等理化指标，用该种衣剂包衣辣椒种子，并与进口种衣剂 SLS 进行比较，试验结果表明辣椒种衣剂 XFY-2 理化性质良好，能有效促进种子萌发，提高发芽率和成苗率，其综合效果优于进口种衣剂 SLS。 番茄种子包衣技术研究应用方面， 1991 年， 晏晖[66]利用赤霉素对脱刺毛番茄进行包衣试验，发现赤霉素浓度为 0.3 g?L-1时，包衣处理番茄种子对番茄种子的活力和幼苗生长素质有促进作用。2005 年，方新等[67]复合多种有益微生物制成复合型生物种衣剂包衣番茄种子， 发现该生物种衣剂能帮助番茄快速吸收土壤养分，平均增产达 28.10%。 万方数据 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 10 1.3.4 根菜类和叶菜类种子包衣 1996 年，我国研究者采用种子包衣的方法防治萝卜跳甲取得了显著效果，2000年， 陈禅友等[57]报道的 “津蔬衣号” 包衣剂用于萝卜种子包衣， 当药种比为 1/12.5~1/15时，包衣种子着色均匀，且可以提高萝卜种子的发芽力。同年，山西省农业科学院蔬菜研究所的李明[68]采用多种方法测试了包衣萝卜、白菜、甘蓝种子的活力，试验结果表明，该蔬菜研究所自主研制的种衣剂对包衣种子发芽力无不良影响，包衣蔬菜作物出苗整齐。陈群航等[69]通过对蕹菜种子进行包衣试验表明，生物型种衣剂 ZBS-WC提高了春播蕹菜对冷害和苗期猝倒病的抗性，若添加适量的 25%甲霜灵 WP，不仅能显著防治苗期猝倒病和白锈病， 而且能提高蕹菜的产量。 李明等[70]采用厚膜包衣技术处理甘蓝和青花菜种子， 试验表明， 厚膜包衣处理提高了甘蓝和青花菜种子的发芽力，幼苗生长表现良好;与对照相比，青花菜厚膜包衣种子的发芽指数达到极显著差异水平， 甘蓝厚膜包衣种子达显著水平。 程季珍等[71]用硫酸盐与壳聚糖包衣研究大白菜种子及幼苗生长的表现，试验表明，大白菜种子对不同硫酸盐的耐受量不同，只有在一定合理浓度范围内，硫酸盐与壳聚糖复合包衣处理才能既保证种子活力，同时提高大白菜种子的抗逆性。 综上所述，我国蔬菜种子包衣技术研究应用尚处于起步阶段，目前市场上的蔬菜种衣剂产品较少， 而当前农业的观念转变和发展趋势使得农业生产者更加重视种子包衣技术的推广、普及和应用，可见，我国蔬菜类种衣剂的研究与开发前景广阔。 1.4 选题依据、目的及内容 种子包衣技术是一项科技含量高且极具生产价值的农业新技术， 种子包衣技术的普及应用将带动整个种子产业的快速发展。我国种子包衣技术起步晚，尚不成熟，存在有如种衣剂质量不高、产品结构不合理、种衣剂作用机理研究不足、包衣种子难以安全贮存、种子包衣管理不规范等问题。 番茄(Solanum lycopersicone)在我国设施栽培生产中种植面积快速增加，在蔬菜供应市场上所占比重逐年增大。猝倒病是番茄苗期重要病害之一，可造成烂种、烂芽、死苗，且其发病率和严重度有逐年增加的趋势。目前生产上常用的防治方法主要是物理方法和化学方法，这两种方法较为传统，需要耗费大量的劳动力及其它农业资源，此外，化学方法极易对环境、植株以及农事操作者的健康造成一定程度的危害。种子包衣技术的推广及种衣剂的应用，不仅能促进包衣作物的生长发育和防治病虫害，而且还能极大地减少人力、物力、财力的开支，降低对农产品、对环境以及对人畜的危害。如前所述，目前国内已有不少有关蔬菜种子包衣的报道，通过添加植物生长调节剂[51,63,66]、天然活性物质[39,49-50,58,70-71]及农药[46,54,61]，不同程度地促进了包衣作物的幼苗生长，降低了病虫害的发生几率。然而，蔬菜苗期病害仍然保持高发趋势，万方数据 文库 文库 1 文献综述 11 我们急需更为高效、专一性强的种衣剂。 本试验以番茄为研究对象，将首先通过形态学观察结合分子生物学方法，分离鉴定当地番茄猝倒病的致病菌;然后测定市场上广泛使用的几种高效、低毒杀菌剂对番茄猝倒病致病菌的毒力，筛选出适合番茄种子包衣处理的高效药剂;最后，通过检测包衣种子的安全性及其对番茄苗期猝倒病的防治效果， 探求对种子安全且对番茄苗期猝倒病有良好防效的包衣配方，为蔬菜种子包衣技术研究和推广提供理论参考。 万方数据 番茄种子抗猝倒病包衣配方筛选、安全性评价与防效研究 12 2 番茄猝倒病致病菌的分离鉴定 猝倒病是蔬菜苗期常见的一类重要土传病害， 致病菌通过侵染幼苗茎基部产生大量水渍状病斑，由茎部缩缢致幼苗猝倒枯死，一旦引发极易造成成片死苗，损失严重[11]。不同地区猝倒病致病菌不同，在我国表现为南北方差异。据报道，在我国北方引起猝倒病的病原菌主要有瓜果腐霉菌、辣椒疫霉以及烟草疫霉等[7-8]，西南地区引起番茄猝倒病的主要病原菌为终极腐霉[9]。本章为了明确本地番茄苗期猝倒病的致病菌，从番茄猝倒病病茎分离出致病菌，并利用形态学观察结合分子生物学方法鉴定分离得到的菌物，为筛选适宜杀菌剂用于番茄种子包衣处理做前期探索。 2.1 材料与方法 2.1.1 试验材料 2.1.1.1 番茄品种及培养基配方 番茄(Solanum lycopersicone)品种为‘合作 903’ ，种子购自浙江省种子公司。2%水琼脂培养基(WA)[72]:琼脂 20.0 g，蒸馏水 1000 mL;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) :马铃薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 18.0 g，蒸馏水 1000 mL;玉米粉琼脂培养基(CMA) :玉米粉 300.0 g，琼脂 18.0 g，蒸馏水 1000 mL[73]。 2.1.1.2 生化试剂 真菌DNA提取试剂盒及磁珠法PCR产物纯化试剂盒购自上海生物工... 文库