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12+第12章 乙酰胆碱酯酶的结构与功能

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12+第12章 乙酰胆碱酯酶的结构与功能12+第12章 乙酰胆碱酯酶的结构与功能 第12章 乙酰胆碱酯酶的结构与功能 1. 引言 胆碱酯酶(cholinesterase, ChE)的研究可追朔到19世纪中叶,在19世纪60年代Argyll- Robinson(1863)对巴拉巴豆(calabar bean )的药理作用进行了观察,他将其提取物滴入自己的一个眼睛,而另一个眼睛作为对照,观察其作用。与此同时,Clermont 第一个合成了ChE的有机磷抑制剂。 直至1914年Henry Dale公爵发现了有关胆碱酯类的烟碱样和毒蕈样的作用,于是提出了毒扁豆碱(p...
12+第12章  乙酰胆碱酯酶的结构与功能
12+第12章 乙酰胆碱酯酶的结构与功能 第12章 乙酰胆碱酯酶的结构与功能 1. 引言 胆碱酯酶(cholinesterase, ChE)的研究可追朔到19世纪中叶,在19世纪60年代Argyll- Robinson(1863)对巴拉巴豆(calabar bean )的药理作用进行了观察,他将其提取物滴入自己的一个眼睛,而另一个眼睛作为对照,观察其作用。与此同时,Clermont 第一个合成了ChE的有机磷抑制剂。 直至1914年Henry Dale公爵发现了有关胆碱酯类的烟碱样和毒蕈样的作用,于是提出了毒扁豆碱(physostigmine)是抑制降解胆碱能神经系统中的一种天然神经递质的概念(Dale, 1914),况且ChE的名词与有机医学化学家Stedman在18年后发中所用的名字相一致(Stedman等, 1932)。由此可见,对ChE的研究已有近80年的历史。据不完全统计,有关ChE的文献已有20000多篇,目前平均每天发表2篇有关ChE的论文。人们为什么会如此关注ChE,因为ChE的抑制剂可以用作化学武器,用作农药,又可用于治疗老年痴呆症(Alzheimer?s disease)、重症肌肉无力(myasthenia gravis)和青光眼(glaucoma)等疾病。本章试图从乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)的结构与功能来论述对有机磷类(organophos- phates, OPs)和氨基甲酸酯类(carbamates, CBs)杀虫剂的研究与开发的启示。 读者若要更全面、系统、深入地了解ChE的研究可进一步参阅以下的论著: Brizin M et al, 1984. 主编的Cholinesterases: Fundamental and Applied Aspects (Berlin: Spinger); Clent WWW-gopher: gopher. montpellier. inra. Fr: 70/1/cholinesterase. Docter B P et al, 1998. 主编的Structure and Function of Cholinesterases and Related Protein. (New York:Plenum Press); Georghiou G P, Saito T, 1983. 主编的 Pest Resistance to Pesticides (New York:Plenum Press); Kerkut G A, Gilbert L I, 1985. 主编的 Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Vol. 12. (Oxford:Pergamon Press); Massoulie J et al, 1991. 主编的Cholinesterases: Structure, Function, Mechanism, Genetics and Cell Biology. (Washington, DC:American Chemical Society); 1 Otto D, Weber B, 1992. 主编的Insecticides: Mechanism Action and Resistance (Anodover: Intercept Publication); Quinn D M et al, 1995. 主编的 Enzymes of the Cholinesterase Family (New York: Plenum Press); Shafferma A, Velan B, 1992. 主编的Multidis-Plinary Approaches to Cholinesterase Functions. (New York: Plenum Press); Siegel G J et al, 1999. 主编的Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects(6th edn.). (Philadelphia:LRP. 215-242.); Wilkinson C F, 1976. 主编的Insecticide Biochemistry and Physiology. (London:Plenum Press). 国内的参考资料有: 张宗炳(1987)的《杀虫药剂的分子毒理学》;唐振华(1993)的《昆虫抗药性及其治理》; 冷欣夫、唐振华、王荫长(1996)主编的《杀虫剂分子毒理学及昆虫抗药性》和唐振华、吴士雄(1999)的《昆虫抗药性遗传与进化》中的有关AChE的章节。 2. 乙酰胆碱酯酶的生理功能 2.1 乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶 胆碱酯酶(cholinesterase, ChE)属丝氨酸水解酶,在脊椎动物体内存在两类胆碱酯酶,即真性胆碱酯酶和拟胆碱酯酶(pseudo-cholinesterase, ,ChE)。由于真性胆碱酯酶对乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的专一性最高,故又称乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)(EC3.1.1.7)。拟胆碱酯酶的最佳底物是丁酰胆碱(butylcholine, BuCh), 故又称丁酰胆碱(butylcholinesterase, BuChE) (EC3.1.1.8)。而在昆虫中仅有AChE。AChE对BuCh没有明显的水解作用。过量底物浓度对AChE有抑制作用,而对BuChE无抑制作用。AChE主要分布于红血球、神经组织和肌肉,而BuChE在许多组织中都能找到,包括血浆、肝脏以及神经组织。在脊椎动物和人中AChE和BuChE都有,但后者的功能尚不清楚。 2.2 乙酰胆碱酯酶的生理功能 如第10章所述,乙酰胆碱(ACh)是神经元突触的神经递质,即介导神经元突触信号传递的化学物质。ACh和AChE在突触处的关系如图12.1所示。当神经冲动通过神经元的轴突传至前突触膜时引起附着在膜上含有ACh的小囊泡推向前突触膜,使小囊泡与前突触膜 2 融合,并破裂,把囊泡中的ACh释放至突触间隙,一个神经冲动能使几十万个ACh从囊泡 图12.1 突触化学传导示意(仿Shankland, 1976) AChE: 乙酰胆碱酯酶 EPSP:兴奋性突触电位 AC:乙酰 AChR:乙酰胆碱受体 ACh:乙酰胆碱 Ch: 胆碱 中释放出来,扩散到间隙的ACh到达后突触膜,与散布于后突触膜上的乙酰胆碱受体(AChR)结合。当ACh与AChR结合后,激活AChE,改变后突触膜的构象,从而改变膜的通透性, ,+使膜外的Na及膜内的K分别往内外通过,使膜去极化,产生作用电位,这个电位称为兴奋性后突触电位(EPSP),这就是ACh与AChR作用所引起的信号传递过程。信号传递后,AChE水解ACh为乙酰(AC)和胆碱(Ch),以供再合成ACh,而AChR恢复,以利反复完成信号传递。ACh的合成以及在AChE作用下的分解作用如图12.2所示。 胆碱(Ch) 乙酰胆碱(ACh) 乙酸(A) 胆碱(Ch) 12.2 乙酰胆碱合成及其代谢 3 由AChE水解ACh后成为乙酸(A)和胆碱(Ch)。水解的胆碱约有一半(图12.1的半胆碱)被重新摄取后用于合成新的神经递质ACh。乙酰辅酶A(CoA)在胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase , CAT)作用下,将CoA上的乙酰基转移到胆碱分子上,成为乙酰胆碱。合成的ACh经胞吞作用又形成小囊泡。 有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂是AChE的抑制剂,抑制AChE水解ACh,使ACh结合在AChR上,无法恢复AChR的功能。从而导致神经传导受阻,直至昆虫死亡。 3. 乙酰胆碱酯酶的结构与功能 3.1 乙酰胆碱酯酶的活性部位 AChE有两个活性部位如图12.3所示:一个是用以固定底物,从而决定其特异性,称为阴离子部位(anionic site, AS); 另一个是能催化部位(catalytic site, CS)。AChE的底物往往是一个含有阳离子基的酯,这样便于与AChE的阴离子结合,故阴离子部位又称结合部位。AChE水解底物必须首先与阴离子部位结合,使其易于受酯动部位攻击。结合部位的阴离子残基可能是AChE蛋白质链上的谷氨酸(Glu),而酯动部位的丝氨酸(Ser)必须要组氨酸(His)的咪唑基来激活丝氨酸的羟基。因未质子化的咪唑环双键氮原子与丝氨酸羟基之间形成氢键,使丝氨酸的羟基氧上产生部分负电荷,从而有利于羟基对底物羰基(或抑制剂磷酰基)的亲核进攻。这3个氨基酸,即Ser、His和Glu后来被称为催化三联体(catalytic triad)。现发现结合部位除阴离子部位外,还有疏水部位电荷转移复合物(CTC)形成的部位,酚结合部位、空间异构部位(作用阴离子部位)和巯基结合部位。 图12.3 乙酰胆碱酯酶的活性部位示意图 3.2 乙酰胆碱酯酶基因结构及乙酰胆碱酯酶的分子型 3.2.1 可变剪接 4 在阐述AChE的基因结构前,先简述一下可变剪接的意义与方式,因AChE经剪接使AChE产生多样性。众所周知,基因的RNA前体分子中含有内含子, 因此某个内含子5?端的供点可以在特定条件下与另一个内含子的3?端受点进行剪接,从而同时删除两个内含子及其中间的全部外显子或内含子,这就是可变剪接。来自一个基因的mRNA前体因可变剪接而产生多种mRNA,翻译出不同的蛋白质,或形成一组相似的蛋白,即同源蛋白(protein isoform),又称蛋白同工型。这些同源蛋白可以在不同的发育阶段,不同组织中,或在细胞内不同的亚细胞结构中,或在AChE基因的不同结构域中出现,并发挥其功能。如有些AChE基因能以这种方式可变剪接(alternative splicing),各个同源蛋白既具有相同的结构或功能域又有特异性的质的差别。这无疑可以使得一个基因所携带的遗传信息在转录后大为扩展。 产生可变剪接的原因有:? mRNA前体的外显子或内含子DNA序列中发生突变、缺失,分别影响5?端和3?端剪接点的存在、数目和位置;? 有的基因中不至一个转录起始位点,在不同组织中两个起始点之间可以间隔数千个碱基,其中并含有内含子,因此就会导致同一个基因转录出两个mRNA前体,需要以不同的剪接方式产生有活性的蛋白质;? 基因3?端常有多个加多聚腺苷信号,有可能产生不同3?端外显子的蛋白质同源体;? 基因中单核苷酸改变产生新的剪接点(在外显子可产生新的剪接点和两个较短的新的外显子;或在内含子中出现产生超长的外显子等)、消除正常剪接点、活化隐蔽剪接点,以及消除正常加多聚腺苷信号,产生异常的3?端非翻译区。 大多数情况下可变剪接产生同源蛋白,它们有共同的结构部分,只在特定区域有改变,从而调节蛋白质的功能有以下几种方式:? 调节蛋白的定性,如AChE的C端区经剪接可产生不同类型的亚基;? 有些同源蛋白只在调节部分先发生改变,造成与配体结合专一性改变;? 有些同源蛋白质仅在转录体5?端、3?端非翻译区发生改变,影响RNA的稳定性和翻译效应,从而在转录后水平上调节基因表达;? 有的基因可变剪接的产物功能完全不同; Smith, 1989)。 ? 调节基因表达的开关( 3.2. 2 乙酰胆碱酯酶的基因结构 脊椎动物和无脊椎动物的ChE基因结构如图12.4所示。线虫Caenorhabditis. elegans的ace基因有4个, ace-1、ace-2、ace-x和ace-y,其余仅有一个基因。在编码序列中有信号分泌肽和共同的催化结构域,但在有些生物的ChE,如图12.4中的果蝇(Drosophila )AChE、电鳗(Electrophorus) AChE和鸡AChE存在插入肽。此外,还存在C端结构域。在该结构域 5 中经可变剪接,产生不同的外显子和分子型。在AChE中,大多数内含子不干扰编码序列,相当于二级结构的一个单位。但也有例外,(图中用*星号表示)。例如在线虫ace-x基因中,鉴于其丰度和生理重要性认为,它编码一个微小ChE (minor cholinesterase)。一个可能的原因是内含子的一部分通过插入侧翼外显子(flanking exons)变成编码子。在鸡AChE中插入 3?端外显子,在电鳗AChE可插入5?端外显子。在果蝇AChE可插入3?端和5?端外显子。由此而增加的编码序列似乎是编码亲水肽,它们是从催化结构域的保守组织核心凸起的部分。在电鳗中移去插入肽不改变酶的催化特性。在鸡的AChE中插入部分相当大的酶使催化 ~110 kDa(与电鳐Torpedo和哺乳动物AChE相比)。但是通过亚基的分子量增加30,:100 有限的胰蛋白酶消化除去这个外加的插入部分质量,没有改变催化特性或亚基的四级组织。因此,现在还不可能明确这些肽插入的任何生理作用。 图12.4 脊椎和无脊椎动物中的ChE基因的外显子-内含子的图解 (仿Taylor和Brown, 1999) 从图12.4可以看出, 不同生物AChE的外显子数目和位置随种而不同,在此无法一一加以叙述。现用小鼠和人的AChE基因为例,如图12.5所示,进一步论述AChE的基因结构和分子型,从图12.5可见其5?端有两个转录起始位点帽(cap)位点1,和帽位点1。它们是 6 可变剪接位置,主要负责组织专一性表达。还有在5?端非翻译区发现有可变剪接接受位点(acceptor sites),可影响mRNA形式的稳定性。启动子区缺少TATA或CAAT框和含GC-序 ?端侧翼区,而且还可在下游的内含子中发现AChE基因由三列。调节转录的元件不仅在5 个不变的外显子(外显子2、3和4)编码的,紧随之后的是3个剪接可变体。一是通过外显子延伸的部分产生一个单聚体部分;二是经剪接的外显子5产生羧基末端序列信号供加上糖基磷酸酯(GPL);三是经剪接的外显子6编码含有半胱氨酸(Cys)的一个序列,Cys与其他催化或结构亚基相连。AChE的这些部分仅在它们羧基末端,最后40个残基是不同的。 3.2.3 乙酰胆碱酯酶的分子型 AChE存在几种分子型,这些分子型除了催化活性外,可溶性和膜锚定的方式也是不同的。第一类分子型是以催化亚基以同源体组装(homoneric assembly ),这些催化亚基可为单聚体、二聚体或四聚体(图12.5)。 图12.5 AChE的基因结构及分子型(仿Taylor 和 Radic, 1994) 基因5?端中的可变帽结构(alternative cap)供不同组织中的选择性启动子使用。外显子2、3和4编码AChE分子的一个不变核心,含有重要的催化残基。只是在终止密码子有3个明显的剪接选择:,外显子4的延伸部分;,外显子4-5剪接;,外显子4-6剪接, 产生的催化亚基仅在它们的羧基末端不同。 图中的虚线为可变的剪接位置,实线为不变的剪接位点。Cap为转录起始;ATP为翻译起始;TGA为翻译终止;PA为加poly A (聚腺苷酸化) 这些催化亚基呈球形,通常用“G”表示,催化亚基的多少则分别在G的右下角加上阿 7 拉伯数字,即G、G、G和G等分别表示为1、2、4和12个催化亚基。每个球形催化亚12412 基(G)的分子是约为80 kDa,如图中同源体外显4中的G所示。每个球形单体通过二硫键11 聚体成二聚体,如图12.4中的G。2个二聚体(G)在范德华力(Van de Waals force )的作用下22 形成四聚体(G)(如图12.5中的同源体的G)。 44 在这类同源体分子型中,根据可溶性和膜锚定的方式,又可分为二种:一种是如图12.5中同源体外显子6中的G(外显子4也是如此)、G和G,羧基末端无锚定结构,是亲水性124 的, 这种称为亲水型(G)。另一种是如同一图中的同源体外显子中的G和G,它们是两1,2,412亲水性的,经翻译后加工,在羧基末端加上糖基磷酸脂(glucophospholipid , GPL), 使酯锚定于细胞膜的外表面,这种称为GPL连接型(G)。 1,2,4 第二类AChEs的分子型的催化结构亚基以异源体组装(heteromeric assembly)的形式存在。这类也有二种,一种是由多至12个催化亚基(G)通过二硫键与丝状的含有胶原的结构12 亚基相连接,这些形式通常称为不对称型(asymmetric),因为尾单位(tail unit)使分子产生了至关重要的不对称性。这些不对称部位位于突触。胶原尾单位(collagenous tail unit )负责这种分子型与突触的基膜(basal lamina)相结合,而不是与质膜相结合。这些不对称型在神经肌肉接头处特别丰富。还有一种形式是催化亚基的一个四聚体通过二硫键与结构亚基相连,这种结构亚基与膜双层脂以共价键与脂相连,使这种形式的酶与质膜相结合。不同亚基的组装和翻译后修饰导致AChE位于细胞表面的不同的部位,但不影响多个形式的内在催化活性。 3.2.4 乙酰胆碱酯酶的多态性和加工 上一节讨论了小鼠和人AChE的可变剪接及其分子。本节着重谈谈AChE的多态性和加工,从前述可见,ChE的催化活性及其在细胞中或细胞外结构中的锚定大多是独立的,是由两个不同的蛋白结构域:催化结构域和C端区来确定的。 为了水解细胞间隙间的ACh,ChE需要暴露于细胞膜的外层上,或从细胞输至细胞外层:它们被合成进入内质网,通过分泌途径加工和转运,最终达到靶标处。因此初级翻译产生含有一个N端信号,后者在成熟蛋白中被裂解。这个N端信号紧随在催化结构域和一个小的C端区。N端信号代表蛋白的主要部分,即约有500个残基。可以存在编码不同类型C端区的几个外显子,它们的可变剪接可确定在加工期间能产生的分子型。 在四级结构和锚定方式不同的多种分子型中可由一个单ChE基因通过可变剪接和通过翻译后加工而产生(图12.6)。 8 这样,基因的多样性(multiplicity)可变剪接和翻译后事件可产生ChE形式的一种防护物(panoply), 但这些机制中的每一种重要性是可变的。例如,果蝇具有一个单ChE基因,仅产生单个类型的编码序列,无可变剪接。根据其端区最终的亚基相当于H型,产生一种主要的ChE,它是由糖基磷酸脂(GPL)锚定的二聚体。反之,线虫Caenorhabditis elegans和Caenorhabditis briggsae具有4个ChE基因。其中每个基因产生一个单转录体,但由此而产生的酶在催化特性和锚定方面会发生很大变化,而主要的ace-1和ace-2基因的产物对典型的ChE抑制剂毒扁豆碱是很敏感的,而ace-3和ace-4的产物对这种氨基甲酸酯是非常不敏感的。这些基因还有在它们的C端区是不同的。 图12.6 AChE的可变剪接和分子型(仿Massoulie 等, 1999) 编码催化结构域的外显子的组成剪接在本图未显示,因为它们的外显子数目和位置随种而不同。编码C端区的不同类型的选择性外显子并不是存在所有的种(见正文和图12.4):只有T外显子发现于所有的脊椎动物AChE基因中。在哺乳动物中,含有“连读”序列(R序列)(read through sequence)的转录体可能产生可溶性单聚体。AChE T亚基的可溶性四聚体为同源寡聚体,但有些或甚至所有的四聚体是以一个富脯氨酸的锚结构域(proline-rich attachment domain, )PRAD样“组织者”。 在脊椎动物中,AChE和BuChE是根据它们对底物和抑制剂的专一性来明确的。这种差异现可以通过催化结构域的组织来进行了解,现有的“酰基口袋”可使BuChE在其活性部位适合于丁酰胆碱(BuCh),但不适合于ACh。相反,AChE活性部位适合于ACh,不适合于BuCh。两个基因间的差异程度随种不同而不同。这种差异在电鳗中不显著,而在脊椎动物,特别是哺乳动物中很显著。Massolie等(1998)把C端区的亚基分为四类:H、T、S和R型(见图12.6)。它们的意义和功能见下节。在脊椎动物中,AChE和BuChE基因总是含有一个编码T型(外显子T)C端区的外显子。BuChE基因,以及电鳗或鸡和乌贼的AChE基因并不具有可变外显子,可产生另外类型的C端区。虽然在外显子T和其他外显子之间的可变 9 剪接在电鳐、环蛇 和哺乳动物中都已观察到,但不同种具有不同的选择:在电鳐和哺乳动物中,AChE基因具有一个H型外显子,而在蛇Bungarus中具有一个S型外显子。此外“连读”转录体(read through transcripts)(R型)在最后的催化外显子后并不被剪接,但已成熟,即加多聚核苷酸(加PolyA)。R转录体在哺乳动物胚胎和成年的电鳐中已被观察到。 3.2.5 编码C端区的外显子的不同类型 3.2.5.1 H型亚基 H代表“疏水的”(hydrophobic)之意,因为这些亚基的C端区是以疏水序列为特征的。这个H区含有一个或二个半胱氨酸残基,可以形成二硫键,所以成熟蛋白是二聚体。H区的主要部分相当于加GPI锚的一个信号,成熟蛋白的C端残基称为,,位于疏水序列的上游。具有这样一个信号的蛋白在内质网进行加工。在,和,+1之间的肽键为一个酰胺,与GPI锚的乙醇胺相连接的一个酰胺取代,C端肽被移去。,氨基酸位于疏水序列上游约10,12个残基。此外,,, ,+1和,+2位置应被具有小侧链的氨基酸占领。 因此,一个H肽必须含有三个元件:一个半胱氨酸残基,一个合适的,断裂部位和一个疏水序列。这些要求是与许多变异作用相谐调的。 3.2.5.2 T型亚基 T代表“尾样的”(tailed)之意。因为这些亚基的特征的C端区对胶原尾样的和疏水尾样的分子组装是必需的。这种C端区或T肽,含有一个位于其C端附近的半胱氨酸残基,以及一系列保守的芳香残基。该肽至少在成熟蛋白中是部分保守的,并赋予它具有疏水特性和形成各种和四价结合的能。 3.2.5.3 S型亚基 S代表“蛇样的”(snake)或可溶性的(soluble)之意。 因为这些亚基仅在眼镜蛇科(环蛇和眼镜蛇)等中发现,在它们的毒液中具有高度分泌性的和可溶性的单聚体AChE。AChE在毒液中的作用尚不清楚,因为它本身是不毒的,并不增强毒液素的毒性。但很有趣的是眼镜蛇的毒液,例如绿曼巴(Dendroaspis viridis)并不含有任何AChE,但含有成束蛋白(fasciculin),它是一种以高亲和力抑制哺乳动物AChE的肽毒素(peptidic toxin)。该AChE基 10 因的结构已在一种金环蛇(Bungarus fasciatus) 中进行分析。这个基因没有H外显子,但有个T外显子和一个新型的S外显子,前者在蛇的肌肉中表达,后者编码毒液的C端区,这个区由一个短的高电荷肽组成,该肽不含半胱氨酸与毒液AChE的可溶性和单聚体状态相符。 3.2.5.4 R型亚基 这些亚基相当于理论上的“连读”转录体(R转录体)的产物,保留“内含子”区(intronic region)。该区在编码催化结构域的最后一个外显子之后。在Torpedo和小鼠中具有R转录体的特征,即具有可变的H和T外显子,这表明它们可由一个剪接缺失(splicing defect)所引起的。R转录体在由抗ChE抑制剂胁迫和中毒后在小鼠脑中大大地增加。R转录体会产生单聚体AChE,但相应的酶在活体尚不被鉴定。 3.2.6 AChE和AChE亚基在不同种中的组织表达 T 在果蝇中仅具有AChE(含H型亚基的AChE), GPI锚定的酶大多数在中央神经系中表H 达,但在肌肉中并不表达,接受谷氨酸激性神经支配(glutamatergic innervation)。 在线虫(Caenorhabditis)中,ace-1基因产生AChE亚基,在肌肉细胞中和一些神经元中T 表达,而ace-2基因产生AChE亚基,在神经元中表达。 H 在脊椎动物中,乙酰胆碱是中央神经系统(central nervous system, CNS)和周围神经系统和神经肌肉连接点的重要神经递质。除了这些部位外,AChE可呈现于血液中、以可溶形式呈现于原生质中、或在淋巴细胞和红细胞的表面。BuChE在胆碱能组织中一般伴有AChE,虽然它的分布可以是不同的,即在有尾巴柱的striosomes中。BuChE的主要源之一是肝脏,它在原生质中分泌一种可溶形式的酶。 在电鳐中,AChE的H亚基在骨骼中表达,还可以在电器官中表达。 在哺乳动物中,H亚基在胚胎肌肉、肝脏和血细胞中表达,但在成熟的胆碱能组织(神经组织和肌肉)中并不表达。 总之,AChE的分子型是对酶的各种四级结构和锚的类型相适应。在脊椎动物中,这些分子都是一个单基因:催化结构或与几种类型的C端肽相结合。这就规定了不同类型的催化亚基(AChE、AChE、AChE),并决定了它们的翻译成熟。在眼镜蛇科蛇的毒液中,AChESHT 产生可溶的单聚体。在电鳐肌肉中和哺乳动物血细胞,AChE产生GPL锚定二聚体。 H 11 AChE是存在于所有脊椎动物胆碱酯酶中的唯一的催化亚基型,它在成人的脑和肌肉T 中产生主要类型。AChE产生多种结构,从单聚体和二聚体到胶原尾型和疏水尾型,其中T 催化四聚体与锚蛋白结合,使它们锚于基层或细胞膜。在胶原尾型中,AChE亚基与一种T特殊的胶原ColQ结合,这种胶原(collagen)尾型N端的非胶原结构域称为ColQ,其中的Q表示:“queue”, 即法语中的”尾”ColQ, 在哺乳动物中是由一个单基因编码的。ColQ含有一个短肽基序,富脯氨酸的锚结构域(proline-rich attachment domain, PRAD),它促使从单聚体和二聚体形成AChE四聚体。这个基序的至关重要的特征是存在一串脯氨酸,实际上合成T 的聚脯氨酸(poly proline)表明有同样的能力来组织AChE四聚体。虽然ColQ基因产生多种T 转录体,但它并不产生疏水尾部。它使AChE锚于哺乳动物脑膜中,AChE亚基和锚蛋白T的协同表达决定分子型。因此也决定酶的定位和功能。 3.3 乙酰胆碱酯酶的晶体结构及功能位点 3.3.1 乙酰胆碱酯酶晶体结构概述 1991年Sussman等首次报导了加州电鳐(Torpedo californica, Tc) AChE催化亚基晶体X射线衍射图。该催化亚基是由15个,螺旋、11个中央混合,折叠和一个N端的短的3束,折叠组成,其大小为4.5 nm X 6.0 nm X 6.5 nm, 呈椭球形。其中,螺旋的含量为15,,,折叠为30,,,折叠于椭球形的中央,其作用被,螺旋包围。AChE的晶体形式是糖脂锚型的同源二聚体, 2.7)。 在羧基端的半胱氨酸(Cys 537)形成二硫键(见图1 图12.7 加州电鳐 AChE的三维折叠的带状简图(仿Sussman等,1992) N端位于底部左边,C端位于顶部右边。结构由11个中央混合的,折叠,外绕15个,螺旋组成, 以及N端有一个短的3链,折叠组成。 3.3.2 乙酰胆碱酯酶的二级结构,折叠 12 在TcAChE蛋白的N端有3束小的,折叠(即表12.1中的b、b和b),11个大的,折123叠用,,,表示 ,连接小,折叠的,螺旋用,表示,如, 即表示连接b和b的,螺旋,而010bb3,232 用,表示连接,和,的,螺旋。若在,折叠之间有多个,螺旋,则在,右上角用数字表示,3,434 124如表中的,,、,,、…… ,, ,即表示在,与,之间有4个螺旋(见图12.8)。各片段的、67676767残基编号及其属二级结构的内容见表12.1。 表12.1 加州电鳐AChE的二级结构 片段名称 残基数编号 内容 b 6~10 小的N末端,-折叠 1 b 13~16 〃 2 , 18~21 大的中央,-折叠 0 , 26~34 〃 1 b 57~60 小的N末端,-折叠 3 ,b 79~85 ,螺旋 3,2 , 96~102 大的中央,-折叠 2 , 109~116 〃 3 片段名称 残基数编号 内容 , 132~139 ,螺旋 3,4 , 142~147 大的中央,-折叠 4 ,168~183 ,螺旋 4,5 ,193~199 大的中央,-折叠 5 , 200~211 ,螺旋 5,6 , 220~226 大的中央,-折叠 6 1 , 238~252 ,螺旋 6,7 2 , 259~268 ,螺旋 6,7 3 ,271~278 ,螺旋 6,7 4 ,305~311 ,螺旋 6,7 , 318~324 大的中央,-折叠 7 1 , 329~335 ,螺旋7,8 2, 349~360 ,螺旋7,8 3, 365~376 ,螺旋7,8 4, 384~411 ,螺旋(在残基400的粗结) 7,8 , 417~423 大的中央,-折叠 8 1, 443~448 ,螺旋 8,9 2, 460~479 ,螺旋 8,9 , 502~505 大的中央,-折叠 9 ,510~514 大的中央,-折叠 10 , 518~534 ,螺旋10 (引自Cygler, 1993) 13 图12.8 表示AChE拓扑结构的二级结构图示(仿Sussman等,1992) ,折叠用黑色箭头表示,,螺旋用小矩形表示。中央,折叠的编号相当于,/,水解酶折叠的8股,折叠的编号,,螺旋的编号是ChE家族的编号。标出的氨基酸为催化三联体(S200、E327、H440)的位置。 3.3.3 Tc AChE的功能位点 根据电鳐AChE的三维结构,主要有以下7个功能位点(施明安和唐振华,2000): (1) 催化三联体: Ser(丝氨酸)200,Glu(谷氨酸)327,His(组氨酸)440。位于谷内,故AChE谷又称活性部位谷(active site gorge)。为氢键型,使Ser200变得更为亲核,攻击ACh的碳,导致形成乙酰化酶,并迅速去乙酰化。 (2) 胆碱结合部位:Trp(色氨酸)84、Tyr(酪氨酸)330、Tyr(酪氨酸)442和Glu(谷氨酸)199构成与底物的结合部位。 (3) 酰基口袋:Phe(苯丙氨酸)288和Phe(苯丙氨酸)290位于谷内壁一侧。 (4) 氧阴离子洞:Gly(甘氨酸)118、Gly(甘氨酸)119和Ala(丙氨酸)201。 (5) 外周阴离子部位:由Tyr(酪氨酸)70、Tyr(酪氨酸)71、Trp(色氨酸)279和Asp(天冬氨酸)72组成。它们位于AChE分子外表面近谷的入口处,都带负电荷。其功能是有助于提高AChE的催化效力。 (6) 芳香族氨基酸形成谷内表面:由14个疏水性的氨基酸残基组成,它们是5个Tyr(酪氨酸):Tyr70、Tyr121、Tyr130、Tyr334和Tyr7442;5个Trp(色氨酸):Trp80、Trp111、Trp114、Trp279和Trp430;4个Phe(苯丙氨酸):Phe288、Phe290、Phe330和Phe331。它们占谷内表面氨基酸残基的40,。其主要功能是加速底物向活性中心扩散,把ACh吸收到低亲和性位点,接着通过二维扩散至活性部位,这称为芳香族引导(aromatic guidance)机制,导致酶具有很高的催化活力。 (7) “后门”(“backdoor”):由Cys(半胱氨酸)67~Cys95之间的“,”噜噗(环)组成。 14 AChE的活性谷见图12.9, 在活性谷内的功能位点见图12.10和催化三联体见图12.11。现将这些位点的功能分述如下。 图12.9 AChE中的活性谷 图12.10 活性谷中的功能位点 图12.11 催化三联体和AChE 15 3.3.3.1 催化三联体 AChE分子结构最显著的特点是在球形分子的表面有一向内凹陷的深而窄的谷(gorge),谷深达20Å,几乎是酶分子的一半,近谷底部逐渐拓宽,AChE活性中心的催化三联体(catalytic triad):Ser200、Glu327和His440均位于谷内,因此这个谷又被称为活性位点谷(见图12.9)。 通过序列同源性比较以及氨基酸定点突变分析分别确定Glu327和His440参予ACh的催化水解。活性位点Ser200的羟基位置大约位于谷底向上0.4 nm,靠近ACh的羰基的碳原子,羰基的氧则应通过氢原子结合到Glu119、Tyr121和/或Ala201位的两个酰胺骨架上而得到稳定。底物ACh的季铵离子通过静电作用和AChE的阴离子亚位点结合。而ACh的亲电子羰基碳原子分两步与AChE中酯动部位的Ser的羟基发生作用。首先是酶与底物形成可逆的复合体,然后酶被乙酰化和释放胆碱;第二步是水分子中电负性的氧原子进攻乙酰化基团中的亲电子的碳原子,形成正常的酶和乙酸。ACh的水解是通过AChE的乙酰化和去乙酰化循环发生,乙酰基-酶复合体形成后,在活性部位的Ser200上发生乙酰化,胆碱部分被释放;接着发生去乙酰化释放乙酸,然后再发生一个新的循环(Rosenberry, 1975)。 3.3.3.2 胆碱结合位点 Trp84、Tyr330或Phe330、Tyr442和Glu199构成了AChE活性中心酶与底物的结合部位,这3个芳香族氨基酸中的任何一个残基定向突变都显著降低底物与AChE的亲和性以及酶的活性。因此,Trp84、Tyr330和Glu199又称为胆碱结合位点(choline binding site)。AChE的晶体结构表明十烷双胺(decamethionium,DECA)的三甲基铵与Trp84的吲哚环只有3点接触,Phe330和Tyr440也在附近。Trp84由Ala取代导致AChE的催化活性降低并不能与腾喜龙(edrophonium, EDR)结合(Shafferman和Velan, 1992)。而活性的丧失对于四价底物是有选择性的,这个发现说明了四价胺与吲哚环的相互作用对稳定酶-底物和酶-抑制剂复合体的重要性,Trp84在所有胆碱酯酶中都是保守的。AChE的第330 位芳香族残基并不是保守的,是Phe或Tyr,丁酰胆碱酯酶(BuChE)中是Ala, Tyr330,Ala突变对于不同的配体表现出不同亲和性,有的增高,有的降低,有的则不变。330位的芳香环同样对稳定酶-底物复合体也是重要的,但它的突变对ACh催化水解影响很小。Tyr442与胆碱结合位点表面的形成有关,Glu199所带的电荷对于该区域结合胆碱也有稳定性作用(Radic等,1993)。 16 3.3.3.3 酰基口袋 谷内壁一侧分布着2个苯丙氨酸:Phe288和Phe290,构成了AChE的酰基口袋(acyl pocket)。它们的侧链伸向活性中心,约束活性中心的空间范围,从而限制结构较大的底物或配体进入活性中心。在丁酰胆碱酯酶中,这两个苯丙氨酸被Leu和Ile/Tyr取代,Leu和Ile虽保持了两个Phe残基的疏水环境,但其侧链对活性中心限制作用明显减弱,因而允许一些大分子进入丁酰胆碱酯酶活性中心与酶结合,提高了酶对大分子底物的催化选择性。Phe288和Phe290突变导致AChE对ACh的催化活性略有下降,但对丁酰胆碱催化活性却显著增加,这也说明了酰基口袋的一些特点。鼠AChE Phe288,Leu只轻微降低对ACh的水解,Phe288,Ala也有类似情况;Phe290,Ile突变后酶可以显著增加对ACh和丁酰胆碱(BuCh)的K值。在BuChE中,用Leu和Ile或Val置换两个保守的Phe,可以出现一个疏m 水的、但空间约束力较小的酰基口袋(Redic等, 1993)。苯丙氨酸侧链的空间约束力可以用于阐明AChE对从丙酰胆碱到丁酰胆碱呈现显著降低的催化活性;有机磷如异八甲磷(isoOMPA)对丁酰胆碱酯酶具有特定的抑制专一性;有机磷抑制AChE有显著的空间特异性。由此也可推测BuChE与有机磷的反应的立体选择性要远低于AChE的。 3.3.3.4 氧阴离子洞 氧阴离子洞(oxyanion hole)可能是由Gly118、Gly119和Ala201的主链氮原子与羰[tāng]基氧相互作用,以及酯键的氧与His440的咪唑基相互作用共同构成。事实上,氧阴离子洞形成是与Ala201的咪唑氮而不是Ser200的咪唑氮有关,后者是由丝氨酸蛋白酶的催化三联体的反向拓扑图构成。Gly118和Gly119是位于一排10个氨基酸残基保守序列中3个甘氨酸中的2个,因此链具有足够伸展柔性,允许Gly118和Gly119的咪唑氮组成氧阴离子洞的一部分。Gly119作为底物结合位点的阴离子成分,与底物中四甲基的碳或胆碱的,碳原子紧密接触。它突变成Glu对动力学参数影响不大。但是,Gly119可能直接或通过水分子与Glu443形成氢键。在AChE分子内部的疏水环境中的两个羰酸侧链有可能形成氢键,或者它们都被质子化(Sussaman等, 1991)。 3.3.3.5 外周阴离子部位 分子外表面近谷的入口处主要由一些带负电的氨基酸Try70, Try121, Trp290和Asp72组成,这些带负电的氨基酸组成了AChE的外周阴离子部位(peripheral anionic site ,PAS)。十烷双胺(decamethionium, DECA)和propidium等化合物与PAS部位有很高的亲和性,这些配 17 体结合于PAS后,通过变构调节,可以影响酶活性中心与底物或其他配体的亲和性。氨基酸定向突变研究表明,不同的配体结合于PAS的不同部位,但所有配体的结合位点中均包括Asp72和Trp279,这两个氨基酸的突变均能影响到配体与PAS的结合。外周阴离子部位在体内的催化功能以及它在突触处的活力中作用仍是研究的关键问题。目前有关PAS的作用研究还不太清楚,可能有助于提高AChE的催化效率:乙酰胆碱进入活性中心之前,先通过静电吸引结合于PAS,然后顺势滑入到谷内并进一步扩散到活性中心,从而加速底物与活性中心的结合进程;也有可能涉及到形成启始复合物并促进底物转移到谷的底部。1992年Shafferman 和 Velan根据高浓度底物与propidium之间的竞争以及底物抑制现象,认为外周阴离子部位在一定离子强度的范围内作为传感器来维持恒定的催化速率。几种结合于外周阴离子部位的双四价和三四价配体以及带有大的四元间距离的双四价配基有可能阻止配基同时结合活性中心和外周阴离子部位。选择性地与活性部位和外周阴离子部位结合的双四价配基中配基间的结合部位有可能存在空间重叠并且各自结合方式是互斥的。Taylor和Lappi(1975)用荧光探针propidium证实这些外周阴离子部位,明显区别于活性部位的胆碱结合口袋。结合ACh的胆碱部分带电的季铵基团的阴离子部位,可以结合竞争性抑制剂两种的四价配体如propidium 、腾喜龙(edrophonium, EDR)和N-甲基吖啶(N-methylacridinium) 以及作为有机磷抑制AChE的激活剂四价肟。Cohen等(1989)在用ACh的阳离子和不带电荷的类似物的研究基础上证实阴离子部位实际上是不带电荷和亲脂性的。 动力学研究发现双四价配基的部位具有较大的四元间距离。早期研究表明双四价和一些单四价抑制剂实际上是加快了酶被中性底物乙酰化的速率,这一增强作用也表明双四价配体-酶复合体具有乙酰化试剂进入活性中心的通道,或许通过改变活性中心的构象来影响酶的反应性。此外,检测一系列双四价配体结合磺酰化和磷酰化酶的能力时发现,只有当磷酰化试剂或围绕四价离子铵基团的体积变大时,活性中心丝氨酸被磷酰化和磺酰化修饰后才影响到双四价配基的亲和性(Wilson, 1967)。由于结合表面的重叠,双四价配体与选择性结合于活性中心的配体(如N-甲基吖啶)和外周阴离子部位点的配体如propidium、 没食子胺(gallamine)、 d-筒箭毒碱(d-tubocurarine)的结合方式是互斥的。DECA的氮原子间的四元间伸展是~14 Å,而且两个三甲基铵基团又增长6 Å,所以存在的潜在的跨度。AChE-DECA复合体晶体结构表明三甲基铵基团固定于Phe330和Trp84之间;其余部分从活性中心谷延伸出来于Trp279、Tyr70和Tyr121的边缘,这些残基位于谷口边缘并与外周阴离子部位的酰基结合有关。用旋转标记的双四价配基进行研究表明分子两端的结合受到抑制,并且胺连接的硝基氧之间的跨度与结合后伸展构象一致。双四价荧光基团标记进一步阐明了配体结合 18 部位的特征(Taylor和Jacobs, 1974)。 3.3.3.6 芳香引导(aromatic guidance)机制 在谷内表面排列着14个疏水性的芳香族氨基酸残基(Tyr70、Trp80、Trp114、Tyr121、Tyr130、Trp233、Trp279、Phe288、Phe290、Phe330、Phe331、Tyr334、Trp432和Tyr442),占谷内表面氨基酸残基的40%,这些残基及其侧翼序列在不同物种AChE中是高度保守的, 、,6和,7、,7和,8之间及,8之后的噜噗(环)。谷内壁14个芳主要来自,1和,2、,3和,4 香族残基其中有的是深入谷内,而其他的多数在谷壁上形成一个大的芳香补丁(aromatic patch),它们在AChE与底物的结合过程中起重要作用。谷的疏水性有可能产生低于局部介电常数,这要比小量的酸性氨基酸残基产生更有效的局部电荷,更重要的是芳香族氨基酸残基组成的疏水性谷内表面可将ACh吸收到低亲和性部位,这就是芳香族氨基酸残基所形成的芳香引导机制。反应产物胆碱从谷中有效地、快速地清除也可能采取同样的机制。此外,芳香族氨基酸残基可以排除在谷底部置换水分子的必要性,但它只能起被动作用。谷内芳香族残基的作用有可能加速底物向活性中心的扩散。BuChE在谷内只含有6个芳香族残基,但通过测定k/K发现其在催化效能上比AChE降低1/3。 活性部位谷中只有几个酸性残catm 基:Asp285和Glu273位于谷的最高部;Asp72与Tyr34以氢键相连,在谷的中下部;Glu199近谷的底部,Asp443则深入到分子的内部,其他几个阴离子残基的位置则远离谷。Glu199的阴离子侧链离活性中心谷最近,当胆碱结合后,它即与胆碱的三甲基胺基团在一定距离内相接触。谷底部的唯一的负电荷似乎与阳离子配基快速的结合速率不相一致。但是,全面分析表面电荷和AChE分子内在的偶极取向,活性中心谷阴离子残基对阳离子底物或抑制剂进入谷内起相当大的加速作用(Tan等, 1993)。 化学修饰和波谱学研究也支持AChE的活性部位存在芳香族残基。谷的壁和底的高含量的芳香族残基及其大小可用来解释生化研究中发现的与活性部位分离的或重叠的各种疏水性的阴离子结合部位。用各种化学试剂修饰酶可以大大降低对ACh的水解活力,但不影响或有时会增强对各种中性酯类的水解。有机磷的同源系列物的亲和性和反应速率存在着区别;这也表明于阴离子位点之外存在结合ACh的疏水区域。Berman等(1990)根据芳香族残基排列的复杂性推断还存在一个芳香阳离子结合部位,该位点要比阴离子位点更接近于酯动部位。这与深谷从活性位点向上延伸的特征相一致。荧光标记和亲和标记已经证明肽段序列251~264残基和270~278残基是作为ACh和其他四价配体的外周结合部位,这两个邻近的肽段在蛋白的表面靠近谷的边缘。考虑谷的复杂几何构象,可更好地理解不同的配体结合外 19 周部位的复杂性以及不同的抑制效应。某个配体由于体积太大而不能进入,但它仍能部分地阻塞谷的入口。作为强力抑制剂,较长的双四价复合物可能附于外周一个或几个部位的一端,而另一端附于谷壁各种芳香族残基上的任何一点。但是,由于谷的深度,较短的双四元抑制剂和肟激活剂可以整个地结合于狭谷内(Berman和Leonard, 1989)。Dougherty和Stauffer(1990)认为由于离子的极化导致芳香基团与季铵配体比不带电荷同构配体的反应力更强。谷中芳香残基可以高频率地结合配体,由此导致酶具有很高的催化活力。谷的疏水性有可能产生低的局部介电常数,这要比从附近的小量的酸性基团产生更有效的局部电荷。更重要的是芳香基团的内表面可将ACh吸收到低亲和性部位,接着通过二维扩散至活性部位。反应产物胆碱有效、快速地清除也可能采取同样的机制。 3.3.3.7 后门开放(backdoor opening)机制 AChE产生强的静电场能吸引阳离子底物ACh进入活性中心。但是,长而窄的活性谷似乎与酶的高催化效率不一致。近年来,为了阐明AChE催化的高效率,对后门开放机制进行了大量研究。对在水中进行的AChE分子动力学模拟,结果显示存在一个短的通道,在接近Trp84的活性部位薄壁产生瞬间开放,该通道足让一个水分子通过(Gilson等, 1994)。静电计算结果表明后门处有一强场,它专门吸引底物和反应产物胆碱并排斥另一反应产物乙酸(Tan等, 1993)。定点突变分析发现一个突变可以封闭该后门。但热力学运动可通过以下两种途径形成后门开放构象:, 活性谷很深并且太窄,难以让ACh进入;而四价胺进入AChE晶体表明蛋白具有足够的伸展性允许底物通过某种途径进入。, 谷内部静电场有可能促进正电荷底物的进入,并强迫反应产物胆碱从活性部位的口部出去。在残基Met83和Trp84处,接近活性部位的底部存在一个薄壁,为产物的逃逸提供另一条通路。后门也许在底物或产物或二者同时经过窄谷时还为水分子提供一条通道。 活性部位的入口在开放构象中靠近限定谷入口的残基Glu73、Asn280、Asp285和Leu333的中间。通过残基Trp84、Val129和Gly441从晶体坐标转换到开放构象而实现通道的开放,在活性部位壁内形成另一通道,Trp84的侧链有可能对ACh四价胺基团的结合起着重要作用。通道的形成始于Trp84CH2和CZ2、Gly441和Tyr442的环,沿着Trp84的边缘折曲,然后在近Trp84的酶蛋白表面形成凹窝。在晶体结构中,溶剂直接经过的途径位于Val129处的间隙,Trp84吲哚环的置换就如同在平面内闪动的快门。在晶体构象中,Trp84残基要比Val129和Gly441残基具有更大的可动性(Simon等, 1999)。 AChE水解一个底物分子需要0.1 ms,尽管开放事件是短暂的,约119 ps,这表明后门 20 有可能在较长时间的催化反应中具有一定的功能。后门开放对AChE产生的静电场也具有重要影响。后门开放时,场线从活性部位Glu199开始,在近Trp84的间隙处发出。但在晶体结构中场线大多是从活性部位谷口处发出。通过计算蛋白表面每点的静电势发现静电势最低的表面点位于活性部位的底部,近Ile444处。因此ACh通过谷口或后门被吸引到谷的底部。但观察结果与同一个静电场引导ACh进入、下沉到谷中并促使胆碱从后门出去的观点相矛盾。静电场加速其他产物如乙酸离子的离去;同时,更宽后门的开放可能通过增加活性部位对高介电溶剂的暴露而减弱谷内的静电,并促进另一反应物胆碱从谷中释放出去(Tan等, 1993)。 后门开放在酶的催化功能上具有重要意义,而通过突变关闭后门并结合酶动力学研究是检验后门是否存在的一种关键方法。如上所述,残基Trp84、Val129和Gly441的运动可产生开放的通道,也可通过突变Val129来了解后门开放机制。空间结构分析表明Lys或Arg能适合于129位置,侧链能填充表面窝,该位置处于带正电荷的基团Met83、Asp129、Glu445和Leu456之间。而Val突变后,侧链的正电荷基团离活性位点的距离很远(~11Å),况且Val129位于蛋白表面在结构上可能没有特殊的功能。因此,Val129的突变并不影响酶的功能(Cygler等, 1993)。另外,比较已知的10个胆碱酯酶的氨基酸序列发现129位变化很少:8个是Val,2个是Ile。而Ile只比Val多了一个亚甲基,所以它也不可能阻闭后门。 在AChE活性部位近Trp84壁处出现特殊的孔,这对酶催化功能也许具有一定的重要意义。实验已经证实热波动可使蛋白质表面出现大小程度不同的孔,特别是对小的、非极性分子的进出非常有利。催化三联体中的His440在水解过程中有可能获得动力学能量并通过肽键传给形成通道的残基之一Gly441。Gly441获得能量后有可能增加后门开放的概率,使催化反应过程中形成有组织地、有序地通道开放。通道的产生可能存在两种途径:Trp84,Val129和Gly441快门样平面运动;Cys67和Cys95之间的Ω环形成活瓣样过渡构象。但是定点突变研究显示关闭后门并没有对AChE的催化效率产生影响;导致特定区域构象弹性大大降低的定点突变对底物水解速率的影响也不显著。但这些结果并不能完全排除后门存在瞬间开放的可能性。事实上,分子动力学模拟显示,尽管有把Ω环固定于酶体上的二硫键的介入,Trp84的近侧仍保留相当在的构象弹性。AChE二聚体与9-氨基四氢吖啶(tacrine)复合体的分子动力学模拟也支持酶分子表面发生瞬间开放为溶剂分子进入活性位点提供另一条途径(Harel等, 1995)。但复合体的电子密度图的特征并没有显示出高弹性区域的存在,而高弹性区域有可能涉及更大开放的产生(Wlodek等, 1997)。由上可见,随着AChE空间结构研究的不断深入,加深了人们对AChE催化功能的理解,这对新药的创制提供了新的理论依据。 21 由此可见,AChE存在一个深而窄的谷,谷底部有一个活性位点,它是由催化三联体和所谓的阴离子亚部位组成。阴离子亚部位识别底物的四价铵基团:由Glu327、His440和Ser200构成的催化三联体负责底物乙酰胆碱的水解。在谷的入口处,有一个调节位点被称为外周阴离子部位,残基Trp84和Trp279分别在催化和外周的阴离子部位起关键作用。朝着谷底部方向存在一个强的静电偶极子,该偶极阳离子对产物胆碱的清除是非常不利的,并与酶的高催化效率形成明显对照。位于催化口袋底部的后门开放为产物释放提供了另一种途径,但对后门学说的争论仍然十分激烈。X-衍射晶体学与化学修饰研究有助于阐明配体结合活性中心谷特异性的分子基础。部位特异突变分析在确定氨基酸残基参与乙酰胆碱酯酶空间结构或催化功能中起着非常重要的作用。 3.3.4 TcAChE和Dm ChE结构与功能的比较 目前除了上述的TcAChE外,获得三维结构的AChE还有:小鼠的AChE(mAChE)(Bourne等,1995;1999)、人的AChE(hAChE)(Kryger等,1998)和黑腹果蝇(DmAChE)(Hardel等, 2000)。现将TcAChE和DmAChE的三维结构与功能作一比较。只有了解了它们的共同点和不同点,才能为对现有的高毒杀虫剂进行改造,才能设计具有高选择性的杀虫剂,才有了解突变抗性的结构基础,从而设计反抗性化合物,对抗性基因进行治疗。 3.3.4.1 DmAChE与其他AChE的序列比较 DmAChE与包括TcAChE在内的DmAChE序列比较见图12.12。 尽管DmAChE和TcAChE的序列一致性较低(36%), 但hAChE或mAChE和TcAChE的序列一致性也仅为53%~54%。它们的三维结构的折叠是类同的,它们的活性部位是紧密重叠的。DmAChE和TcAChE之间的主要差异发现是在它们的外环和C端螺旋的倾斜角(tilt)(图12.12),但这些差异不会影响催化的功能。 22 图12.12 3种脊椎动物和3种昆虫AChE序列的排列(仿Harel等,2000) 红色:昆虫/脊椎动物的一致性;黄色:昆虫/脊椎动物的同源性;蓝色:脊椎动物的一致性或同源性; 绿色:昆虫的一致性或同源性;上端的号码为TcAChE的编号;底部的号码为DmAChE的编号。 3.3.4.2 DmAChE和TcAChE的结构功能比较 DmAChE像脊椎动物AChE一样,属于,/,水解折叠家族,具有由,螺旋连接的8个, 23 折叠组成的一个核心。2个C原子位置(用575个残基中的362个)中的根均方, (root-mean-square,RMS)差异是0.8 Å。Harel等(2000)测定了抑制剂ZAI和ZA与AChEDm复合体的RMS,结果见表12.2。ZAI为1,2,3,4-四氢-N-(3-碘苯甲基)-9-吖啶胺(1,2,3,4-tetrahydro-N-(3-iodophenylmethyl)-9-acridinamine), AChE的一种可逆抑制剂,ZA为1,2,3,4-四氢-N-苯甲基)-9-吖啶胺,与ZAI的差别是在3位无I(碘),AChE的一种可逆抑制剂。 表12.2 C原子的根均方(RMS)(Å) a DmAChE ZAI复合体温表 ZA复合体 DmAChE ZAI复合体 0.5 ZA复合体 0.7 0.4 , TcAChE0.8 0.7 0.8 (引自Harel等,2000) a 应用342个C原子 a 表面环中的某些区域在DmAChE和TcAChE结构之间有8 Å的差异,大多数是在序列的插入或缺失区,例如22~24,193~198,298~301,353~356,418~422和545~549。活性位点三联体(Ser238, His, Glu367);形成氧离子洞的残基(Gly150, Gly151和Ala239)和阴离子结合部位(Trp83)与脊椎动物活性部位的重叠性很好。但是侧链的构象与TcAChE稍有不同(与AChE编号相比较见表12.3)。酰基结合口袋形状的改变是由于2个重要的氨基酸残基Tc Leu328(在TcAChE中为Phe238 )和Phe440(在TcAChE中为Val400)。这些变化虽然能改变酰基口袋形状,但不改变对抑制剂或对底物酰基基团的现有的总空间(图12.13C)。 DmAChE像TcAChE一样,二聚体是由2个对称的相关单聚体通过一个由4个螺旋组成的束(four-helix bundle)结合而成的,若将AChE和AChE一个亚基束中的2个螺旋重DmTc 合,则互相的二聚体呈现稍有扭转,DmAChE的Gly和TcAChE的Gly56的C,原子离开最远(8.4 Å)。 昆虫和脊椎动物AChE序列比较表明,昆虫序列中有3个长插入(图12.12),2个短插入(残基192~199和297~301),虽然均位于相邻的表面环,但长插入(残基104~139)位于表面,邻近N端,其中只有4个残基(136~139)在电子密度图(electron density map)中是可见的,其余的残基是无序的。 24 表12.3 从活性部位谷底到其入口处的活性部位谷的残基 AChE AChE DmTc Tyr162 Tyr130 Ile484 Ile444 Tyr148 Tyr116 Glu237 Glu199 Gly481 Gly441 Gly149 Gly117 Ser238 Ser200 Gly155 Gly123 Trp83 Trp84 Gly150 Gly123 His480 His440 Thr154 Ser122 Gly151 Gly119 Trp472 Trp432 Glu80 Ser81 Trp271 Trp233 Tyr370 Phe330 a Met153 Tyr121 Phe371 Phe331 Leu328 Phe288 Phe330 Phe290 aa Arg70 Val71 Tyr71 Asp72 Glu69 Tyr70 Tyr374 Tyr334 Trp321 Trp279 Glu72 Glu73 Tyr324 Leu282 Tyr73 Gln74 Asp375 Gly33 a仅为位于活性部位谷两侧的主链原子 (引自Harel等,2000) 活性部位谷跨越外周结合位点,近Trp321(TcAChE中为Trp279),距催化三联体方向约 20 Å, 在分子内的深处,该谷在TcAChE中比DmAChE更宽。况且, 谷的轨道改变几个Å(图 12.14)这个改变是由于几个氨基酸残基改变所致。 这样,TcAChE中的Asp72在DmAChE中 由Tyr71取代,Tyr121由Met153取代,Phe330由Tyr370取代,这些取代有增效作用,结 果谷的“颈”(“neck”)变窄,仅为4.5 Å(见图12.14, 12.15)。在DmAChE中,位于该“颈” 下方活性部位谷的容积约是TcAChE相应部分的50%,这是由于主要的“阴离子”位点残基 25 吲哚环的位置发生了部分改变(图12.14B, 12.15),以及TcAChE中的Asp72在DmAChE被Tyr71取代。 AChE的潜在表面类同于其他AChE分子,表明含有开口到活性部位谷的分子正面为带Dm 负电荷的基团,反面为正电荷基团(Feldel等, 1997;Botti等, 1998)(12.15A)。分子偶极移动的方向像在其他AChE 结构情况中一样,约是沿着活性部位谷轴移动(12.15B)。 3.3.4.3 昆虫与脊椎动物AChE:基于结构的活性差异 AChE的活性部位谷外包芳族侧链(DmAChE 13个,TcAChE 14个),该谷通过非共价键与它的各种抑制剂互相作用(Hard等, 1993;1996;Kryger等,1999)。这些侧链通过摆动使活性部位谷在接抑制剂中具有柔性,产生不同的构象。这样,可使活性部位变宽或变窄,以便让抑制剂通过留驻,而主链原子很少可没有相伴的移动。这暗示DmAChE的活性部位谷是相当窄的(图12.14A,B),鉴此,对昆虫AChE来讲,这不利于设计选择性抑制剂。 图12.13 DmAChE和TcAChE的主体结构比较(仿Harel等,2000) A:DmAChE(红色)和TcAChE(绿色)C痕量的重叠; , B:DmAChE(红色)和TcAChE(绿色)催化三联体、氧离子洞残基和阴离子结合部位残基Trp83的 重叠,灰色带表示DmAChE主链; C:DmAChE(红色)和TcAChE(绿色)酰基口袋残基、氧阴离子洞和活性部位丝氨酸的重叠,灰色 带表示DmAChE主链。 获得了抑制剂选择性的主要候选条件是在活性部位谷开口附近成簇的8个残基,它们在昆虫和脊椎动物序列中是不同的。这此差异其实就是抑制剂选择性的潜在靶标。最大的差异是在Tyr71, Tyr73, Glu80和Asp375,在脊椎动物中它们分别为Asp、Gln、Ser和Gly。 26 但是这些不同的残基不是在活性部位谷的内壁,而是在与谷残基,即第二壳层(the second shell)的相互作用,这些残基在影响选择性中起作用。 图12.14 DmAChE和TcAChE活性部位谷的立体图(仿Harel等,2000) A:DmAChE的活性部位谷; B:TcAChE的活性部位谷,Phe330残基位于表面的远侧 图12.15 DmAChE中活性部位谷侧翼残基(仿Harel等,2000) 脊椎动物和昆虫中一致的残基用绿色表示;不同的残基用红色表示。在数字前的残基字母为DmAChE的残基,数字后的字母为TcAChE的残基。gorge top 为谷顶,gorge bottom为谷底。 27 脊椎动物和昆虫AChE之间已知的一个差异是昆虫AChE水解具有较大的酰基部位的底物。如丁酰胆碱的能力。产生这种差异的原因可能是在脊椎动物的酰基结合口袋,AChEDm中相当于Leu328和Phe371的残基,在AChE中是2个苯丙氨酸(Phe288和Phe331),AChETcTc中的2个苯丙氨酸形成一个刚性的-叠对(arigid -stacking pair)。而在AChE中,,,,, Dm残基328不是苯丙氨酸,而是亮氨酸(Leu),于是就无这个刚性的,-, 叠对。缺少这个刚性叠对就使Phe371更容易移动,使昆虫酰基结合口袋能接纳具有较大酰基部位的底物。在hAChE中同一残基的突变,即Phe295Leu,增加其对丁酰胆碱的活性,与其对乙酰胆碱的活 AChE中Leu328Phe突变应降低其水解丁酰胆碱的能性相比,要高100倍。因此,可预期Dm 力,这一预期可通过定向突变来检验。 4. 乙酰胆碱酯酶的动力学及其重要参数 前面几节阐述了AChE的分子结构与功能,那我们如何来了解OPs和CBs杀虫剂对AChE的抑制作用呢,下面对OPs和CBs对AChE抑制作用、AChE的动力学以及一些重要参数的意义作简要阐述。 4.1 有机磷和氨基甲酸酯对乙酰胆碱酯酶的抑制作用 有机磷和氨基甲酸酯对AChE的作用实际上是抑制剂对酶抑制结果。整个抑制过程,即导致活性中心丝氨酸羟基的磷酰化,类似于ACh的乙酰化过程。但是,与乙酰化的酶相反,磷酰化酶是高度稳定的,在某些情况下是不可逆的,去磷酰化几乎不发生。这样,被阻断的丝氨酸羟基不能再参与ACh的水解。可用以下反应式表示: OOO K kdp-[AChE-AChE(RO)(RO)]+AChE-PX22P(OR)PXX+2 复合物被抑制的酶 K i 上述反应中的X为有机磷酸酯的一个脱离基,K为复合物与反应物之间的解离常d 数,K为磷酰化常数,K为双分子抑制常数,等于K/K。因为K决定酶与底物的亲和性,pipdd 取决于分子结构和立体性,而有机磷酸酯的变化与磷酰化常数K有关。双分子抑制反应的d 整个反应速率常数K取决于K和K值。对于有机磷杀虫剂来讲,酶的磷酰化即使酶受抑idp 28 制。 氨基甲酸酯的情况与有机磷基本相似,抑制过程如下: OOO K kdc-.AChE[]AChECHNHAChECHNH+XNHCHXCC3CX3+3 复合物被抑制的酶 K i 其中X为氨基甲酸酯的脱离基,K为氨基甲酰化常数。 c 与磷酰化AChE相反,氨基甲酰化酶不稳定,自发重新产生游离酶的半衰期(half-life 1t2velocity, )为30~60 min。氨基甲酰化AChE自发恢复的反应如下: OO KrCHNHCO+]OHCHNHC[HOAChH322AChECNHCH+3+23 K 为去氨基甲酰化常数 r 乙酰化酶、磷酰化酶和氨基甲酰化酶自发恢复的速度顺序如下 : OOO AChECCHCNHCHAChE>>>P(OR)AChE332 乙酰化AChE 氨基甲酰化AChE 磷酰化AChE 111ttt222(为ms) (为min) (为h或d) 一般去磷酰化需要几个月的时间,氨基甲酸酯的去氨基甲酰化也需要几小时,而去乙酰化一般只需几分之一ms。 4.2 乙酰胆碱酯酶的动力学及一些重要参数 由上一节可见,AChE是OPs和CBs杀虫剂的作用靶标,这些化合物以与ACh类同的方式形成复合物,然后分别使酶的活性部位磷酰化和氨基甲酰化。通过一个可逆的复合物的形成,OPs和CBs对AChE起抑制作用,随之AChE磷酰化或氨基甲酰化对OPs的恢复是相当慢的,可忽略不计,但氨基甲酰化酶缓慢地被水解,重新产生游离酶。现将整个反应用以下的反应式表示: 29 kk32 AEAXEAE +Ka+ XE + AX + S KkmcatE +PES 式中E代表游离酶,AX代表具有其裂解基团X的OPs和CBs, EAX为可逆复合物, EA为磷酰化酶或氨基甲酰化酶,S为底物, ES为酶-底物复合物,以及P为底物水解的产物。K 为米氏常数(Michaelis constant ), K 为酶的转换数目。K是抑制剂化合物对AChE活性mcata 部位的亲和力常数,K为磷酸化或氨基甲酸化速率常数,K为去磷酰化或去氨基甲酰化常23 数。由此可见,反映AChE、底物和抑制剂的动力常数有V、K或K、K、K和I。其maxamicat50意义如下: V:最大反应速率,表示酶的活性大小。 max K(或K)是反映结合酶形式的解离常数,若K小则亲和力大,K大则亲和力小。故mamm 也称亲和力常数(affinity constant)。K以在V,1/2 V 时底物浓度表示。 mmax K: 双分子反应速率常数(bimolecular reaction rate constant),是一级速率常数。K = iiK/K 或K=K/K, K在平衡态时为K(解离常数),K=K/K。K值越小,酶对抑制剂越不2mi2amdd12i 敏感。测定这个常数是比较敏感和抗性变异体中AChE敏感性最好的技术。AChE对其底物的亲和性高可防治酶免受杀虫剂的作用(底物保护作用,因为底物和抑制剂竞争与催化中心的结合。因此,如果2个AChE变异体有相同的K值,但K值不同,则K值小的变异体imm呈现更大的不敏感性。 I和pI: I为抑制AChE活性50,时所需的抑制剂浓度。以此来反映AChE对各505050 种抑制剂的敏感性。I值越小,抑制作用越强。pI为I的负对数。 505050 上述的动力学参数中,K值和I均表示抑制的活性或毒性,反映抑制作用的强弱,但i50 K值比I更为确切,因为AChE磷酸酰化或氨基甲酰化速度常数的增大或酶与抑制剂的亲i50 和力提高都能增强抑制剂的活性,也就是说K值大,抑制作用大,K值小,抑制作用减弱。 ii K:通称为酶的转换数。因为它代表了在每个单位时间内,每个活性部位上的底物cat 分子转换成产生最多的底物分子数目,或者在每个单位时间内,酶的转换的次数,故又称为催化常数。 K/K:是二级速率常数。其重要性在于反应速度与游离酶浓度,而不是与总酶浓 catm 度有关。故可用于测定竞争性底物的专一性,有时被称为专一性常数。 30 根据公式V,V[S]/(K+[S]), 式中[S]为底物浓度,V为反应速度,V为底物的最大maxmmax反应速度(maximal velocity), 它们可从Lineweaver-Burk作图法获得,公式中V=K E, Emaxcattottot是AChE活性部位总浓度。K是抑制剂化合物对AChE活性部位的亲和力常数,K为磷酰a2化或氨基甲酰化速度常数,这两个参数与双分子反应常数(biomolecular reaction constant)Ki 相关,K,K/Ka。根据Main公式: i2 kt211,_= )([i]log vK 2.303,Kaa 式中i为抑制剂常数,K为去酰化速率常数。在OPs的抑制过程中,K比K小得多,332 ??但还是有意义。K可从以下公式测得,ln(E?/E?) = -t, K其中E和E分别为时间0和t时被抑3030 制剂酶的浓度。 由此可见,上述的这些AChE动力学参数可反映不同的AChE与不同结构的OPs和CBs 之间的关系,以及不同的AChE,包括因变构的AChE对OPs和CBs的敏感性来确定这些抑制的毒性大小及其变化。可根据需要来应用上述的参数。至于这些参数的求法及公式的推导可参阅Main(1964)及作者的《昆虫抗药性及其治理》一中的有关章节,在此不再复述。 在国外发达国家的农药大公司,如拜耳和捷利康以及大多数药物公司应用离体靶标来进行高通量自动筛选(high throughput automated screening, HTAS)。在1991年,一年只通过几十次测定,就可筛选化合物20000多个,一星期内只要测定几次,就可筛选上百万个化合物。微量滴定板(microtitre plate)从96穴增加到384穴,甚至1536穴,达到超高通量筛选(ultra HTAS)。 在许多抗性昆虫中,变构AChE对OPs和CBs抑制作用的敏感性下降。其原因是变构的AChE对抑制剂的亲和力或抑制速度常数或二者一起改变(详见25章)。 5. 乙酰胆碱酯酶,抑制剂复合体的晶体结构 自1993年以来,人们已经研究了大量AChE与可逆性或不可逆性抑制剂,如他克林(tacrine, THA)、腾喜龙(edrophonium, EDR)、十烷双胺 (decamethonium,DECA)、fasciculin(FAS)、h石杉碱甲(huperzine A, HupA)、E2020、丙氟磷(DFP)、氟膦酸甲基-1-甲基乙酯(沙林,sarin) 、氟膦酸甲基-1,2,2-三甲基丙酯(梭曼,soman)、毒扁豆碱(eserine)类似物等与酶形成复合体的晶体结构。AChE-抑制剂复合体结构类似于ACh水解过程所形成的过渡态中间体,这对了解AChE的催化机制或抑制过程具有重要意义。AChE的正常的生理 31 底物ACh的季铵离子通过静电作用和阴离子部位结合,而ACh的亲电子羰基碳原子分两步与AChE中酯动部位的Ser200的羟基发生作用。首先是酶与底物形成可逆的复合体,然后酶被乙酰化和释放胆碱;第二步是水分子中电负性的氧原子进攻乙酰化基团中的亲电子的碳原子,形成正常的酶和乙酸。乙酰基-酶复合体形成后,在活性部位的Ser200上发生去乙酰化,AChE 复活产生游离酶。AChE除了和底物ACh结合外,也能和许多类似底物的化合物结合。有机磷与氨基甲酸酯都是以半底物的形式通过与活性位点的丝氨酸(Ser200)残基形成共价键而抑制AChE。但是,抑制剂与AChE不同部位的结合对酶的抑制强度会有所不同, 如含有季铵基团的氨基甲酸酯类化合物以共价键与酯动部位结合也能与阴离子部位结合。施明安和唐振华(2000) 在以下几方面作了较详细的阐述。 5.1 乙酰胆碱酯酶的抑制位点 有机磷酸酯和氨基甲酸酯是AChE的酯动部位抑制剂。有机磷酸酯是一类AChE强力的 48-1-1抑制剂,这类化合物的K值在10~10(mol/L).min之间。由于有机磷化合物磷原子的亲电i 子作用使之与AChE丝氨酸的羟基结合,使AChE磷酰化。与磷原子相连的取代基吸电子性越强,化合物的抑制能力越强, 但磷原子的亲电子过强, 会使化合物稳定性降低,容易被水解。有机磷实际上是以半底物的形式和酶反应形成一个磷酰化酶衍生物,类似于酶和底物反应时形成乙酰化酶。但乙酰化酶和水反应为0.1 ms,磷酰化酶和和水反应非常缓慢。二甲基磷酰化酶和水反应需要1 h或更多;二乙基磷酰化酶需要几 h;二异丙基磷酰化酶和水反应是非常缓慢的。氨基甲酸酯可以和AChE形成氨基甲酰化酶衍生物。氨基甲酰化酶恢复的速度(K)要比磷酰化酶快,二甲基氨基甲酰化酶恢复50%的时间大约是30 min;单甲基氨甲3 酰化酶大约为40 min;氨基甲酰化酶大约是2 min。用稀释或透析的方法酶活性可以恢复,和不可逆抑制剂有机磷相比氨基甲酸酯是一类可逆的抑制剂。但是,二甲基氟磷酸酯的抑制很容易通过稀释使酶活性恢复;二苯胺甲酰氟和一些双四价氮氨基甲酸酯的抑制则不能恢复。 阴离子部位的抑制剂引入一个极性基团将导致抑制能力降低。但在3-羟苯基三甲基铵离子化合物适当的位置上引入一个羟基,可以使其与AChE的结合能力增加120倍。N-苯基三甲铵、N-甲基吡啶及N-甲基吖啶也都是AChE强力的抑制剂。N,N-二甲基-氯-2-苯基胺是红血球AChE的不可逆抑制剂,它的活化形式是氮丙啶离子,它对AChE的抑制作用可能是由于在阴离子部位或其附近使酶烷基化。氮丙啶离子在烷基化前形成可逆的复合体,烷基化过程可以被季铵离子(如四甲基铵离子)和底物ACh阻止。尽管烷基化酶对ACh几乎没 32 有水解活性,但是,能够加强对某些底物的水解,如靛酚乙酸酯。烷基化酶能与沙林 、梭曼和特普等化合物反应,而不与胺吸磷反应。后者可能与其结构上含有铵离子功能基团有关,它可以在酶被磷酰化之前与阴离子部位作用,说明氮丙啶离子能在酶烷基化后阻止阳离子基团和阴离子部位的作用。不可逆的抑制剂对-(三甲基铵)苄基重氮苯氟硼酸既能与阴离子部位结合又能与外周阴离子部位结合,和AChE反应后,明显降低AChE对ACh的水解活性,增加对靛酚乙酸酯的水解活性,这和氮丙啶离子的作用是类似的。该化合物能够快速和AChE反应形成偶联的重氮化合物。这种反应可能是四价氮在偶联前直接和阴离子部位结合形成一个复合体,该偶联反应比其他的重氮化合物反应快得多。四乙基铵离子、十烷双胺和筒箭毒碱等可以阻止该化合物对AChE的影响。铵离子化合物可以抑制酶的氨基甲酰化和甲磺酰化反应。四乙基铵离子是比较好的加速剂之一,N-甲基吡啶结合到酶上后既不加速也不抑制,但能够阻止其他离子的加速作用。铵离子能够抑制AChE脱氨基甲酰化。在低盐条件下,脱氨基甲酰化速率比较慢。但四乙基铵离子可以加速脱氨基甲酰化4倍;四甲基铵离子几乎没有影响。三甲基铵和二甲基铵对乙酰化酶阴离子部位的结合常数大体上是相同的,但在大多数情况下与游离酶的结合常数要比乙酰化酶要大。在乙酰化酶中,铵离子结合在阴离子部位可以阻止酶与水分子的接近,阻抑脱乙酰化反应,这和铵离子阻止脱氨基甲酰化是类似的。实际上,脱氨基甲酰化也可以被ACh抑制。筒箭毒碱和季铵酚类化合物很容易抑制ACh的水解,但是,抑制率最高仅达约50%,说明抑制剂-底物-酶三元复合体的存在是可能的。由于底物占据活性部位后,抑制剂只能结合在外周阴离子部位。 有些化合物既能与阴离子部位结合又能与酯动部位结合。例如,EDR主要是通过季铵基团与阴离子部位结合,但它也可以通过羟基与酯动部位咪唑基的氮结合,只是没有形成共价键。另外有些酯动部位的抑制剂也可与阴离子部位结合,使抑制活性加强。AChE的疏水部位可以通过范德华力与抑制剂中的非极性基团结合,如抑制剂中的烷基链。N-羟基-N-甲基氨基甲酸酯和N-甲氧基-N-甲基氨基甲酸酯是两个可逆的竞争性抑制剂, 主要与AChE的疏水部位结合,与酯动部位和阴离子部位的作用不大。AChE有几类外周阴离子部位(空 2+3+间异构部位),可以与各种化合物结合。,部位与Ca和DECA结合;,部位与Al结合。外周阴离子部位的结合可以调节AChE的活性。例如,阿托品与外周阴离子部位结合后,可以加速AChE对底物的水解并能阻止过量底物的抑制作用。说明过量底物与外周阴离子部位结合引起的过量底物的抑制现象可以被阿托品阻止。过量底物的抑制现象可能与ACh分子和乙酰化酶的阴离子部位结合有关。 33 5.2 有机磷-乙酰胆碱酯酶复合体的晶体结构 有机磷酸酯(OP)是AChE强有力的抑制剂,它可快速磷酰化AChE,然后经历内在的脱烷基化反应(又称老化,aging),产生不能复活的OP-酶轭合物。电鳐AChE与DFP,sarin或soman反应后获得老化的轭合物,它们晶体结构的分辨率分别为2.3,2.6或2.2 Å。最高的阳性区分密度峰与OP的磷原子相对应并位于每个结构中活性位点丝氨酸(Ser200)的共价键距离内。OP的氧原子位于AChE催化亚单位的四个潜在供体的氢键距离内,表明静电力对稳定老化的酶具有重要意义。三种复合体结构中结合OP的整体方向与活性位点谷有关。NMR波谱技术对OP-AChE轭合物研究结果与晶体学结构一致,发现溶剂中的AChE的活性位点区域也处于深而窄的谷内。 化学位移的NMR研究非常明确地显示出老化的OP-AChE轭合物中活性位点O-P键的存在。与天然的AChE相比较,老化的OP-AChE结构中活性位点三联体(Ser200-His440-Glu327)的几何学没有明显的变化。在天然AChE活性部位的氧离子洞中在氢键距离内通常存在一个水分子,而在3种复合体结构中都被OP替代。AChE强的空间选择性确保初始OP反应子是sarin和soman的磷原子空间异构体。 老化的sarin-AChE和soman-AChE的活性部位空间结构基本上是一致的,并为与底物ACh反应产生的负电性四面体中间体(tetrahedral intermediate,TI)的去乙酰基作用提供结构模型。AChE与羧基酯底物包括ACh的反应是通过形成一个不稳定的TI,然后进一步形成 1t2半衰期很短的乙酰基-酶(约为50 ,s)。结果乙酰基-酶受到水的亲核进攻,再次形成第二个TI,最后酶排斥掉离去基团而再生(去乙酰基作用)。两步催化机制使得AChE易于被一类有机磷酸酐抑制剂抑制,这种抑制反应是快速的、化学计量的,但基本上是不可逆的。有磷酸酯是作为半底物而抑制酶,并且结构上非常象负电性的去乙酰基化的TI。与羧基酯形成的中间体不同的是,OP-酶复合体能持续几小时至几天。慢速水解反应可用空间位阻来解释:活性部位组氨酸(His440)携带的一个水分子并不正对发生亲核进攻的磷原子的正面。在活性部位丝氨酸磷酰化后,某些OP-AChE轭合物要经历抑制后反应,即老化;老化导致酶的抑制彻底不可逆。最具特征性的老化反应是AChE被DFP、sarin和soman的抑制反应。这些抑制剂具有分枝的烷基,并通过碳正离子机制发生去烷基化作用,因此在磷酰化AChE的活性部位增加一个顺式的负电荷。由烷基离去而引进的负电荷是去磷酰化作用的重要屏障,因为阴离子的磷酸酯对亲核攻击具有内在的抗性。但是,单用静电排斥力并不能充分解释老化酶的完全不可逆特征。一个负电荷的存在对单纯的磷二酯的亲核攻击反应延迟50~100倍。 从氧阴离子洞(Gly118,Gly119和Ala201的主链氮原子) 到一个磷酸的氧原子形成的3 34 个氢键在老化前后对OP加合物起稳定作用。事实上,这种相互作用可以通过去烷基化而得到加强,因为电子重排可以将老化的OP-酶轭合物的负电荷(部分或完全地)定位于双极性的氧阴离子洞中。 部位特异性的突变也显示出与人AChE中Gly118或Gly119相对应的氧阴离子残基替换后,人丁酰胆碱酯酶(BuChE)对OP抑制剂的双分子反应速率常数显著地降低。老化的OP-AChE结构显示出非共价力可能与OP特征性的不可逆抑制有关。酰基口袋是酶重激活的另一个屏障。由Phe288、Phe290、Trp233和Gly119的C,形成的“干”的疏水性补丁完全包围一个OP烷基团,并通过阻塞攻击的水分子到磷原子正面的通道而限制去磷酰化,并提供与sarin和soman形成稳定的非共价键接触。在DFP的磷酰化作用中,AChE的酰基口袋中所包含残基Phe128和Phe290的环主链出现了意想不到的运动。 AChE被DFP磷酰化后,在老化之前能很快与亲核肟反应发生去磷酰化,重激活的酶在底物特异性以及与一系列荧光双四价胺配体的亲和力等方面与天然酶基本上是一致的,因此观察到的构象变化在重激活之后有可能是可逆的。老化反应阻止了去磷酰化,但是与某些底物或抑制剂反应可使老化的酰苯口袋处于一种短暂的动态构象。因为发生移动的酰基口袋环也包括Trp279,它是AChE的外周阴离子部位的重要组成部分,可由此推测该环在催化过程中起着联接活性部位与外周阴离子部位的作用。 5.3 氨基甲酸酯- AChE复合体的晶体结构 毒扁豆碱的类似物二甲基吗啉环氨基甲酰毒扁豆碱(MP268)氨基甲酰化电鳐AChE后,所获得复合体的晶体结构分辨率为2.7 Å。晶体结构中MP268的二甲基吗啉环氨基甲酰部分是与位于长而窄的谷底的催化丝氨酸共价结合。这也阻止了氨基甲酰化过程中离去基团毒扁豆碱酚从谷口通道出去。令人惊奇的是在晶体结构中并没有发现体积较大的毒扁豆碱酚,暗示着AChE存在清除毒扁豆碱酚的另一种途径,这也为后门开放以及产物通过后门释放提供了间接证据。AChE抑制剂碱毒扁豆碱类似物目前已被广泛运用于治疗阿尔茨海姆症,这些复合物都属于氨基甲酸酯这一大类,作用机制是催化丝氨酸被快速氨基甲酰化,随即是酶的慢速复活,该过程与底物水解有点相似,但在酰基酶快速重激活方面存在着差异。稳定的氨基甲酰化酶结构可以阐明ACh水解过程中的中间体形成、AChE的催化机制以及这一类复合物的抑制作用。 AChE-MF268复合体的整体结构与自由酶的结构相比较并未表现出突出的构象变化。延伸的电子密度清晰地显示出活性部位谷中长链分子的存在,而电子密度从Ser200的侧链 35 近端开始,在Trp279的吲哚环附近中止。抑制剂的二甲基吗啉环氨基甲酰部分有可能与Ser200的O,形成共价结合,C-O共价键是通过原子间1.4 Å 距离得到证实,该距离在精炼过程中不受外界约束力的影响。氨基甲酸基团是通过属于所谓的氧阴离子洞的Gly118和Gly119的羰基氧与N-H功能键之间氢键得到稳定,O-N的距离分别为2.7和2.9 Å。晶体结构显示二甲基吗啉环部分能使抑制剂桥接酶的催化位点和外周阴离子位点。吗啉环与外周位点的主要组成部分Trp279的吲哚体系相对;在Trp279的吲哚环与吗啉的碱性铵基团之间阳离子-,也存在相互作用。而在相应的AChE复合体中DECA的四价基团之一以及E2020的吲哚部分也存在与此类似互相作用,这种相互作用增强了MF268与AChE的亲和力,因此也可说明MF268比eptastigmine具有更强的抑制潜力。 AChE-DECA和AChE-MF268复合体结构存在重叠表明Trp279具有相似的空间倾向;从氮原子到吲哚环中心的距离在两种复合体中分别为4.7和5.6 Å。MF268与DECA的构象比较显示烷基链表现出混合的反式和顺式旋转异构体并在活性谷上部有部分重叠,MF268的烷基链在谷下部向催化丝氨酸弯曲;而DECA的烷基链则直接指向阴离子亚部位的Trp84,因此呈现更为线性和延伸的构象。由于活性位点谷长而窄,MF268只能以伸长的构象进入到催化部位。带有两个碱性胺基的毒扁豆碱酚部分与底物的四价基团一样,与阴离子亚位点的识别有关。根据已观察到的结构特征,在谷底部MF268的毒扁豆碱酚部分与Trp84有可能发生相互作用,其中包括烷基链弯曲,结果氨基甲酸部分所处的方位适合于催化丝氨酸的亲核进攻。在AChE的氨基甲酰化过程中,毒扁豆碱酚是离去基团。在该复合体中离去基团毒扁豆酚从活性位点被清除。AChE二聚体与THA复合体的分子动力学模拟结果表明通道的宽度变化几乎不允许底物ACh进入到催化部位。由于毒扁豆碱比乙酰胆碱体积大,不能呈现平面结构,因此在烷基链存在条件下,它从谷扩散出去几乎是不可能的。晶体状态构象的自由度比溶解状态下的要低,因此催化口袋内部的变动所受到的限制更大。谷的窄度是AChE底物特异性的基础;象propidium这样体积大的抑制剂的作用仅局限于外周部位。具有烷基链的毒扁豆碱酚截面很大,它能与谷底部的催化部位相互作用在抑制剂中是少见的。 去氨基甲酰化的动力学主要受几个因素调节,如氨基甲酸基团的亲电性、长链氨基甲酰化加合物的稳定性以及催化谷中反应水分子的可利用率。线性烷基链的电子供给效应只比甲基稍有升高,它对氨基甲酸基团的亲电性的影响并不能为防止水亲核进攻提供足够强的稳定作用。而在复合体结构中谷的水含量要比自由酶低得多。而在自由酶结构中催化谷内平均分布16个水分子。烷基链在谷上部完全替代水分子,在谷底只发现8个水分子,其中6 个与谷壁残基形成氢键,而剩下的2个之间形成氢键并参与Trp84的,体系形成偶极子-偶极子 36 之间的相互作用,而氧原子与吲哚环中心的平均距离是4.9 Å。因此谷中潜在反应性水分子的可利用率是很低的。而且到活性位点的通道被烷基链阻塞,因此新的水分子扩散到催化丝氨酸受到大大的限制。AChE二聚体与THA复合体的分子动力学模拟也支持酶分子表面发生瞬间开放为溶剂分子进入活性位点谷提供另一条途径。但复合体的电子密度图的特征并没有显示出高弹性区域的存在,而高弹性区域有可能涉及更大开放的产生。动态的环境中产生足以让水分子进入的小通道也可以排除,这与MF268氨基甲酰化AChE的不可逆性形成对照。丝氨酸-氨基甲酰键的水解释放出长键片段,所含的氨基甲酰基团仍易受到亲核进攻。二甲基吗啉基团与Trp279之间的阳离子-,相互作用则和烷基链与谷壁的芳香残基之间的相互作用一道,阻止从催化口袋中快速清除该片段。口袋内的二甲基吗啉环氨基甲酸基团被重激活的催化三联体加入一个新的亲核基团,随即恢复到氨基甲酰化酶。 5.4 四价配体- AChE复合体的晶体结构 EDR和THA都是AChE的竞争性抑制剂。EDR主要用重症肌无力的临床诊断,由于四级结构特殊,它不能穿过细胞膜和血脑屏障而只能作用于肌肉终板上。而THA能通过血脑屏障,目前THA用于积极控制阿尔茨海姆症。通过X-射线晶体衍射学和光亲和标记技术研究了电鳐AChE对四价配体的结合位点,发现AChE-EDR复合体中配体的四价氮与Trp84的吲哚发生相互作用,并且m-羟基与催化三联体的两个残基Ser200和His440形成共价键,呈现分叉羟基形式。在THA-AChE复合体中,吖啶对着Trp84的吲哚进行环堆积。DECA是沿着窄谷探入,一直通向活性中心;一个四价基团与Trp84的吲哚并列,而另一个基团则在近谷顶部与Trp279的吲哚并列。3个复合体中主要构象区别是Phe330苯环的方向存在差异。在AChE-DECA复合体中,Phe330的苯环与谷内表面平行;而通过光亲和标记证实在其他两个复合体中Phe330的苯环与结合的配体紧密接触。为了容纳THA-AChE复合体的芳香环,Phe330的侧链明显存在进一步转动,含三环的抑制剂如EDR 也占据相似的位置,插在Phe330和Trp84之间的三环体系通过, 轨迹导致稳定性的增强。早期研究证明N-甲基吖啶与AChE的Trp84之间存在一个电荷转移复合体,N-甲基吖啶的结合导致结合后的荧光几乎完全消失。在吖啶结合过程中Trp84的吲哚侧链为阳离子吖啶环受体提供富含电子的供体环体系。结构与化学数据都显示芳香基团作为四价配体的结合部位重要功能,同时也进一步证明Trp84和Phe330定位于活性中心的阴离子亚位点而Trp279定位于外周阴离子部位。AChE的晶体结构表明DECA的三甲基氨与Trp84的吲哚环只有三点接触,Phe330和Tyr440 37 也在附近。Trp84由Ala取代导致AChE的催化活性降低并不能与EDR结合。而活性的损失对于四价底物是有选择性的,这个发现说明了四价胺与吲哚环的相互作用对稳定酶-底物和酶-抑制剂复合体的重要性。用光敏试剂DDF 保护标记propidium的标记研究以及直接用azidopropidium标记鉴定出两段肽(电鳐中的270~278和251~256残基),这两段肽应与外周阴离子部位配体结合表面的形成有关。这些残基的暴露表面的位置接近活性中心谷的边缘。因此,结合于外周阴离子部位的配体通过生理阻滞限制谷的入口;或通过阳离子配体的结合所赋予的电荷排斥;或通过活性中心构象变化的变构机制可能阻止底物进入谷内。阳离子Pt-terpyridine复合物要比中性底物更大程度地抑制乙酰胆碱的催化水解。外周阴离子部位在体内的催化功能以及它在突触处的活力有可能涉及启始复合物的形成并促进底物转移到谷的底部。 HupA是从中草药石松提取的一种生物碱,它在中国民间已广泛运用了几个世纪。HupA 与AChE的亲和力非常高,能强烈抑制AChE。HupA-AChE复合体晶体结构的分辨率为2.5 Å,HupA主要通过疏水作用力与活性中心谷内壁的芳香残基发生相互作用。用苯环或邻苯二酚环替代HupA的羟基吡啶环后,发现邻苯二酚能置换其中的一个晶体水分子,该晶体水分子对AChE的Tyr130和Glu199残基与HupA之间形成共价键起着非常重要作用。 抗阿尔茨海姆药物E2020在E2020-AChE复合体晶体结构中呈现延伸构象,E2020跨越AChE的活性位点谷全长。因此,它既能与阴离子亚位点相互作用,又能通过芳香堆积与谷入口处的外周阴离子位点的保守残基发生作用,但它不能与催化三联体或氧阴离子洞产生接触。尽管E2020是手性分子,它的S和R型异构体对AChE具有相同的亲和力,但只有R型分子能结合在活性谷内。E2020对AChE的选择性主要表现在与残基Trp133和Phe330的相互作用,而BuChE则缺少这两个残基。 5.5 多肽- AChE复合体的晶体结构 蛇毒素FAS家族的3个相关肽可结合哺乳动物和电鳐的AChE,而不能结合鸟的AChE或哺乳动物的BuChE。这些6.5 kDa的肽可结合于DFP磷酰化后的AChE,但其结合可被propidium和某些双四价抑制剂阻止。因此,FAS可作为结合于AChE的外周阴离子部位的代表性物质。FAS是61个氨基酸构成的三指样多肽,由3个环和1个核心组成。Bourne等(1995)的研究发现FAS的三点协同性锚合与复合体的Ks的pmol/L数量级存在一致性。FASd 的环II中所含的疏水残基群与鼠AChE的外周阴离子部位相互作用,并插入谷中对活性中心的底物进入形成空间位阻,FAS的Met33与AChE的Trp279之间形成非常特殊的堆积。 38 而环I则位于活性中心谷边缘附近的间隙处,对环II与谷口形成的接触起加强作用。环III的指向则远离谷,但它的羧端残基也与酶发生接触。FAS的核心残基在酶蛋白表面形成突出的环,对AChE-FAS复合体起稳定作用。FAS结合酶之后,AChE的结构发生轻微的重排,这种结构上的变化有可能赋予了FAS-AChE复合体一定的残余酶活力。动力学研究发现FAS -12-9-1,-1能选择性抑制哺乳动物和电鱼的AChE,K 值范围在10~10(mol/L)min之间;同时也i 发现FAS并不能完全阻塞配体进入活性中心谷的通道,可能是结合酶的外周阴离子位点之后,通过变构调节抑制酶的催化活性。FAS主要是结合AChE的外周阴离子部位的两个保守的芳香残基,鸡、昆虫的AChE以及BuChE的外周阴离子部位由于缺少保守的芳香残基,它们与FAS的亲和力则非常低。其次,FAS与AChE的互补性还涉及一系列带电荷的残基,但并不形成分子间的盐键。 6. 有机磷类的结构对乙酰胆碱酯酶的抑制作用之间的关系 6.1 物理化学参数与pI的关系 50 现发现有机磷对AChE的抑制作用与有机磷的结构有关,也就是说与这些化合物的物理参数有关。许多学者先后研究了二乙基取代苯磷酸酯物理化学参数与生物活性后,可用以下公式来表示物理化学参数与pI的关系(Hansch, 1970): 50 mIp,-0.97E + 2.29,–1.20 X +5.52 50s m式中的X 为取代位置常数,间位取代为1,对位取代为0;,为Hammett常数;Es为立体参数(与范德华半径成线性关系)。pI为I负对数。 5050 6.2 含P,S的有机磷类与含P,O的有机磷类对乙酰胆碱酯酶的抑制作用 含P,S键的有机磷杀虫剂,在离体情况下不能抑制AChE,或抑制作用很低,但在活体情况下,在体内的P450单加氧酶的作用下,将P,S转化为P,O后,则对AChE抑制可增强几百倍,甚至几千倍。例如对硫磷(P=S)转化为对氧磷(P=O)后对AChE的抑制作用增强10000倍以上。在此要特别指出的是,在使用含P,S的OPs时要特别注意,因为其毒性一般为中毒,但进入体内后,在P450单加氧酶作用下,转换成P,O的氧化物后,其毒性就转为高毒,甚至极毒。例如对硫磷转变成对氧磷;乐果转变成氧乐果;二嗪磷转变成二嗪氧磷等。另一个增毒的原因是一般含P,S的OPs对解毒酶酯酶等基本上无抑制作用。但转为 39 P,O后,对解毒酶酯酶的抑制作用极强,于是就抑制了解毒酶对OPs的降解。 根据上述原因,目前正在研究开发的农药残毒快速检测仪,仅是检测农作物,特别是蔬菜、果树上含P,S键的OPs的残毒是“危险”的,造成中毒的根本原因是这些含P,S键的OPs进入体内后,经体内的P450单加氧酶“活化”为毒性很高的P,O键OPs。故务请慎之又慎。这就是目前国外已经或不久将对这类有机磷杀虫剂,如对硫磷、甲基对硫磷和二嗪磷等禁止使用或限制使用的原因所在。 6.3 苯基磷酸酯的间位引入取代基后对乙酰胆碱酯酶的抑制作用 我们还可以发现,如在苯基磷酸酯的间位引入取代基,如甲基对硫磷苯环的间位引入甲基,成为杀螟硫磷,则后者对哺乳动物的毒性是前者的1/180,而杀虫活性与前者相当。其主要原因是大大地提高了抗家蝇AChE的活性,并表现出高度的选择性。如甲基对硫磷对家蝇和小鼠的LD分别为1.2和23 mg/kg,脊椎动物选择指数(VSR),19.2。而杀螟硫磷分别50 为3.1和1250 mg/kg,VSR,403.2。由此可见,在苯环间引入甲基能增强抑制AChE的能力,而对哺乳动物的AChE抑制却降低,可以从哺乳动物和昆虫AChE的结构上的差异来解释其原因。AChE的阴离子部位与酯动部位之间的距离在昆虫中为0.5,0.55 nm,而在哺乳动物AChE中为0.43,0.47 nm,苯环间位烷基与磷原子的距离为0.52,0.62 nm,因而间位烷基能很好地附着于昆虫的阴离子部位,使酯与其的亲和力增加,促进酶-抑制剂复合物的形成;而在哺乳动物AChE上却因距离匹配性差而不利于酶-抑制剂复合物的形成(如图12.16),亲和力不强。这就是这类化合物具有选择毒性的原因所在。 图12.16 间烷基与乙酰胆碱酯酶的阴离子部位相互作用 6.4 有机磷类的手性对乙酰胆碱酯酶抑制作用的影响 40 虽然AChE的天然底物乙酰胆碱是没有手性的,但AChE与含手性碳原子或手性磷原子的磷酸酯反应时,却表现出明显的立体选择性。况且对抑制作用有立体选择性。化合物?的左旋异构体与AChE的反应比右旋异构体快10,20倍。具有磷原子和碳原子两个手性中心的化合物?和?虽然两个手性中心均表现出抗AChE的立体选择性,但磷原子的手性比碳原子的影响更大。在化合物?中,比较四个对映异构体对家蝇头AChE的相对活性可以看出,(-)p比(+)p差700倍以上,而(-)c与(+)c才差1,2倍。在化合物?中,(S)构型比(R)构型抑pp制牛经血球AChE的能力大1630倍,抑制家蝇AChE的能力大9120倍。 虽然OPs和CBs的发展因毒性问题受到限制,但随着分子生物学技术的发展和不断渗透到农药的研究中,特别是对它们的作用靶标 , AChE的结构与功能的研究,可对现有的化合物进行修饰改造,或研制具有高度选择性的化合物。 检测农药在生态系统中的残毒是控制污染的第一步,目前在国外,应用专一性的抗体来检测水中的农药,该方法虽然有效,但这种技术的成本高。因此,一直在设计含有电鳐o AChE的生物传感器(biosensor)。实际上,电鳐AChE并不是最好的模型,而果蝇的AChE是更好的候选品种。由于果蝇中的AChE量较低,故需要离体生产蛋白,例如在通过一种重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得足以应用的AChE。况且,离体突变已表明,在酪氨酸(Tyr)上的突变的果蝇AChE对OPs有更大的亲和力。这样可增加环境中这些分子的检测灵敏度, 与此同时,可应用这种高度敏感的AChE来进行高通量甚至超高通量筛选。 昆虫对OPs和CBs产生抗性的主要机制之一是AChE基因的某一位点或几个位点发生了突变。这些基因的产物即为变构的AChE,从而对OPs和CBs的敏感度降低。为此,我们可以以变构AChE为靶标,设计反抗性化合物(antiresistant compounds),这些化合物具有高度选择性,对抗OPs和CBs的昆虫具有负交互抗性(native cross-resistance)。与普通的OPs和CBs混用,既可达到防治种群的敏感个体,又可防治抗性个体。这样不但能达到治 41 理抗性的目的,又能降低用药量,减少用药次数,这些反抗性化合物对天敌和人畜具有高度选择性。 主要参考文献 冷欣夫, 唐振华, 王荫长, 1991. 杀虫剂分子毒理学及昆虫抗药性. 北京:中国农业出版社. 30,56. 张宗炳, 1986. 杀虫剂分子毒理学. 北京:农业出版社. 唐振华, 1993. 昆虫抗的药性及其治理. 北京:农业出版社,211,310. 唐振华, 吴士雄, 2000. 昆虫抗药性的遗传与进化. 上海:上海科学技术出版社.,190,217. 施明安, 唐振华, 2000. 农药学学报, 2(3):1,7. 施明安, 唐振华, 2000. 世界农药, 22(4):12,18. 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