米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞周期和抗细胞凋亡作用

米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞周期和抗细胞凋亡作用 米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞 周期和抗细胞凋亡作用 畜牧兽医2009,40(6):916—921 AetaVeterinariaetZootechnicaSinica 米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞周期和 抗细胞凋亡作用 李淑芳,张继东,李英,雍艳红,孙凤莉 (1.广东海洋大学动物医学系,湛江524088;2.河北省畜牧兽医研究所,保定071000) 摘要:为探讨米糠多糖(RBS)对免疫抑制鸡免疫调节作用的机理,作者采用流式细胞术检测了健康雏鸡,环磷酰 胺(CTX)和传染性法氏囊病毒(IBDV)诱导的免疫抑制雏鸡在给予RBS剂量150mg/(kg?d)3和不给予RBS情 况下脾脏和法氏囊细胞的DNA含量,细胞周期及细胞凋亡率.结果显示:(1)cTx+RBS组雏鸡脾脏s期细胞比 例和PI值显着高于CTX组(P<O.05),该2组鸡的法氏囊细胞周期没有显着差异(P>0.05).(2)IBDV+RBS组 雏鸡脾脏s期,G期细胞比例和PI值,法氏囊的s期细胞和PI值均高于IBDV组(P<O.05);(3)CTX+RBS组和 IBDV+RBS组雏鸡脾脏和法氏囊细胞的凋亡率分别低于CTX组和IBDV组(P<O.05).结果表明:RBS能够促 进CTX处理鸡脾脏细胞和IBDV感染鸡脾脏和法氏囊细胞DNA复制,对CTX和IBDV诱导鸡的脾脏和法氏囊细 胞凋亡过程均有一定的拮抗作用. 关键词:米糠多糖;流式细胞术;免疫抑制;细胞周期;细胞凋亡;鸡 中图分类号:$852.4文献标识码:A文章编号:0366—6964(2009)06—0916-06 EffectsofRiceBranP0lysaccharideonCellCycleandAnti—apoptosisof SpleenandBursaCellsinImmunosuppressionChicken LIShu—fang,ZHANGJi—dong,LIYing,YONGYan—hong,SUNFeng—li (1.DepartmentofVeterinaryMedicine,GuangdongOcean University,Zhanjiang524088,China;2.InstituteofAnimal ScienceandVeterinaryMedicineofHebei,Baoding071000,China) Abstract:TostudytheimmunemodulatingmechanismofRiceBranPolysaccharide(RBS)onim— munosuppressedchick,theflowcytometrytechniquewasusedtodetecttheDNAcontent,cell cycleandapoptosisrateofspleenandbursacellsofchickensinhealthy,andimmunosuppressed chicksinducedbyCTXandIBDVundertheconditionsofgivingandnotgivingwithRBSatdos— ageof150rag/(kg?d)byintragastricadministration.Theresultswereasfollows:1)Thecell ratioofSphaseandproliferationindex(PI)inspleenofCTX+RBSgroupwerehigherthanthat ofCTXgroup(P<0.05),whereastherewasnosignificantdifferenceofbursacellcyclebetween CTX+RBSandCTXgroup(P>O.05).2)ThecellratioofSandG2phaseandthePIinspleen andthecellratioofSphaseandthePIinbursaofIBDV+RBSgroupwerehigherthanthatofIB— DVgroup(尸 <O.05).3)TheapoptosisrateofspleenandbursainCTX+RBSandIBDV+RBS groupwerelowerrespectivelythanthatofCTXandIBDVgroup(P<O.05).Thesedataindica— tedthattheRBScouldireproveDNAreplicationofspleencellsinchickenstreatedwithCTX,as wellasspleenandbursacellsinchickensartificiallyinfectedbyIBDV,andthattheRBScouldin- hibittheapoptosisofspleenandbursacellsinchickenstreatedwithCTXandIBDV. 收稿日期:2008—10—20 基金项目:河北省"十五"科技攻关项目(04220401D) 作者简介:李淑芳(1964一),女,河北元氏县人,副教授,博士,从事动物免疫学及预防兽医学研究,E—mail:lishufang0816@126.corn 6期李淑芳等:米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞周期和抗细胞凋亡作用917 Keywords:ricebranpolysaccharide;flowcytometry;immunosuppression;cellcycle;apopt osis; chicken 米糠多糖(ricebranpolysaccharide,RBS)具有 良好的抗肿瘤,增强免疫,抗细菌感染等生物活 性口.j.研究证明_4],米糠多糖在实验动物体内外均 能促进淋巴细胞增殖,促进正常小鼠腹腔巨噬细胞 的吞噬作用,对补体活性和体液免疫也有一定的促 进作用;米糠多糖可以提高IL1,IL一2,TNF—,IFN一 74种细胞因子在小鼠体内的mRNA表达水平,显 着促进小鼠腹腔巨噬细胞在体外产生IL一1,TNF—a 和脾淋巴细胞产生IL-2,IFN一7的作用].此外,米 糠多糖对健康雏鸡和环磷酰胺(cyclophospamide, CTX)诱导免疫抑制鸡的免疫功能具有一定的调节 作用[5].由于CTX和传染性法氏囊病毒(IBDV) 诱导的免疫抑制均与免疫器官的细胞凋亡有关,因 此,本试验利用细胞流式术检测了CTX和IBDV诱 导免疫抑制鸡在灌服和不灌服米糠多糖情况下脾脏 和法氏囊细胞的DNA含量,细胞周期和细胞凋亡 率,以探讨米糠多糖对鸡免疫抑制调节作用的机理. 1材料与方法 1.1受试药物 以稻谷米皮糠为原料,用水提醇沉法分离提取, 化学方法分步纯化后制得米糠多糖.其主要成分: 多糖86.30,蛋白质2.30,灰分1.15,水分 1O.25,不含脂肪和淀粉.用生理盐水稀释成1 溶液,高压灭菌,备用. 1.2主要试剂与仪器 环磷酰胺(CTx):批号07020221,江苏恒瑞医 药股份有限公司生产;传染性法氏囊病毒(IBDV, ID.一1×10"/0.1mL):临床分离强毒株,由本实 验室保存;细胞流式仪:EPICSXL型,Beckman公 司产品. 1.3实验动物分组与样品采集 1日龄三黄鸡(公雏,购于广东省湛江市某孵化 场,AGP试验检测IBDV抗体阴性),常规饲养.7 日龄时,选择健康雏鸡240只,随机平均分为6组, 即:空白对照组,RBS组,CTX组,CTX+RBS组, IBDV和IBDV+RBS组.从7日龄起,CTX组和 CTX+RBS组雏鸡每天一次性注射CTX80 mg?kg,连续3d,其他组雏鸡肌肉注射生理盐 水,0.2mL?只;IBDV组和IBDV+RBS组雏鸡 肌肉注射接种IBDV病毒悬液(100×ID.),0.1 mL?只,并与其他组隔离饲养.从9日龄起, RBS组,CTx+RBS组和IBDV4-RBS组雏鸡每天 一 次性灌服RBS15Omg?kg,连续5d,其他组灌 服生理盐水.分别在7(CTX和IBDV处理前),14 和21日龄,每组随机取5只鸡,取脾脏和法氏囊制 备单细胞悬液. 1.4脾脏和法氏囊细胞DNA含量,细胞周期和细 胞凋亡率测定 1.4.1脾脏和法氏囊单细胞悬液的制备取雏鸡 新鲜脾脏和法氏囊,剔除结缔组织,用PBS (pH7.2,7.4,0.02mol?L)冲洗,在300目不锈 钢筛网上用注射器芯轻轻研磨,PBS冲洗后滤液 300目筛网过滤,收集细胞悬液,1000r?min离 心8min,沉淀用PBS洗涤2次,用少许PBS重悬细 胞,以体积分数为70的冷乙醇加入细胞中,充分 吹打,4?过夜固定. 1.4.2测定细胞样品染色将固定好的细胞悬液 ,调整细胞浓度为1×10./mL, 离心,PBS清洗1次 加入200LRNase,37?水浴30min.用一步染 色法碘化丙啶染色],4?避光3Omin. 1.4.3细胞DNA含量及凋亡率的细胞流式仪分 析(FCM法?7)染色后的细胞悬液上细胞流式仪 进行分析.按100cell/s流速,每样约测1×10个 细胞,ModfitLT软件分析DNA含量,并经计算机 处理,拟合出细胞DNA倍体,细胞所处分裂时相 (包括G./G期,S期,G/M期)及细胞凋亡率. 1.4.4细胞增殖指数(PI)计算以PI表示细胞增 殖活性,根据流式细胞仪测定的细胞周期比例,用公 式:PI一(S+G/M)/(G./G1+S+G2/M)×1OO 计算. 1.5数据分析 数据以平均数?标准差(32?S)表示.应用 SPSSV13.0软件进行单因素方差分析,用LSD法 进行组间多重比较.P<0.05表示差异显着,P> 0.05表示差异不显着. 2结果 细胞周期在细胞的生长,分化及分裂过程中扮 演着极其重要的角色.本试验结果显示:在7日龄 918畜牧兽医 各组雏鸡尚未实施任何处理时,各组脾脏和法氏囊 不同分裂时相的细胞所占比例和细胞增殖指数 (PI)均无显着差异(P>0.05),脾脏和法氏囊细胞 各组问差异不显着(P>O.05)(数据略),此时,细胞 凋亡率较低,个别雏鸡甚至检测不到细胞凋亡. 2.1米糠多糖对CTX和IBDV诱导免疫抑制鸡脾 脏细胞周期的影响 14日龄,经过CTX处理的CTX组和CTX+ RBS组雏鸡脾脏G期细胞比例显着高于空白对照 组和RBS组(Pd0.05),且二者问差异不显着(P> 0.05),IBDV组脾脏G期细胞比率显着高于IBDV +RBS组(尸d0.05),IBDV+RBS组与空白对照组 间差异不显着(P>0.05);IBDV组G.期细胞比例 显着低于其他5组(P%0.05);CTX组,CTX+RBS 组和IBDV组S期细胞比例以及PI值均显着低于 空白对照组(P<0.05),IBDV+RBS组与对照组, RBS组问无显着差异(P>0.05).21日龄,CTX 组,CTX+RBS组和IBDV组G期细胞高于空白对 照组,而IBDV+RBS组显着低于其它5组(P< 0.05),IBDV+RBS组G期细胞显着高于其他5组 (P<0.05);S期细胞比较结果显示,CTX组显着 低于空白对照组(P<0.05),IBDV+RBS组显着高 于其他5组(P%0.05);各试验组的PI比较,CTX +RBS组高于CTX组(Pd0.05),且与空白对照组 无显着差异(P>o.05),IBDV+RBS组显着高于 IBDV组和空白对照组(P<0.05).详见表1. 表1各组鸡脾脏细胞周期和增殖指数的变化 Table1Changesofspleencellcycleandproliferationindexinexperimentalchicken% 同行数据肩注字母不同表示差异显着(P<0.05),肩注字母相同表示差异不显着 (P>o.05).表2同 Thedifferencebetweendatawiththedifferentletterswithinarowissignificant(P<IO.05), andthesameletterisnotsignifi— cant(P>0.05).ThesameinTable2 2.2米糠多糖对CTX和IBDV诱导免疫抑制鸡法 氏囊细胞周期的影响 14日龄,各组雏鸡法氏囊G期细胞比较,RBS 组显着小于空白对照组(P<0.05),CTX组和CTX +RBS组均高于空白对照组(P<0.05),且二者差 异不显着(P>0.05),IBDV组高于IBDV+RBS组 和空白对照组(P%0.05);各试验组间G期细胞比 例无显着差异(P>0.05);S期细胞和PI值比较, RBS组高于空白对照组(P<0.05),CTX组,CTX +RBS组显着低于空白对照组(P>0.05),IBDV 组显着低于IBDV+RBS组和空白对照组(P< 0.05).21日龄,空白对照组,RBS组和IBDV+ RBS组的G期细胞比例差异不显着(P>0.05),均 明显低于CTX组,CTX+RBS组和IBDV组(P< 0.05);各试验组G.期细胞比例差异不显着(P> 0.05);RBS组S期细胞比例显着高于空白对照组 (P%0.05),CTX组与CTX+RBS组无显着差异 (P>0.05),IBDV组低于IBDV+RBS组(P< 0.05),且CTX和IBDV处理组均明显低于空白对 照组和RBS组(Pd0.05),PI值比较显示,RBS组 和IBDV+RBS组与空白对照组差异不显着(P> 0.05),且显着高于CTX组,CTX+RBS组和IBDV 6期李淑芳等:米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞周期和抗细胞凋亡作用 919 21日龄 21d G0/G1 S G2/M PI 2.55 74.8O? 17.76?2.01 7.44?0.84 25.20?2.55 73.38?4.88 18.90?2.92 7.72?2.20 26.62?4.88 85.00土2.91 7.88?1.43. 7.12?1.66 15.00_--4-2.91 84.78_--4-2.05 7.72?1.15 7.5O?1.15 15.22?2.05 83.58?2.73 10.18?2.09. 6.24?1.09 16.424-2.73 77.64?3.21. 13.684-2.05 8.684-1.47 22.364-3.21 2.3米糠多糖对CTX和IBDV诱导免疫抑制鸡脾 脏和法氏囊细胞凋亡的影响 在试验期内,空白对照组和RBS组脾脏和法氏 囊细胞凋亡率始终差异不显着(P>0.05).各处理 组脾脏细胞凋亡情况:在雏鸡14日龄和21日龄, CTX组和CTX+RBS,IBDV组和IBDV+RBS组 细胞凋亡率均显着高于空白对照组和RBS组(P< 0.05).14日龄时,cTx组和IBDV组细胞凋亡率 分别高于CTX+RBS组和IBDV+RBS组(P< 表3试验鸡脾脏和法氏囊细胞凋亡率 Table3Apoptosisofspleenandbrusacellinchicken 0.05),且IBDV组高于CTX组.21日龄,CTX组 与CTx+RBS组差异不显着(P>0.05),但IBDV 组高于IBDV+RBS组(P<0.05).法氏囊细胞凋 亡情况:14日龄,CTX组高于CTX+RBS组(P< 0.05),IBDV组和IBDV+RBS组差异不显着(P> 0.05),且IBDV处理组显着低于CTX组和CTX+ RBS组(P<0.05).21日龄,CTX组高于CTX+ RBS组(P<0.05),IBDV组高于IBDV+RBS组 (P<0.05).详见表3. 同列数据肩注字母不同表示差异显着(P<O.05),肩注字母相同者表示差异不显 着(.P>O. Thedifferencebetweendatawiththedifferentletterswithinacolumnissignificant(P<O. facant(P>0.05) 一 n g S t o n S r e t t e em a S e l t d n a )) 55 0O 92O畜牧兽医 3讨论 3.1米糠多糖对CTX诱导免疫抑制鸡脾脏和法氏 囊细胞周期的影响 CTX通过肝酶P450水解成醛磷酰胺,与细胞 DNA双链交叉连接破坏DNA,杀死循环周期的细 胞,破坏和干扰母细胞的增殖分化,非特异性地杀伤 抗原敏感性小淋巴细胞,限制其转化为免疫母细胞, 对体液免疫和细胞免疫均有抑制作用].因此,本 试验采用免疫抑制剂量的CTX诱导雏鸡产生免疫 抑制,分析米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细 胞发育周期的影响.试验结果显示,CTX组雏鸡在 14日龄和21日龄,脾脏和法氏囊G期细胞比例显 着高于空白对照组,s期细胞比例和细胞增殖活性 显着低于空白对照组.说明CTX破坏G期细胞, 阻止G期细胞进入DNA复制期,从而使s期细胞 减少,这一结果与CTX毒理作用机理基本一致]. S期是细胞增殖的关键时期,核酸增多是细胞迅速 生长的物质基础,故S期细胞数量的多少能够反映 细胞增殖活性的大小.CTX诱导免疫抑制鸡灌服 RBS组在21日龄时,脾细胞G期和S期细胞增加, 且与对空白对照组无明显差异,说明RBS可促进 CTX损伤脾脏内细胞DNA复制和有丝分裂过程. 但是,RBS对CTX处理鸡法氏囊细胞周期则没有 显着影响,RBS对脾脏和法氏囊表现出不同作用结 果的原因可能是因为法氏囊是鸡的中枢免疫器官, 是B细胞分化成熟的场所,而脾脏是外周免疫器 官,是成熟淋巴细胞聚集的场所,CTx主要对有丝 分裂期母细胞的抑制作用严重,导致cTX对法氏 囊细胞的损伤较脾脏更为严重,试验剂量的RBS不 能使法氏囊在试验期内修复,也有可能是由于RBS 是通过抑制CTX对细胞DNA的烷化作用而发挥 其促进细胞周期活动的. 3.2米糠多糖对IBDV诱导免疫抑制鸡脾脏和法 氏囊细胞周期的影响 IBDV主要以B细胞为靶细胞,感染未成熟的 B细胞或B细胞前体细胞,法氏囊是B细胞分化成 ,法氏囊淋巴滤 熟的重要器官.鸡在感染IBDV后 泡内的B细胞大量裂解死亡和凋亡,网状细胞凋 亡,最终导致法氏囊等器官萎缩_g.IBDV感染后 脾脏,哈德氏腺和盲肠扁桃体的免疫细胞也有不同 程度变性,坏死和凋亡,外周血T,B细胞数量下降, 最终导致免疫功能抑制.试验结果显示,在14日龄 雏鸡,IBDV处理但未灌服RBS组雏鸡的脾脏G期 细胞比例显着高于对照组,G期和S期细胞显着减 少,PI值低于对照组,表明IBDV抑制细胞复制而 阻止细胞进入正常细胞周期,从而导致脾脏淋巴细 胞损伤.21日龄时,IBDV组各细胞周期时相与空 白对照组相当,说明IBDV感染后10d脾脏细胞开 始自主恢复,IBDV+RBS组雏鸡脾脏G期,s期细 胞和PI值显着高于IBDV组,G期细胞高于空白对 照组,表明RBS进一步促进了病毒感染脾脏的 DNA合成;IBDV组雏鸡在14日龄和21日龄,法 氏囊G期细胞增加,s期细胞减少,PI值降低,而 IBDV感染且灌服RBS组的G期细胞和PI值均与 空白对照组相当,表明RBS对IBDV处理雏鸡法氏 囊细胞DNA复制表现出较为持续的促进作用.因 此,通过免疫调节药物来减轻和逆转IBDV对法氏 囊组织的损伤是可能的. 3.3米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞凋 亡的影响 细胞凋亡是在一定生理和病理情况下,机体为 维护内环境的稳定,通过基因调控而使细胞自动消 亡的过程.在机体的免疫系统,自身免疫细胞克隆 的清除和淋巴细胞对靶细胞的杀伤都是细胞凋亡的 结果.CTX可以诱导肿瘤细胞,骨髓细胞,胸腺细 胞,脾细胞等多种机体细胞发生凋亡.IBDV感染 引起脾脏,法氏囊,胸腺等细胞损伤是由于器官组织 细胞的过度凋亡所致口.在本试验中,CTX处理 的2个试验组在14日龄时法氏囊细胞凋亡率高达 2o,至21日龄时仍高达7,9;CTX组雏鸡脾 脏的细胞凋亡在3,6,可见CTX诱导鸡法氏 囊细胞凋亡作用较脾脏更为明显.CTX处理鸡灌 服RBS组,脾脏和法氏囊的细胞凋亡率始终低于 CTX组,但显着高于空白对照组.IBDV+RBS组 脾脏和法氏囊的细胞凋亡率低于IBDV组.说明 RBS对CTX和IBDV诱导的脾脏和法氏囊细胞凋 亡过程有明显的抑制作用,从而减轻CTX诱导和 IBDV感染淋巴细胞的损伤程度.多糖对细胞凋亡 作用机理的报道分为两类,一方面研究认为_】?],银 杏多糖,海藻多糖,当归多糖,姬松茸多糖等多糖能 够通过下调K562白血病细胞,胃癌细胞等肿瘤细 胞的bcl一2基因表达,从而抑制肿瘤细胞的凋亡过 程.另一方面研究认为n.,当归多糖,枸杞多糖, 黄芪多糖等多糖可以上调bcl一2基因表达,下调Fas 基因的表达,降低caspase一3mRNA转录水平,抑制 6期李淑芳等:米糠多糖对免疫抑制鸡脾脏和法氏囊细胞周期和抗细胞凋亡作用 921 铅中毒损伤的脑海马记忆细胞,辐射损伤的肝脏细 胞,胰腺细胞等多种病理损伤细胞的凋亡进程.米 糠多糖抑制CTX和IBDV诱导的淋巴细胞细胞凋 亡过程的分子机理尚待进一步研究. 参考文献: r1]TANIGAMIY,KUSUMOTOS,NAGAOS,eta1. 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