【doc】侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达与纯化

【doc】侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达与纯化 侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达与纯化 3.3治疗方式及效果探讨 3.3.1对于原位复发,由于局部复发导致肠梗阻症状明显,我 们都主张手术治疗.本组病例切除率94.4%,5年生存率12. 3%,3年生存率38.5%,1年生存率76.9%(部分病人正在随访 但未足三年或五年导致数据偏低).可见,二次手术是有价值 的.一部分病人获得根治切除并达到治愈,一部分病人姑息切 除可逆转机体与肿瘤的比势,缓解症状,为化疗放疗创造了条 件,达到延长寿命提高生活质量的目的. 3.3.2对于肝转移,与原发性肝癌不同,患者一般无肝硬化等 基础疾病,肝脏储备功能好,较能耐受手术;另外,肝转移癌血 供复杂”J,栓塞化疗效果不肯定,所以我们对有适应症病例均 争取手术.手术适应症J:单发性肝转移,侵害肝实质少于 25%;原发灶已控制;无肝外转移.大肠癌肝转移自然生存期 很短,一般4—6个月J.而切除后5年生存率达25—40%?. 本组病例5年生存率11.5%,3年生存率26.9%,1年生存率 69.2%(部分病人正在随访但未足三年或五年导致数据偏低), 结果亦远较自然生存期长.对于不宜手术病例,栓塞化疗,无 水酒精瘤内注射,微波固化等措施也可延缓病情进展. 3.3.3对于肺转移,建议手术指征【6:单发性转移或多个转移 集中一个肺叶,原发灶无复发证据,无肺外病灶,心肺功能良 好.大肠癌肺转移切除效果与肝转移相当.本组病例5年生 存率12.5%,3年生存率25%,1年生存率56.3%.对于不宜 手术病例,可予以放化疗为主的综合治疗,经肺动脉栓塞化疗 亦是可尝试途径. 3.3.4对于骨,脑转移,从解剖可知,大肠癌脱落的癌细胞或 栓子,须经过门脉循环,肺循环最后体循环方转移至骨,脑,也 就是有学者提出的”转移级联学说”【】”,也就是说明一旦发现 骨,脑转移,即使无临床证据,也难以否定肝肺转移病灶的存 在.本组病例手术虽有成功个案,但作者观点仍主张以综合治 疗为主. 3.3.5腹膜广泛植和多器官转移皆属不可治愈肿瘤.前者探 查证实后可取药敏检查,指导腹腔化疗,部分病人可延缓病情 和减轻癌性腹水.有学者提出行全腹膜切除并报导成功个 案,但经验尚少,效果难以莽下判断. 3.4如何防治手术后复发和转移?深入认识大肠癌的生物 中国临床医芮研究毒志20o3年总第96期 学特性,合理选择手术方式,保证根治的基础上再考虑功能的 保存;?加强无瘤观念的培养和无瘤操作的培训;?健全术后 随访,有效及时的复查是复发和转移早期发现,二次切除 的保障;?加强多学科之间的合作沟通,使患者有一个合理的 治疗;?临床上合理应用综合治疗措施,减少复发机会,如 术中肠腔化疗可提高大肠癌根治术疗效和减少肝转移口引,术后 腹腔化疗也证明是有效而且安全的口引.?转变观念,以积极态 度对待肿瘤的复发转移,国内已开创”复发肿瘤外科学”,目的 是减少因医疗者的观念而使患者失去重获新生的机全. 参考文献 1.金德,李革,刘在文.局部复发性大肠癌的再次手术治疗.延边大学医 学,2000;23(2):134,135 2.SardiA,MintonJP,NierodaC,eta1.Multiplereoperationincurrenteolo— re~1]carcinoma.Cancer,1988;61(9):1912 3.MurrayD,Hreno,Duttonj,eta1.Progosisineoloncancer.apathologicre— asses~ent.ArchSurg,1975;110:908-913 4.刘超,刘宝善,燕锦,左明.影响大肠癌术后复发因素的探讨.大肠肛门 病外科杂志,2002;8(1):7,8 5.刘晖,万德森,吴秋良等.大切片上直肠癌远端壁内扩散的研究.中华 肿瘤杂志,2001;23(1):50-52 6.刘宝善,燕锦,左明,等.大肠癌的复发与转移.大肠肛门病外科杂志, 2002;8(1):59-61 7.孙文兵,肖小炜.导管灌注化疗加化学栓塞治疗大肠癌肝转移48例, 医药导报,1999;18(5):328-329 8.万德森.结直肠癌肝转移治疗的进展.癌症.1997;16(1):1,3 9.XiaoXW.Valueofselectivech~xnnbolizationinthetreatmentofhepat. icmet~tsse8ineolorectalcarcin~na.WJG,1998;4(2):38-41 1O.王舒宝.结肠癌术后复发及肝转移的外科治疗.中国实用外科杂志, 2oo2;22(4):207-209 l1.WdchJP.DonaldsonGA.clinicalcorrectionofanautopsystudy’of r~2ulTenteolorectalcancer.AnnSurg,1970;189(4)..496 12.王舒宝.大肠癌术后复发治疗方案的选择.中国实用外科杂志.2002; 22(6):329-331 13.万德森,李国材.詹友庆等.应用氟尿嘧啶肠腔化疗辅助结,直肠癌根 治术的远期效果.临床外科杂志,1994;2(2):71 14.潘琦,陈福春,林加宝.大肠癌术后腹腔化疗的临床价值.河南肿瘤学 杂志,2001;14(1):31--32 侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达与纯化 广东省深圳市福田区人民医院检验科(518033)刘玢 第一军医大学珠江医院检验科(510282)龙军 摘要目的:表达和纯化侵袭性大肠埃希氏菌毒力蛋白IpaC,为进一步研究侵袭性大肠埃希氏菌的发病机制莫定基础.方法:将含有ipaC基因的 pET32a—ipaC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(E3),在异丙基硫代 一B—D半乳糖苷(I啉)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行 sDs—PAGE 鉴定,并采用QIAexp~st1M蛋白纯化系统纯化目的蛋白.结果:诱导后 的表达产物经6一PAGE发现有一相对分子量约为63kD的条带,其含 量约占总蛋白量的1396,对目的蛋白进行纯化后发现,以400mmol/L 咪唑洗脱液洗脱时效果最为理想,纯度可达9096以上.结 论:pE’qB2a—ipaC重 组表达质粒转化大肠杆菌13121(XDE3),可稳定,高效地表达目的蛋 白;QIAexpresskml蛋白纯化系统是一种简便,高效的纯化系统,可获得 高纯度 的目的蛋白. 关t词侵袭性大肠埃希氏菌毒力蛋白(IpaC)原核表达蛋白纯化 Ab删Obieetive:Toa印麟 andpfyIpacproteinofEntero—invasiveE.eoli,inordertostudythepathogmesi sofEntero—invasiveE.eoli.Methods: 中国.I床l羞芮研究毒志2003年忌第96期9623 Theprokaryoticexpress~plamaidpEI32a—ipaCwaSconstructedandcordomaedintoE.coliBL21(XDE3).TheengineeredbacteriawereinducedtO唧 ress IpaCbyIPTG.theIpaCproteinwasdetectedandpurifiedrespectivelybySDS —PAGEandQIAexpressionissystem.Result:Themolecularoffusionprotein wasabout63KD,andtheexpressionoffusionproteinwasreacheduptO13%ofthetotalproteinofE.colib121(~DF_.3).Thec(mtentoffusionproteinwasat alevelof90%oftotalproteinwhenthe~trationofimidamleWas400mmol/L.Conclusion:TherecombinantplamaidpE’T32a—ipaChasbeenexpressed highlyandsteadilyinE.eoliBL21(kDE3).ThesystemofQIAexpressionistTMtOpurifyproteinissimpleandhighefficiency. 1sEntero—invasiveE.colivirulenceprotein(IpaC)prokaryoticexpressionproteinpurification 侵袭性大肠埃希氏菌(Entero—invasiveE.coli,EIEC)是一1.2.3表达产 物的纯化采用QIAexpressionistTM蛋白纯化系 种肠道侵袭性细菌,该菌株自1967年被Sakaiaki确认以来,统进行纯 化,操作方法按照说明书进行.用lml的resinslurry 研究逐渐深入,到目前已发现有l2个”O”血清型,一些曾引起和4ml 的超声破菌后上清充分混合,200rpm,4”C,60min.将混 过腹泻的流行.在散发的腹泻病中,由EIEC所引起的也有相合液过 柱,收集流出液.4mlwashbuffer(50mmol/LNail2I:~),+, 当的比例.此外,EIEC还是公认的食物中毒病原菌,国内于 300mmol/LNaCI,200mmol/L咪唑,pH8.0)洗涤3次,并分别收 l984年首次报道了EIEC引起的事物中,可见EIEC是一集洗涤液.0. 5mlElutonbu(50舢n0l/LNail2I:~),+,300 种较重要的腹泻病原菌,但EIEC具体的发病机制仍不十分清 LNaCI,400movL咪唑,pH8.0)洗脱4次,并分别收集洗涤 楚.目前的研究认为,EIEC的毒力取决于其侵入细胞的能力,液.将上述的收集液分别进行SDS—PAGE分析,观察蛋白纯 其侵袭力与细菌的外膜蛋白有关,Sansonetti和Hale等先化结果.将纯化后的蛋白在冻干机中冻干,保存备用. 后证实EIEC的侵袭性质粒分子量为120—140Md,该质粒可编2结果 码15种以上外膜蛋白,控制多种毒力因子,其中毒力蛋白IpaC2. 1重组质粒毒力蛋白I阳c的导诱表达以及表达产物的鉴定 是与侵袭过程中不可缺少的外膜 . 蛋白.所以本实验选择ipaC分析将重组质粒 p脚2一ipac转化大肠杆菌BL21(XDE3), 为靶基因,用基因工程的构建苎要组表达质,搴达竺在IP1,G诱导下表,分别对导前后的表达产物进行sDs一化毒力蛋白 Ip,paC功能的研究奠定基础,从而进一步了PAGE及考马斯亮蓝染色 ,可在相对分子量63KD处见一明显 解堂机制.的诱导表达带(图1).对此诱导表达带进行黑度密度自动扫描材方 …,...一,.….分析,此处表达蛋白量约占总菌体蛋白量的l3%. 1.1质粒和菌株:EIEC,大肠杆菌BL21(XDE3)为本科……一,…………一一…., 室保存;表达质粒pET32a由第一军医大学寄生虫学教研室馈 赠.主要试剂:QIAexpressionis蛋白纯化系统为德国Q. GEN公司产品;异丙基硫代一B—D半乳糖苷(IPTG)为华美生 物工程公司产品;咪唑为购自Sigma公司;其它主要生化试剂为 美国Sigma公司产品或国内AR级产品. 1.2方法 1.2.1表达载体的转化与基因产物的表达将表达质粒 pE232a-ipaC转化用氯化钙处理法得到的感受态大肠杆菌 BL2l(DE3),将转化液涂于含氨苄青霉素的LB平板上,37? 过夜培养.挑取单菌落接种于20ml含氨苄抗性的LB培养基 中,37?,200dmin振摇过夜.取3ml过夜培养物接种入100ml 的含氨苄抗性的LB培养基中,37?以200r/min振摇,测定A60o 值,直至A60o值到达0.4,0.4(勿超过0.6).加入IPTG(终浓 度为0.4/anol/L)进行诱导,诱导4h后收菌.将菌液在4”C, 5000g,离心5min,弃上清.将沉淀物用Lysisbuffer(50mmol/L NaI-hPO,,300mmo~LNaCI,lOmmol/L咪唑,pH8.0)悬浮,反复 冻融几次后,在冰浴中以中等强度超声破菌,每次45s,每次间 隔45s,共l0次.破菌后,4”C,15000g,离心25min,收集上清液 备用.沉淀用同样的Lysisbuffer溶解备用. 1.2.2表达产物的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS—PAGE)检测参照文献进行.收集IPTG诱导前与 诱导后4h的菌液各lml,高速离心后分别用100t~ITE缓冲液悬 浮,超声破菌离心后分别取上清和沉淀各100~1,在上述样品中 各加入100的上样缓冲液混匀,100”(2水浴3min,点样,25mA 恒流通电进行SDS—PAGE.电泳后以考马斯亮蓝染色30rain, 然后用脱色液脱色,观察结果. 图1重组蛋白的SDS—PAGE分析 Rg1.SDS—PAGEanalysisofthefusionprotein M.Marker;1.E.colistrainBL21(~DE3)withoutind~tion;2.BL21 (XDE3)afterinduction;3.pET32a/BL21(~DF.3)withoutinduction;4. pE’I32a/BL.21(kDE3)afterinduction;5.pE’I32a—ipaC/BL21(~3E3)with— outinduction;6.pET32a—ipaC/BL(~DF.3)afterinduction;7.I】n”0mbi. narltplasmidwithoutinduction;8.unreeombinantplasmidafterinduction. 2.2重组质粒表达产物的可溶性鉴定以及纯化结果将超声 破菌后上清和沉淀分别进行SDS—PAGE,发现目的蛋白同时 存在于上清和沉淀中,表明该目的蛋白的表达有部分为可溶性 表达,还有一部分蛋白形成了包涵体.如果仅从上清中提取目 的蛋白,既可保证蛋白的天然活性,还可免去蛋白复性这一步, 简化了纯化的过程.将纯化后收集的洗脱液进行SD6一PAGE, 发现在眯唑浓度为40(0m~L时纯化效果较好.对纯化的蛋白 进行黑度密度自动扫描分析,蛋白的纯度达到90%以上. 9624 3讨论对于大多数病原菌而言,其致病过程是一个非常复 杂的综合过程,主要有两类基因参与:一类是致病菌和非致病 菌所共有的参与基本生理过程的看家基困;另一类则是致病菌 所特有的毒力基因,包括编码毒索,粘附因子,侵袭因子等一系 列基因.后者常位于转座子,质粒和噬菌体等可移动的遗传物 质上. 图2纯化蛋白的SDS一E分析 Rg2S[)6一PAGEanalysisofpurificationprotein 1.pET32a—ipaC/BL21(kDF.3)afterinduction;2.pET32a—il~C/ BL21(E3)lysissupernarantaftersonication;3.pET32a—ipaC/BL21 ()33E3)lysisprecipitateaftersonication;4.supernanantafterintegration;5. Washingliquid;6.Purificationprotein. EIEC是一种肠道侵袭性细菌,它侵入肠上皮细胞,在细胞 内繁殖引起细胞变性,使肠上皮出现损伤,导致粘膜固有层发 生炎症,溃疡,出血,但是具体的发病机制并不十分清楚.随着 微生物遗传学的发展,认为致病性的EIEC均具有一个120— 140Mu的大质粒,该质粒与编码志贺氏菌侵袭力的大质粒高度 同源,分子量也相近,丢失了质粒的菌株毒力也随之消失,成为 无毒株.EIEC介导侵袭的基因位于大质粒一个25kb的Barn— HI片段上】.该质粒可编码一组侵袭性毒力蛋白(Ira),它们 分别是ImA,Ima,IraC,IraD,是细菌侵入肠上皮细胞所必需 的.IDa蛋白抗体有被动免疫保护性作用,可阻断EIEC侵入肠 上皮细胞,细菌不能侵入肠上皮细胞,即不具有毒性,说明Ira 蛋白在抗感染过程中有重要作用J.但是这些毒力蛋白的具 体功能和作用机制还不是很清楚,所以本实验选择其中一个与 侵袭性明显相关的基因iraC为靶基因,用基因工程的方法构建 其重组表达质粒,表达并纯化毒力蛋白IraC,为IraC功能的研 究奠定了基础,从而进一步了解EIEC的发病机制. 本实验所选择的pET表达质粒系统是近年来出现的一种 含1_7启动子的原核表达系统,该系列质粒中含有1_7启动子, 多克隆位点,氨苄青霉索抗性基因,表达产物的N端和(或)C 中国临床医芮研究毒志2003耳总弟96期 端含有6个连续的组氨酸等.其中1_7启动子可高效表达外源 蛋白,所表达的外源蛋白质量一般占总蛋白量的25%以上,甚 至达到细菌总蛋白量的50%[91.由于pET表达质粒系统的高 表达性,越来越广泛地应用于外源蛋白量的表达.本实验中外 源蛋白的表达量不是很高,约占总蛋白量的13%.可能是因为 所表达的外源蛋白是一种侵袭性毒力蛋白,对宿主菌存在着一 定的损害. 另外该系列质粒表达的外源蛋白都含有6个连续的组氨 酸,它们形成的特殊空间构架,对金属螯合层析介质可以产生 特异性吸附,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化.本实验 中所采用的QIAexpressionistTM蛋白纯化系统就是根据这种原理 制成的.采用Ni—NTA螯合层析介质,以咪唑洗脱表达的外源 蛋白.纯化过程非常简便,而且纯化蛋白的纯度可达到90%以 上.所以该蛋白纯化体系是一种简便,高效的纯化系统. 因此,本实验选择EIEC毒力质粒编码的侵袭性毒力蛋白 基因(iraC)作为研究对象,利用基因工程的方将该基因定向克 隆到原核高效表达质粒pET32a中,并将重组质粒转化表达宿 主菌BL2l(),从而稳定,高效地表达毒力蛋白IpaC.经过 QIAexpressionistTM蛋白纯化系统得到了高纯度的融合IraC蛋 白.可进一步研究该毒力蛋白的生化特性及免疫学功能,并进 行体内外侵袭性功能研究,可以更好地了解EIEC的发病机制. 同时由于IpaC蛋白具有种属特异性,制备出该蛋白的单克隆抗 体,从而为EIEC的快速诊断提供了基础. 参考文献 1.Escherichiacolidiarrhoea:reortofasubgroupofthescientificWorking Grouponepidemiologyandetiology.WHO/~EPG/1967;79:1 2.张绪团,等.侵袭性大肠杆菌引起食物中毒调查.微生物通报, 1985;42(6):266 3.,~ansonettiPJela1.Shigellasonneipla~rads:evidencethatalargeplasmid isnet2es~aleyforvirulence.InfectImmun,1981;34:75 4.nS.1Ti$JR.eta1.High—molecularweightplamaidcarelateswithes- cherichiacolienteroinvasive.InfecthTIITIun,1982;37:1295 5.I-hieTLetal,Geneticbasisofvirulenceingellaspecies.Mierobiol Rew,1991;55:206 6.SambrookJ,等主编.分子克隆实验指南[M].金冬雁,等译.第2版.北 京:科学出版社,1992.880,886 7.徐建国主编.分子医学细菌学[J].北京:科学出版社,2000.145 8.徐景野,等.侵袭性大肠杆菌实验研究进展.中国卫生检验杂志,2000; 10(4):507--509 9.梁国栋主编.最新分子生物学实验技术[J].北京.科学出版社,2001. 282 艾迪注射液联合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌的疗效观察 广东省广州市肿瘤医院?广州医学院肿瘤临床研究中?~(510095)陈文晟马磊金川 李志彪李卫东 摘要目的:观察艾遭注射液联合FDH方案(羟基喜树碱+5一氟脲嘧啶+甲酰四氢叶酸钙+顺铂)治疗中晚期非小细胞肺癌与单用FDH方案治疗 中晚期非小细胞肺癌的疗效及毒副作用.方法:治疗6O例非小细胞肺癌患者,随机分为两组.以艾迪注射液联合FDH化疗方案作为治疗组,单用 FDH化疗方案作为对照组.经过统计分析,观察两组治疗方案的治疗效果及毒副作用.结果:两组的治疗效果无显着性差异(P>0.05).毒副作用