从牛胆汁中提取牛磺胆酸的工艺研究

从牛胆汁中提取牛磺胆酸的工艺研究 [摘要] 目的:建立从牛胆囊胆汁中分离提纯天然牛磺胆酸的工艺。方法:采用盐 析、萃取、脱水等生物化学方法和吸附柱层析法及薄层层析色谱法从牛胆汁中分离纯化 牛磺胆酸。结果:所得产品经薄层层析法、红外光谱扫描法证实为牛磺胆酸。经薄层扫 描法测定含量，牛磺胆酸平均纯度达97.5%;提取方法回收率为61%。结论:建立了从 牛胆汁中提取牛磺胆酸的工艺，为进一步开发动物胆汁及利用牛磺胆酸奠定了基础。 [关键词] 牛胆汁;牛磺胆酸;提取;工艺 [中图分类号] R284.2 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721(2011)05(c)-,11,, 2 Study on extraction techniques of taurocholic acid from cattle bile LIU Xinyuan1,2, LI Peifeng1*, GUAN Hong1 1.College of Animal Science and Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia, Huhhot 010018, China; 2.Baotou Medical College, Inner Mongolia, Baotou014060, China [Abstract] Objective: To establish the technological process of the isolation and purification of natural taurocholic acid from the gallbladder bile of cattle. Methods: The method of salting out, extraction, dehydration and other biochemical methods were adopted and column chromatography. Results: The products obtained were proved to be the taurocholic acid based on the scanning method of thin layer chromatography and infrared spectrometry. With the TLC-scanning method, the average purity and the average recoveries of taurocholic acid was 97.5% and 61% respectively. Conclusion: Extraction techniques of taurocholic acid from cattle bile is set up, to further the development and use of animal bile, taurocholic acid basis. [Key words] Cattle bile; Taurocholic acid; Extraction; Techniques 牛磺胆酸(taurocholic acid，TCA)是牛胆汁中的主要胆汁酸，也是其有效成分之一。它是由胆酸和牛磺酸结合形成的一种结合型胆汁酸，分子量为515.6。TCA为白色粉末，无臭味，可溶于水。TCA广泛存在于牛、羊、蛇、兔等动物的胆汁中，是重要的有效成分。对其药效学研究明，该物质具有利胆、镇咳、祛痰、平喘的作用，同时具有杀菌抗炎等作用[1]。对心血管系统亦有影响，可以降血压、降低心脏收缩幅度及频率，有报道称其对癌症也有一定的治疗作用[2]。可见牛磺胆酸是具有开发应用前景的药物。 目前对于牛磺胆酸的生产，大都以合成为主。而从动物胆囊胆汁中直接提取纯化的方法还比较少，因此笔者研究了从牛胆汁中提取纯化牛磺胆酸的方法，从而更合理地利用来源丰富的牛胆汁。从牛胆囊胆汁中提取纯化牛磺胆酸并提高其纯度和回收率，为将来更加合理有效地开发利用动物胆汁及大规模工业化生产提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药品与试剂 牛磺胆酸品，Sigma公司;乙醇、三氯甲烷、正丁醇、氯化钠、无水硫酸钠、氢氧化钠、盐酸均为分析纯;柱层析硅胶，化学纯，青岛海洋化工厂，批号20070309。 1.1.2 主要仪器设备 RE52-4旋转蒸发仪，上海沪西分析仪器厂;CS-930双波长薄层扫描仪，日本岛津公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司;TDL-5-A台式离心机，上海科学仪器公司。 1.2 方法 1.2.1 结合胆汁酸粗品的制备 1.2.1.1除去蛋白质。取新鲜牛胆汁400 ml双层纱布过滤，加入胆汁体积4,5倍量的95%乙醇均匀搅拌，静置30 min后，4 000 r/min，4?离心20 min。得到黄绿色上清液。 1.2.1.2除去色素。将上清液加入适量活性炭，低温加热搅拌10 min后自然冷却。4 000 r/min，4?离心20 min。得到无色上清液。 1.2.1.3 除牛磺去氧胆酸及盐析。将上述所得液体用旋转蒸发仪在80?以内浓缩回收乙醇。浓缩后的液体静置冷却，用稀盐酸调节溶液pH在6.0,6.2，过滤除去牛磺去氧胆酸形成的沉淀。再用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为7.4，这时加入适量氯化钠搅拌至出现白色沉淀物，4?放置过夜。 1.2.1.4 萃取、浓缩及脱水。用氯仿?正丁醇=3?2的混合液溶解盐析物，充分溶解后，加入少量蒸馏水，用浓盐酸调节水相pH,1，用分液漏斗反复萃取，蒸馏回收有机溶剂，得到黏稠液体。再用无水硫酸钠过滤除去其中少量的水分，得到胆汁酸粗品。 1.2.1.5 技术路线为: 1.2.2 牛磺胆酸的纯化 将所提结合胆汁酸的粗品缓慢加入长60 cm，内径5 cm的硅胶层析柱上，固定相为硅胶G，流动相为体积比为3?2的氯仿和正丁醇。在常温常压下，线速度为μ=10.5 ml/min，同时收集流出液。用紫外分光光度计在λ=460 nm(此处牛磺胆酸有最大吸收值)处检测吸收值，并收集有吸收值的液体，用薄层层析板进行定性检测，用微量进样器吸取5,10 μl的TCA标准品及待测液进行点样(以硅胶G为固定相，展开剂为氯仿?异丙醇?醋酸?水=30?30?4?1，上行展开，显色剂为20%的硫酸和3.5%的磷钼酸)。斑点颜色为蓝紫色，出现两个或两个以上斑点表明不纯。以标准品作为对照，收 集显色时只有牛磺胆酸一个点的液体，置于旋转蒸发仪中浓缩，回收流动相氯仿和正丁醇，收集白色结晶冷冻保存，即为牛磺胆酸的纯品。 1.2.3 薄层层析定性检测TCA样品 以TCA标准品为对照，收集的白色结晶为TCA样品，在薄层层析板上点样进行定性分析。固定相、展开剂和显色剂同上。 1.2.4 薄层扫描法定量检测TCA样品 用CS-930双波长薄层扫描仪对显色后的薄层层析板进行全波扫描，确定牛磺胆酸标准品和待测样品的最大吸收波长都是400 nm。在λ=400 nm处用薄层扫描仪对TCA样品进行扫描，用峰面积计算含量，定量检测牛磺胆酸的纯度。3个样品取均值。 1.2.5 回收率的测定 从同批次胆汁酸粗品中取等量的两份，其中1份加入0.5 g牛磺胆酸标准品，两份都用层析柱进行纯化，分别收集所得牛磺胆酸进行计算。 试验进行3次，计算回收率取平均值。 2 结果与分析 2.1 薄层层析法定性分析结果 由图1、2可知，TCA样品与TCA标准品的Rf值一致，可初步认定分离提取的样品为牛磺胆酸。 2.2 薄层扫描法定量分析结果 经薄层层析板点样显色后，用薄层扫描仪定量分析检测出牛磺胆酸的纯度平均为97.5%。 2.3 回收率测定结果 试验进行3次，回收率取平均值，结果见表1。 由表1可知，TCA提取回收率为61%，回收率较高，工艺稳定可靠。 3 讨论 本实验是从牛的胆囊胆汁中提取牛磺胆酸，因为大多数胆汁酸在展开剂为氯仿?正丁醇?醋酸?水=30?30?4?1时，Rf值相差较大可以分开，所以运用同样的方法可以从牛或其他富含牛磺胆酸的动物胆汁中提取出牛磺胆酸。若实验室条件允许，可以用梯度流动相不断的洗脱层析柱，可将胆汁中多种胆汁酸进行分离纯化并收集，可充分利用胆汁。 该提取方法具有多方面的优点和应用前景。其原材料丰富，设备简单，操作方便，试剂可回收等[3-4]。这为今后更有效地利用牛磺胆酸及动物胆汁有效成分提供了依据。 [参考文献] [1]张豁中,温玉麟.动物活性成分化学[M].天津:天津科学技术出版 社,1994:1569-1632. [2]刘养清,刘二保.动物胆汁理化特性及药用[M].北京:化工工业出版社,2002:90-95. [3]赵珍,李培锋,李慧峰.牛羊胆汁中甘氨胆酸提取纯化工艺研究[J].内蒙古农业大学学报,2006,27(2):9-11. [4]李少春,李培锋,关红.天然甘氨胆酸和牛磺胆酸的提取研究[J].安徽农业科学,2009,37(15):6832-6834.