基因工程的定义

基因工程的定义 1. 基因工程的定义:在体外对不同生物的遗传物质,基因,进行剪 切、重组、连接～然后插入到载体分子中,细菌质粒、病毒或噬 菌体DNA)～转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖～并 达出基因产物。 2. 碱抽提法提取质粒DNA 原理和步骤 3、DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法 2. 琼脂糖凝胶电泳估计 原理: 3. DNA的凝胶电泳的原理 相同分子量的DNA: 闭合环状卷曲超螺旋迁移最快～ 线性分子次之～ 伸展开环状最慢。 4. 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,4—8bp,～并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 功能 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 自我保护作用。用来保护宿主不受外来DNA的感染～可降解外来的DNA～从而阻止其复制和整合到细胞中。 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 II I III 内切酶与甲基化三亚基双功能二亚基双酶分子 酶分子不在一起 酶 功能酶 4-6bp 大多数5-7bp 识别位点 二分非对称 非对称 为回文对称结构 无特异性 在识别位在识别位点中或 切割位点 至少在识别位点下游 靠近识别位点 点外1000bp 24-26bp 限制反应与 分开的反应 互斥 同时竞争 甲基化反应 限制反应是 No Yes Yes 否需要ATP 粘性末端,sticky ends～cohensive ends,含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型:5’端凸出,如EcoR I切点,,’端凸出,如Pst I切点, 限制性内切酶识别的序列 1. 长度:一般为4-8个碱基～最常见的为6个碱基。 • 4个碱基:sau3A? • 5 个碱基:EcoR? • 6个碱基:EcoR? • 7个碱基:BbvC? • 8个碱基:Not? 限制酶识别序列的结构 大多数为回文对称结构～切割位点在DNA两条链相对称的位置。 有些识别非对称序列～ 有些可以识别多种序列～ACC?识别序列是GT , MKAC,可以识别4中序列, 有些识别的序列呈间断对称～对称序列之间含有若干任意碱基 位点偏爱 (site preferences) 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割～即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 酶切反应条件 缓冲液～反应温度～反应时间～反应中止 星星活性(star activity) 在极端非条件下～限制酶能切割与识别序列相似的序列～这个改变的特殊性称星星活性。 引起星星活性的因素 ? 高浓度甘油,>5%, ? 酶过量,>100U/,g, ? 低离子强度,<25mM, ? 高pH (>pH8.0) ? 有机溶剂 PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺,dimethylacetamide,、二甲基甲酰胺,dimethylformamide,、sulphalane ? 用其它二价阳离子代替Mg++ Mn++～Cu++～Co++, Zn++ 不同的酶对上述条件的敏感性不一样 PstI比EcoRI对高pH更敏感～但后者对甘油浓度更敏感 同裂酶,Isoschizomers) 识别相同序列的限制性内切酶～但它们的切割位点可能不同。 同尾酶(Isocaudamers, 识别的序列不同～但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl ?、Bcl I、Xho ?等 影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项 1. DNA的纯度 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) T4DNA 连接酶的功能 主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA 5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键～使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。 DNA聚合酶 3’,5’外5’,3’外聚合持续能 切酶活性 切酶活性 速率 力 大肠杆菌DNA聚合酶 低 有 中 低 T4DNA聚合酶 高 无 中 低 T7DNA聚合酶 无 快 高 化学修饰T7DNA聚合酶 低 无 快 高 遗传修饰T7DNA聚合酶 无 无 快 高 逆转录酶 无 无 低 中 Taq DNA聚合酶 无 有 快 高 大肠杆菌DNA聚合酶 I ?一条单链多肽。 ?5’,3’外切酶活性位于N端。 5’,3’DNA聚合酶活性 3’,5’外切酶活性 在没有dNTP的情况下～外切活性占主导地位～而当存在足够的dNTP时～外切活性和合成活性将处在动态平衡中～结果使得dsDNA成为平末端。 Klenow fragment 具有5’,3’聚合酶活性和3’,5’外切酶活性。,失去了5’,3’外切酶活性,。 在蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶,裂解, 从全酶中除去5’—3’外切活性片段～而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响。 逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶,RNA指导的DNA聚合酶,。 来源 RNA肿瘤病毒。 AMV的性质 二链多肽(62kDa/94kDa) 具5’ ?3’DNA聚合活性 具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA) 碱性磷酸酶 该酶可从DNA分子的5’端去除磷酸基 碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5’磷酸～以防止自身连接。 核酸分子杂交定义 用标记的已知DNA或RNA片段,探针,来检测样品中未知核酸序列～通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合～再经显影或显色的方法～将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测的核酸序列～可以是克隆的基因片段～也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。 A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度,melting temperature,Tm)～此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。 Tm=,G+C,%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响～离子强度低～熔解温度也低。 核酸探针 1.定义: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 为确定探针是否与相应基因组DNA杂交～有必要对探针加以标记～ 以便在结合部位获得可识别的信号。 探针的分类: 据制备方法及核酸性质不同～可分为: 1 基因组DNA探针 2 cDNA探针 3 RNA探针 4 寡核苷酸探针 Southern 印迹杂交 限制性内切酶酶切后,EDTA～ 65?灭活限制酶, 琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段 变性液,碱变性, 凝胶上DNA变性 预杂交 Tris缓冲液 中和 杂交 高盐下 放射自显影 DNA转印至NC膜 结果分析 烘干、固定 Taq DNA 聚合酶 1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶～代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断,37 oC )～PCR技术才进入实用阶段 PCR基本原理 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 1、变性:通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂～双链解离形成单链DNA 。 2、退火:当温度突然降低时～反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸:在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸,dATP、dCTP、dGTP、dTTP,及Mg2+存在条件下～5’?3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 PCR的特点 1,特异性强 2,敏感性高 ,3,快速 ,4,简便 ,5,可以扩增mRNA Pfu DNA Polymerase 有3 ’-5’的外切酶活性～5’-3’外切酶活性。 是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。 但PCR产物为平端: 引物设计: ,1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 ,2,引物长度以15-40 bp为宜。 ,3,碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 ,4,引物内部避免形成二级结构。 ,5,两引物间避免有互补序列。 ,6,引物3’端为关键碱基,5’端无严格限制。 重组DNA技术基本原理 基本原 理 目的基因的获克隆载体的选择和构 取 建 外源基因与载体的连DNA导入受体 接 菌 克隆基因的表达 重组体的筛 选 目的基因的获取 1. 化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) ,见第22章, 在基因工程操作中～把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 载体的选择标准 能自主复制, 具有两个以上的遗传标记物～便于重组体的筛选和鉴定, 有克隆位点,外源DNA插入点,～常具有多个单一酶切位点～ 称为多克隆位点, 分子量小～以容纳较大的外源DNA。 外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 2. 平端连接 3. 同聚物加尾连接 4. 人工接头(linker)连接 重组DNA导入受体菌 感受态大肠杆菌的制备 用CaCl2处理大肠杆菌～能增加膜的通透性 感受态细菌:是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。 重组体的筛选 感受态细胞: • 经一定方法处理(如CaCl2处理)后具备接受外界DNA能 力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株。,容易接受外 源DNA的状态, • 方式: 转化、转染、感染 , 转化:以质粒为载体～将携带外源基因的载体DNA导入受体细 胞。 , 转染:重组DNA导入真核细胞的过程。 , 感染:以噬菌体为载体～在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒～ 使其感染受体菌 重组体的筛选 1.遗传检测法 抗药性标志的选择 标志补救,ß-半乳糖苷酶法, 2. 电泳检测法 3.PCR检测法 4. 菌落杂交筛选法 5. 免疫化学检测法 6. DNA序列检测 E.coli表达体系优势: 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速～培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达 不足之处: 1,缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。 2,缺乏表达蛋白质复性系统～表达蛋白无特异性空间结构。 3,表达产物不稳定～易被细菌蛋白酶降解。 4,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 5,很难表达大量可溶性蛋白 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1. 细胞质中表达 ,1,包涵体,inclusion body, 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 2. 周质中表达 3. 胞外表达 二、克隆载体 , 复制基因(replicator) , 选择性记号 , 克隆位点