【doc】去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容性研究

【doc】去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容性研究 去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容 性研究 中华实用医学2002年第4卷第20期JournalofChinesePracticalMedicine,2002,Vo1.4,No.20’1. ?论着? 去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容性研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科430022 刘维钢杜靖远郑启新郭晓东傅刚 [文章编号]l562—903l(2002)一20—000卜03 摘要目的:了解去抗原异种松质骨(AEXCB)对骨髓基质l下细胞增殖的影响,为细胞移植载体的选择提供依据.方法:取 新生小牛股骨下端松质骨经物理化学处理,制成去抗原异种松质骨载体,与兔骨髓基质rT细胞(BMSC)体外复合培养,通过扫 描电镜,MTT测试法,考马斯亮蓝和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法,观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长,增殖及功能达 的影响.结果:骨髓基质干细胞能在AEXCB材料上粘附,增殖,细胞形态良好.去抗原异种松质骨与BMSC作用后ALP活性的 吸光收(oD)值,与对照组比较无显着差异.结论:去抗原异种松质骨材料无细胞毒性作用,具有良好的细胞相容性.可用作 骨组织工程的支架材料. 关键词去抗原异种松质骨骨髓基质干细胞生物相容性骨组织工程 Invitrostudyofcompatibiltyofantigen?extractedxenogeneiccancellousbonewithbonemarrowstromalstemcells DepartmentofOrthopedics,UnionHospital,TongjiMedicalCollegeofHuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan.Liu Weigang,DuJingyuan,ZhengQixin,etal,430022 AbstractObjective:Toinvestigatetheeffectoftheantigen—extractedxenog eneiccancellousbone(AEXCB)ontheproliferation bomcalffernroaldist ofbonemarrowstromalsteincells.Methods:Thenew— alcancellousbonewassubjectedtophysicaland chemicaltreatmenttoformantigen—extractedxenogeneiccancellousbonec arrier.Thebiomaterialswerecoculturedwithrabbitbone InalTOWstromalsteincells.4and8dayslater,SEM,M不 assayandalkalinephosphatase(ALP)activitywerecarriedouttoobserve theeffectofAEXCBoncellgrowth,proliferationandfunctionalexpression.Results:Cellsattachment,proliferationandgood morphologyofBMSCcanbeobservedonAEXCB,TheODvalueofALPactivityproducedbyBMSCwassimilartothatofthe contro1.Conclusion:Antigen—extractedxenogeneiccancellousbonehave noanycytotoxicefl-~ct.andithavegoodcellular compatibility.SotheAEXCBisfitforthedemandsofthevehicleofcellcultureintissueengineering,itisagoodscaflbldmaterialfor bonetissueengineering. KeywordsAntigen—extractedxenogeneiccancellousboneBonemarrowst rolnalsteincellsB0compat_h1tyBonetissue engineering 骨缺损的修复是骨科的难之一,因此,国内 外学者都在研究骨的替代材料以解决这个难题. Crane等…全面提出骨组织工程概念后,引起广大学 者的关注.骨组织工程学应用中,种子细胞及细胞 载体的选择是极其重要的问题.其中生物材料具有 不可替代的主要作用,它能为细胞的长入,粘附, 分化和增殖提供良好的三维空间.因此,理想的生 物材料应具有良好的生物相容性,骨传导性,一定 的骨透导性,可生物降解,有利于细胞贴附和血管 长入,以及一定的抗负荷能力,对细胞,组织等应 无毒性,无刺激性,无致畸突性,可加工性及可消 毒性.异种松质骨具有天然密集微孔,大小较均匀, 微孔的直径更接近理想的微孔直径.随着免疫学, 生物化学的发展,经一系列化学处理后,其内的免 疫原性成份基本上被去除,故一般不会引起排斥反 应.因此,本实验选用天然异种松质骨经理化处 理去除抗原成份,制备成具有正常骨的结构排列和 相似的生物力学强度的去抗原异种松质骨(AEXCB) 载体,与骨髓基质干细胞一起体外培养,观察细胞 的生长情况及细胞的相容性,为骨组织_T程中生物 材料的选择提供实验依据. 1材料与方法 1.1去抗原异种松质骨的制备取新鲜新生小牛股 骨下端松质骨,去除软组织,骨髓组织后,锯成15 ×5X5mm大小骨块,自来水冲洗过夜,蒸馏水反复 漂洗2h,沥干.依次经:1:1氯仿/甲醇脱脂12h, 0.6mol/LHCL表面脱钙5min,入37?PBs+NaoH+NaN:, 混合液浸泡24h,37?20%H0.脱蛋白24h,I:I氯 仿/甲醇脱脂12h,最后入37?PBS+Na0h+NaN混合 液浸泡24h,三蒸水反复漂洗后,放入37?恒温干 燥箱中干燥.最后制成5×5X3衄大小骨块,密封 包装,E0消毒备用. I.2骨髓基质干细胞培养健康3月龄新西兰大白 兔2—2.2kg(同济医大实验动物中心).氯胺酮十异 中华实用医学2002年第4卷第2O期 JournalofChinesePracticalMedicine,2002,Vo1.4,No.2O 丙嗪肌注麻醉,无菌条件下在双侧胫骨上端前内侧, 用16号骨穿刺针吸取骨髓共3ml,肝素抗凝混入含 无血清的RPMI1640培养基6ml离心管中,滴管轻 轻吹打,1500r/min离心5min,弃上清液,再中入 RPMI1640完全培养基(含青霉及链霉素各lOOU/ml, 10%新生牛血清)10ml,反复吹打,制成单细胞悬液, 以3×10/ml细胞数接种于50ml培养瓶中,置于37 ?,5%C0培养箱中培养,3—5d首次换液,以后换 用条件培养基(含10mmol/L地塞米松,B一甘油磷 酸钠lOmmol/L,维生素C50ug/m1),每2—3d换液 1次,12d后细胞汇合成单层,用0.25%胰蛋白酶消 化,计数进入传代培养. 1.3细胞接种将传代至第三代细胞以5×10./孔 的细胞数接种于24孔培养板内,实验分为两组:实 验组每孔加入5×5×3mm去抗原异种松质骨材料一 块.对照组单纯接种细胞,每组4孔.于4d,8d后 进行处理,用于观察及检测. 1.4倒置相差显微镜观察逐日观察细胞生长及其 与去抗原异种松质骨附着情况. 1.5扫描电镜(SEM)观察分别于第4,8d将骨粒 取出,2%戊二醛固定,系列脱水,临界点干燥,镀 金膜后进行观察. 1.6MTT法分析复合培养后细胞的成活和增殖能力 按上述要求接种细胞后,于第4,8d向24孔培养板 加入1001MTT(50mg/m1).37?孵育4h,小心 吸出上清液,加二甲亚砜(DMSO)lml,轻轻震荡 lOmin,待结晶溶解后吸出150u1加入96孔板内, 选择波长19Onto酶标仪测定吸光度值,取平均值. 1.7考马斯亮蓝测定细胞蛋白含量于4d,8d将培 养的细胞制成细胞裂解液.取lml考马斯亮蓝染液 与1001细胞裂解液混匀,放置5min.用紫外分 光光度计在595nm波长处测定吸江度值. 1.8碱性磷酸酶(ALP)测定按上述方法接种细胞 后,于第4,8d向培养板内加入200u 10.1%Triton)(一100裂解细胞,按试剂盒说明要求操 作,在酶联免疫仪上,选择490run波长测定吸光度 值,取平均值. 1.9统计方法数据经SPSS10.0软件包处理,结 果以均数?标准差表示,采用t检验. 2结果 2.1倒置相差显微镜观察原代细胞接种后3—5d 首次换液可见散在的短梭形细胞,并有少量三角形 细胞,部分区域形成细胞簇.7,9d细胞大量增殖, 集落逐渐增大,细胞变为长梭形及三角形.12—14d 后,细胞基本融合成单层.细胞传代接种于材料后, 2—3d后可见培养板内细胞增多,体积增大,并向 AEXCB材料移行贴附于材料周边,部分细胞直接贴 附于材料表面.随着时间延长,细胞形成单层,细 胞形态多为梭形及三角形. 2.2扫描电镜观察去抗原异种松质骨材料表面粗 糙,可见大小不等的裂隙与微孔.培养早期可见细 胞附着于材料表面,但分布不均.随着时间延长, 细胞增殖,沿着微孔生长,细胞相互融合,多为长 梭形及多角形,可见细胞遮盖微孔间隙,部分区域 有细胞外基质形成. 2.3细胞增殖,细胞蛋白质含鬣和碱性磷酸酶测定 结果见表1. 表1各组mTT,蛋白质和ALP测定吸光度值(n:4,x?S) 注:实验组与对照组比较p>O.05 3讨论 治疗骨缺损的理想方法是自体骨移植.但自体 骨的来源困难,尤其是长骨缺损,是临床上有待于 解决的难题之一.人工骨属无机材料,虽然有很多 优点,但在人体内吸收缓慢或者不吸收,因此临床 应用受到限制.异种骨来源广泛,取材方便.去抗 原异种松质骨(AEXCB)具有天然的多孔结构,微孔 大小,形状规则.扫描电镜观察,AEXCB具有原骨 的骨小梁,小梁间隙及骨内系统,能够为骨髓基质 干细胞增殖,分化与成骨提供三维空间.具有可塑 性及一定的机械强度,容易加工成所需的形状并有 支撑作用等优点. 体外细胞培养法具有快速,简便,灵敏,重复 性好等优点,并可以直接观察细胞与生物材料复合 生长的情况,利于了解细胞与材料相互作用,有助 于组织工程支架材料的筛选.因此,体外细胞培养 法是近年来研究生物材料相容性的主要方法. MTT试验简便,快速,敏感性高,稳定性好, 避免了细胞计数法,克隆形成试验以及H一胸腺嘧啶 核苷(H-TdR)参入法存在操作复杂和放射性污染 {]华实用医学2002年第4卷第20期 JournalofChinesePracticalMedicine,2002,Vo1.4,No.20’3’ 等缺点,此法通过检测活细胞的数量和其新陈代谢 强度来对活细胞的代谢活性进行,可以较综合, 灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程 度.因此,MTT法已成为细胞生物学及相关研究领 域一种分析细胞活性,增殖及毒性作用等常用的方 法?.本实验MTT和考马斯亮蓝检测表明,AEXCB 对BMSC体外增殖和蛋白质合成无不良影响. 碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化成熟的主要 特征酶之一,对ALP活性的检测是鉴定成骨细胞和 评价其功能活性的重要指标之一….因此,本实验 通过AXECB与BMSC体外复合培养来观察材料是否对 成骨细胞ALP活性的表达有所影响.结果表明AEXCB 对BMSC的生长增殖无明显的干扰作用,对细胞的功 能尤其是对BMSC向成骨细胞转化无影响,这也证明 我们制备的AEXCB材料无细胞毒性.从本实验观察 结果分析,可以初步认为,自行制备的AEXCB材料 无细胞毒性作用,具有良好的生物相容性,可望成 为一种较理想的骨移植替代材料. 参考文献 1CraneGM.Bonetissueengineering.Nature Med,1995:1(12):1322—1324 复合骨在脊柱后外侧融合术中的应用.中国骨 伤,2001;14(2):69—70 3KnabeC,eta1.Morphologicalevaluation ofosteoblastSCUlturedondifferent calciumphosphateceramiCS.BiomaterialS, 1997:18(20):1339—1347 4BergK.Anewsensitivebioassayfor precisequantificationofinterfern activituasmeasuredviathemitochon— drialdehydrogenasefunctionincellS (MTT—method).APMIS,1990:98(2):156—162 5吕晓迎,KappertHF.牙科材料细胞毒性评定 的新方法(MTT试验).中华口腔医学杂志, 379 1995:30(6):377— 6朱文菁,金慰芳,张丽丽,等.MTT法分析培 养成骨细胞的存活和增殖能力.上海医科大学 ,1995;22(4):254-257 7HerbertsonA.AubinJE.Cellsorting enrichesosteogenicpopulationsinrat bonemarrowstromalcel1cultures.Bone. 1997:23(6):419—500 2丁真奇,练克俭,康两奇,等.脱蛋白牛松质(编辑嘉应) ?????????????????????????????????????????????? ?临床医学? 中药外洗治疗9例阴茎 海绵体纤维硬结症状疗效观察 山东省烟台市计划生育科研所264001赵刚王洪武 山东省烟台市中医院周宁 [文章编号]1562—9031(2002)一20—0003—0l 特发性阴茎海绵体硬结症的治疗方法以对症为主.笔者 根据中医基本理论,从1998年以来治疗9例患者,现 如下. 1临床资料 本组9例患者,均以阴茎背侧或近冠状沟部扪及硬结, 阴茎疼痛,捧尿时或勃起时胀痛加重.年龄最大者46岁, 最小者28岁,平均32岁.病程最长6年,最短者1年,平 均2.5年.其中3例勃起时伴有轻度弯曲畸形,2例勃起功 能障碍. 2治疗方法 以活血通络,软坚散结为治则,应用外治法.中药外洗 方:三棱15g,莪术15g,桃仁12g,红花12g,厚朴12g, 白共予log,皂刺lOg,土茯苓30g,上方中药加水2000ml 浸泡60min,然后煎沸30min,取汁500ml,药水温度保持在 35?左右,用中药浸泡阴茎部位30min,每日2次.药汁可 反复加温使用.二日一剂,一一个月为一个疗程. 3疗效分析 9例患者经一个疗程治疗局部硬结变软或缩小者7例, 阴茎胀痛消失者4例.经过二个疗程者6例,局部硬结消失 3例,阴茎胀痛消失4例.经三个疗程4例,局部硬结消失 者3例.2例勃起变曲畸形明显改善,2例勃起功能恢复正 常.经二个疗程以上治疗,硬结消失率66.6%(6/9),胀痛 消失率88.9%(8/9).3例轻度变曲畸形改善2例,2例勃起 功能障碍者,其勃起功能恢复正常. 4讨论 经现代病理学对特发性阴茎海绵体纤维硬结症检验发 现,阴茎硬结是海绵体白膜与阴茎筋膜之间产生的纤维性结 节.其病因目前未能确定,可能与阴茎微循环障碍,微血管 出血或血栓形成,导致血栓机化有关.中医认为此病为寒湿 互结于阴器,久则经络阻滞,气血不畅,蕴结成核,发为硬 结.笔者选用活血通络,软坚散结的中药水剂外洗,直接作 用于局部硬结处,有利于药物的渗透吸收,改善局部的微循 环,促进病灶的软化,修复,吸收,取得了较为满意的临床 疗效. (编辑钟青)