【word】 孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能的影响

【word】 孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能的影响 孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能的影响 繁臻与生壤?ReproductionandPhysiology2007年第43卷第21期 孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能的影响 薛君忠’,孟丹娜,韩国亮2刘烈琴’,张宏’,杨飞鸽’,倪和民 (1.北京农学院动物科学技术系,北京102206;2.北京盛世富民清真食品有限责任公司,北京102200) 摘要:试验探讨孕酮和雌二醇对绵羊精子体外获能和顶体反应的影响.将绵羊精子分别加到含不同浓度孕酮 (1,10和100Ixmol/L)雌二醇(1,10,和100Ixmol/L)的输卵管合成液(SOF)中,作用不同时间后分别取出部分 精子样本进行金霉素荧光染色(chlortetracycline,CTC),通过精子与CTC结合染色的不同类型来评定孕酮和雌二 醇对绵羊精子的作用.结果明:雌二醇对绵羊精子体外获能和顶体反应都没有显着的促进作用(P>0,05);一定 浓度的孕酮和雌激素组合抑制绵羊精子体外获能和顶体反应的发生fp<0.05). ;孕酮;雌二醇;绵羊 关键词:精子获能;CTC染色 中图分类号:S826,3文献标识码:A文章编号:0258—7033(2007)21—0010—04 近年来,有关激素对,ig~L动物精子影响的研究逐 渐增多,尤其体现在人精子的相关研究方面.目前已经 发现在人和其他多种动物精子膜上存在孕酮和雌激素 的受体,同时对孕酮和雌激素的作用机理研究也不断深 入,目前认为孕酮和雌激素是通过与其精子膜上受体结 合而发挥作用的【l】.有关孕酮和雌激素对精子的影响在 人和啮齿类动物上研究比较多,而在其他动物上相对较 少.本试验拟借助CTC染色技术,尝试研究孕酮和雌二 醇对绵羊精子体外获能和顶体反应的具体影响,从而为 改善绵羊精子体外获能方法提供一些试验依据. 1和方法 1.1培养基及试剂绵羊精子获能基础液:采用SOF 工作液. 无机盐系上海化学试剂一厂产品,均为纯.孕 收稿日期:2006—12—31;修回日期:2007—04—03 基金项目:北京市教育委员会科技发展计划重点项目(KZ200510020013) 作者简介:薛君忠(1981一),男,甘肃省靖远县人,硕士生 通讯作者 酮,雌二醇,金霉素(CTC),TriseBase,L一半胱氨酸,丙酮 酸钠,L一乳酸钠,青霉胺,亚牛磺酸,乳酸钙,肝素, BSA,1,4一diazobicyclo[2,2,2】octane(DABCO)均购自 Sigma化学试剂公司. 1,2精液样本精液取自北京市昌平羊场无角道赛 特种公羊. 1.3体外获能和顶体反应用洗精液将新鲜精液稀 释,离心(2000r/min,5min)沉淀2次,除去死精子和细 胞碎片.精子活率达85%以上者用于试验.将精液加入 到含不同浓度孕酮和雌激素的SOF工作液中(含0.3% BSA),放入恒温培养箱中孵育. 1.4染色技术采用Kaul等【的方法将50的精 液加入到50L的CTC液中(750IxmolCTC,130mmol NaC1,5mmolcystine,20mmolTris—HC1,pH为7.4),迅 速混匀;约20s后加入10L多聚甲醛固定液[12.5% (w/v),多聚甲醛iTfis—HC1,pH为7.4],充分混匀;取出 10L滴到载玻片上,加一滴防褪色液(0.22mol/L 1,4diazobicyclo[2,2,21溶于丙三醇:PBS为9:1液中),轻 轻混匀;盖上盖玻片,用吸水纸吸走多余的液体;用无 3.3小梅山猪以体型小,耗料少,产仔多,肉质好而驰 名中外,是最佳专门化母系猪种之一.小梅山猪最佳近 交区域的确定,为今后小梅山猪的正常生存繁衍,专门 化母系培育,小梅山猪目标保种及种质资源的保护等 工作提供了一定的指导依据.我们应有计划地控制每 世代近交增量,将群体平均近交系数控制在15%以内, 一 些优秀种母猪也可控制在19.9%以内,在此近交区 域范围内建立专门化母系,开展猪种选育及目标保种 工作,让小梅山猪这个宝贵猪种资源真正做到健康保 中固耄教絮忿 种,科学建系,合理开发利用. 参考文献: [1】陈清明,王连纯.现代养猪生产[M】.北京:中国农业大学出版社, 2005.96. [2】朱南生,华金弟,李雪元等.新太湖猪选育过程中近交技术的应用及 效应分析[J1.畜牧与兽医,1999,31(1):7-11. [3】盛志廉.论家畜保种叨.当代畜禽养殖业,2005,(6):25-27. [41凌天星,朱洪生,樊月钢,等.小梅山猪产仔模型的研究叨.畜牧 与兽医,2006,38(7):26—27. 2007年第4=;卷篱21瀚 色指甲油封住盖玻片的四周;当日荧光显微镜下计数 (分别在片子的四个角和中间区域,精子数?200个) 并计算各自的百分比. 1.5绵羊精子获能和顶体反应后的CTC染色评价 染色精子分为3种类型:F型为未获能精子,整个精子 头部呈较亮的黄绿色;B型为获能但未发生顶体反应 的精子,精子的头部顶体区呈黄绿色,而顶体后区较 暗;AR型为已发生顶体反应的精子,精子头部后区呈 黄绿色,而顶体区较暗(见图1). 1.6统计学处理结果用均数表示,均数差异的显着 性用DPS数据分析软件分析. 2结果 2.1CTC染色的3类绵羊精子形态见图1. 注:F型为未获能精子;B型为获能但未发生琐体反应的精子; AR型为已发生顶体反应的精子 图1CTC染色的3类绵羊精子形态 2.2不同处理时间和不同浓度的雌二醇对绵羊精子 体外获能的影响由图2可知,1,10和100p~mol/L 的雌二醇对绵羊精子作用不同时间后,获能精子所占 百分数在各试验组和对照组之间不存在显着子作用不同 时间,各试验组中顶体反应的精子所占百分数与对照 组相比,差异不显着(P>0.05),说明雌二醇对绵羊精 子的顶体反应也没有显着影响. 2.41p~mol/L孕酮和不同浓度雌二醇共同作用6h后 对绵羊精子体外获能和顶体反应的影响见图4.结 果表明,1p~mol/L孕酮分别和1,10和100p~mol/L雌二 醇共同对绵羊精子作用6h后,其获能精子所占百分 数分别为37.67%,35.46%和41.41%,只添加孕酮的对 照组为44.82%;各试验组中获能精子所占百分数均低 于对照组,但只有添加10p~mol/L雌二醇的试验组和 对照组差异显着(P<0.05).各试验组中顶体反应精子 所占百分数与对照组相比,差异不显着(P>0.05).说 明一定剂量的孕酮和雌二醇组合对绵羊精子的体外获 能有抑制作用. l4 12 止l0 8 J 6 4 中固鸯藏东惫9 加m \镫 2007年第43卷舅2麓 些配体的结合位点暴露出来.这就可以解释为什么雌 二醇对人精子的作用与精子的功能状态有关. 雌二醇本身对绵羊精子的体外获能和顶体反应没 有明显影响,但是一定量的孕酮和雌激素共同作用绵 羊精子时,抑制绵羊精子体外获能.这说明雌激素在调 解孕酮对绵羊精子的作用时起非常重要的作用.该结 论与Luconi等llJ,Baldi等【9J和Lukoseviciute等?相关研 究结论有类似之处,Luconi等llJ在人精子膜表面上证实 了雌激素受体的存在,并且发现这个受体在受精过程 中调控孕酮的非基因型活动时起很重要的作用;Baldi 等【9I在人上的试验发现,精子与雌二醇作用后就抑制了 由孕酮诱发的钙离子升高和顶体反应的发生,所以他 们也认为在人精子受精过程中,雌二醇在调控孕酮对 精子的作用中起非常重要的作用;Lukoseviciute等【删对 牛精子的研究也发现,孕酮可以诱发牛冷冻精子的体 外获能和顶体反应的发生,雌二醇能够起到稳定膜蛋 白的作用,雌二醇抑制孕酮诱发体外获能和顶体反应 的发生. 总之,目前已经在人和多种动物品种上证实了孕 酮和雌激素受体的存在,在雌性生殖道和卵泡液中存 有少量的孕酮和雌激素,它们很可能直接或间接的影 响精子的生理功能或受精能力,搞清楚它们的具体作 用,有助于我们更清楚地认识和了解受精过程,为改善 体外受精体系提供科学依据.CTC染色技术,虽然能够 区分出不同功能状态的精子,但是不能完全保证它能 够很好的受精,相关研究还需要进一步证实. 参考文献: 『11LuconiM,MuratoriM,FortiG,eto1.Identificationandcharac— ReproductionandPhysi@ogy?攘 terizationofanovelfunctionalestrogenreceptoronhumansperm membranethatinterfereswithprogesteroneeffects叨.ClinEndocrinol Metab,1999,84(5):1670-1678. 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EffectsofProgesteroneandEstrogenonOvineSpermatozoa XUEJun—zhong,MENGDan-na,HANGuo-liangz,LIULie-qin,ZHANGHong,YANGFei-ge,NIHe—min (1.DepartmentofAnimalScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China; 2.BeringShengshiFuminIsiamicFoodCo.Ltd,Beijing102200,China) Abstract:Toinvestigatetheeffectsofprogesteroneandestrogenontheovinespermatozoacapacitationand acrosomereaction,ovinespermatozoawereaddedintoSOFmediumwithdifferentconcentrationsofprogesterone (1,10and100p~mol/L)andestrogen(1,10and100txmol/L),andsomespermsampleswerefetchedrespectivelyand treatedwithCTCpigmentationindifferenttime.Analysisofovinespermcapacitationwasassessedbydifferent stainingspermtypeswithCTC.Theresultsshowedthattheestrogencouldnotenhancetheovinespermcapacitation invitroandinducethespermacrosomereaction;acertainconcentrationwithcombinationofprogesteroneand estrogencouldinhibitovinespermcapacitationandacrosomereactioninvitro. Keywords:spermcapacitation;CTCpigmentation;progesterone;estrogen;ovine 中?鸯教袈怎