类先天性马蹄足动物模型胚胎病理初步研究及病因学意义

类先天性马蹄足动物模型胚胎病理初步研究及病因学意义 类先天性马蹄足动物模型胚胎病理初步研 究及病因学意义 中国康复理论与实践2007年8月第13卷第8期ChinJRehabilT!里!!!,垒:!!!!:!!:?733? ? 基础研究? 类先天性马蹄足动物模型胚胎病理初步研究及病因学意义 贾艳丽h,杜世新,刘戈飞 [摘要]目的在肢体发育不同时段综合多基因相互作用条件下最终导致先天性马蹄内翻足(CCF)发生的原因.方法 77只大白鼠从怀孕第1O天起,将维甲酸石蜡油混悬液经胃管单次注入,建立CCF动物模型;应用光镜,电镜及分子生物学方法检 测胎鼠后肢芽(后肢),胸腰段脊髓.结果动物模型的CCF发病率为61.8,距骨发育停滞,距骨,跟骨间重叠不良和跟骨内翻,后 肢芽及脊髓前角细胞均有凋亡现象.结论CCF在胚胎发育期即有畸形,且程度随生长发育而逐步加重,后肢芽及脊髓前角细胞在 胚胎早期即出现凋亡现象. [关键词]足畸形;先天性;维甲酸;凋亡 PrimaryResearchandEtiologicalImplicationofCongenitalClubfoot-likeModelatPatholo gicalandMoleculeLevelJIAYan—li,DU Shi—xin,LIUGe—fei.eDepartmentofOrthopaedics,theFirstClinicalCollegeofShantouUniversity,Shantou5 15041, Guangdong,China Abstract:0bjectiveToexplorethepossiblecorrelationsundertheinteractionofmulti—genesactionatdifferentstagesandana— lyzetheprimaryhistophotomacrographicchangesofhindbudstissueincongenitalclubfoota ndthepathodynamicdevelopmentalpro— cedure.MethodsSeventy— sevenfemaleWistarratswereadministeredwithretinoicacidonthe10thdayafterpregnancy.Andthe hindlimb,budsandspinalcordweredetectedthroughtransmissionelectronmicroscopicandmolecularbiologicalexperiments.Results Therewasclubfoot-likedeformityin61.8oftheexperimentalanimals.Persistenceoftheembryonicpositionofthetalusandtibia infetuseswasobserved.Pooroverlappingbetweentalusandcalcaneuswasseen.Cellapoptosisattheanteriorcornerofspinalcord andhindbudswereseen.ConclusionCongenitalclubfootdeformitiesappearatearlystageandexaggeratealongwithdevelopmental procedure. Keywords:footdeformities;congenital;retinoicacid;apoptosis [中图分类号]R682.1[文献标识码]A[文章编号]10069771(2007)08—0733—03 [本文着录格式]贾艳丽,杜世新,刘戈飞.类先天性马蹄足动物模型胚胎病理初步研 究及病因学意义[J].中国康复理论与 实践,2007,13(8):733—735. 先天性马蹄内翻足(congenitalclubfoot,CCF)的病因不清, 多数学者认为是由遗传和环境中的致畸因素共同作用导致I1]. CCF晚期距骨滑车往往变低平类似矩形,出现骨关节炎,最终 导致患肢残疾I2].利用全反式维甲酸(atRA)制作的CCF动物 模型与人类新生儿CCF有较好的一致性.本研究从维甲酸投 入第2日(dpc11)起,对胎鼠的后肢芽进行初步组织病理学及 分子生物学分析,从形态,核酸和蛋白质水平研究上述受维甲 酸信号系统调控基因(及尚未报道的基因)的达及其与未使 用维甲酸的对照组胎鼠的区别,以期寻找在肢体发育不同时段 综合多基因相互作用条件下最终导致CCF发生的原因. 1与方法 1.1动物模型建立及分组雌性Wistar大白鼠7O只,体重 22O,230g,平均(230?11)g.随机将动物分为对照组和实验 基金项目:1.广东省卫生厅医学科研基金资助项目(No. A2005445);2.广东省自然科学基金资助(No.5300584);3.广东省科 技项目(No.2OO6B359O1OO8) 作者单位:1.汕头大学医学院第一附属医院a.矫形外科;b.骨科, 广东汕头市515041;2.汕头大学医学院细胞生物实验室,广东汕头市 515031.作者简介:贾艳丽(1967),女,辽宁海城市人,副教授,主要研 究方向:关节损伤.通讯作者:杜世新(1966一),男,辽宁鞍山市人,教授, 博士,主要研究方向:脊柱,关节疾病诊治. 组各7组,共14组,每组5只.大鼠在层流柜中饲养,自由进 食,进水,垫料保持干燥,12h交替照明;所有器具及食物均消 毒,无菌操作.与雄鼠合笼后每天早上6点阴道涂片判断母鼠 是否怀孕,发现精子为受孕0d(dpcO).实验组用维甲酸标准 品(购于SIGMA公司)120mg/kg溶于石蜡油,在大鼠受孕第 1O天灌胃;对照组仅经胃管一次灌注等体积的石蜡油. 1.2标本取材及观察方法分别在大白鼠dpc11,dpc12,dpc 13,dpc15,dpc17,dpc19,dpc21时用戊巴比妥(1ml/kg)麻醉 孕鼠并剖宫取出胎鼠,剥离羊膜,固定取材.对dpc11,12的 大鼠,须在显微镜下取材,固定.切取对照组和实验组胎鼠后 肢芽(dpc12以后的胎鼠)及腰骶段脊髓(dpc15以后的胎鼠), 经过冷冻,组织切片.后肢芽(后肢)分别在三维平面连续切 片,HE染色.脊髓尼氏染色先用4多聚甲醛固定3d,再将 固定好的组织置于平面矫正器上切好平面后浸入2O蔗糖;组 织下沉后转入3O蔗糖;再次下沉后置于冰冻切片30min,贴 于预先处理过的载玻片上.空气中放置1,2d,自然晾干后切 片浸于100氯仿中30min,再浸于100丙酮约15min,经乙 醇脱水,1焦油紫染色,水清洗3次,再经氯仿,分化剂,二甲 苯,中性树胶固封.将切片在光学显微镜下观察并照相,与正 常对照组比较,总结脊髓尼氏小体的演变.另将胎鼠后肢及腰 骶段脊髓(dpcl5以后的胎鼠)经戊二醛固定,包埋,切片定位脊 髓前角;经双重染色后,在透视电镜下观察. ? 734?中国康复理论与实践2007年8月第l3卷第8期 ChinJRehabilTheoryPract,Aug.2007,Vo1.13,No.8 1.3凋亡测定应用末端DNA介导的DIG-dUTP缺口末端 (terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTP, TUNEL)标记法测定后肢芽,后肢,脊髓神经细胞凋亡(凋亡试 剂盒由武汉博士德公司提供).将标本用1O中性缓冲For— malin液固定,石蜡包埋.石蜡切片脱腊入水,新鲜配制3 Hz0z室温处理10min,蒸馏水洗涤2min,共3次;标本片加 TBS1:200新鲜稀释蛋白酶K,37?消化15min,TBS洗涤 2min,共3次;标本片滴加标记缓冲液,混匀,37?标记2h; TBS洗涤2min,共3次;加封闭液,室温处理30min,不洗;加 人生物素化dUTP及终末脱氧核苷酰转移酶(terminaldeoxy— nucleotidyltransferase,TDT)37?反应30min,TBS洗涤 2min,共3次;TBS1:100稀释链酶亲和素一过氧化物酶 (strep—avidin—biotin—peroxidasecomplex,SABC),混匀加片, 37?反应60min;TBS液浸洗5min,共4次;二氨基联苯胺 (doubleamidogenbenzidine,DAB)显色,苏木素复染,TBS,蒸馏 水洗,梯度乙醇脱水,中性树胶封片.先镜下计数TUNEL标 记阳性细胞,标准为细胞核被标记呈棕蓝色,再结合光镜下细 胞形态鉴别阳性细胞中的凋亡细胞(根据凋亡细胞的形态特 征). 1.4统计学处理所得数据以(土5)表示,采用SPSS10.0统 计软件进行t检验或Y检验. 2结果 2.1大体形态学观察实验组共取出胎鼠241只,其中dpc17 以后(dpcl7以前的胎鼠较小)的共15只;共剖出胎鼠llO只, 出现CCF的68只(61.8),其中dpc17为35.4,dpc19为 54.2,dpc21为86.3,马蹄内翻角度(踝角)明显增大;胎鼠 单足发病占67.6,双足为32.3(见表1).对照组共取出胎 鼠455只,其中dpc17以后的共15只;共剖出胎鼠178只,无1 只出现畸形.实验组和对照组的胎鼠外观见封三图3.1,图 3.4.对照组胎鼠的踝角随生长发育逐渐变小,dpc17为(155 ?6.9).(34/59),dpc19为(121土7.9).(33/61),dpc21为(97 ?9.8).(30/58);而实验组则分别为dpc17(162?8.3).(32/ 36),dpc19(144?13).(30/34),dpc21(133?7.1).(29/31),两 组间的差异有显着性意义(P<O.05). 表1不同时间实验组出现畸形胎鼠百分比 [A/F(%),n=241] 注:A/F:畸形胎鼠/胎鼠. 2.2光镜观察对照组:?dpcl7组:距骨内倾程度较轻,矢状 位显示距骨,跟骨开始出现部分重叠,脊髓前角神经元形态及 分布正常,胶质细胞增加;?dpc19组:距骨内倾程度加大,矢 状位显示距骨,跟骨部分重叠,脊髓前角神经元形态及分布正 常,神经元与胶质细胞比例正常;?dpc21组:解剖结构同人类 相似,跟腱位于跟骨后侧,矢状位显示距骨,跟骨明显重叠,脊 髓前角神经元较前明显增大,分布正常,神经元与胶质细胞比 例正常.实验组:?dpc17组:距骨较对照组小,滑车未出现应 有的类圆弧形结构,矢状位显示距骨,跟骨重叠不足;跟骨内翻 较对照组严重,跗骨发育得较小且失正常形态,脊髓前角神经 元减少,胶质细胞增加;?dpc19组:见距骨变小,滑车较平,矢 状位显示距骨,跟骨重叠严重不足;跟骨内翻较前严重,跗骨小 且失正常形态,脊髓前角神经元显着减少,胶质细胞增加;? dpc21组:见踝关节呈马蹄内翻状,距骨变小,滑车变平,前足 切片见胫骨和跗骨在同一解剖面,跟骨内翻严重且距,跟骨间 重叠不良,跗骨小且失正常形态,脊髓前角神经元明显减少,胶 质细胞增加. 2.3实验组透射电镜观察dpc13组:可见实验组肢芽明显小 于对照组,病理切片可见后肢芽组织细胞中有变性,凋亡现象. dpc17组:小腿和足软骨及肌肉细胞中有变性,凋亡现象,距骨 表面软骨细胞出现变性;腰骶段脊髓前角部分神经细胞凋亡, 线粒体及内质网肿胀,染色质边集并浓聚成块等.dpc19组: 小腿和足软骨及肌肉细胞中有变性,凋亡现象,距骨表面软骨 细胞变性;腰骶段脊髓前角有较多的神经元细胞凋亡,线粒体 肿胀,部分嵴缺失;内质网肿胀,染色质边集并浓聚成块等. dpc21组:上述病理现象持续存在并加重.脊髓前角有较多凋 亡神经元细胞,染色质聚集,凝缩,胞核固缩呈一致密物进而碎 裂,严重时丧失正常细胞结构. 2.4TUNEL标记法检测凋亡细胞dpc13组:可见后肢芽组 织细胞中有一定数量的凋亡细胞出现.dpc17组:见小腿和足 软骨及肌肉细胞中有变性,凋亡现象,腰骶段脊髓可见前角神 经细胞凋亡;dpc19组:见小腿和足软骨及肌肉细胞中有较多 的变性,凋亡现象,腰骶段脊髓较多前角神经细胞凋亡.dpc21 组:脊髓前角有大量凋亡细胞,散落在正常细胞间;凋亡细胞变 小,胞浆凝缩;染色质聚集,凝缩,胞核固缩呈均一致密物,形成 凋亡小体. 3讨论 CCF病因不清,被认为是遗传因素和环境因素共同作用而 引起的先天性疾病.大量报道显示,维甲酸是胚胎发育过程中 的内源性形态原(morphogen),通过调控Hox基因及其他诸多 相关基因决定肢芽,颅面部骨骼,中枢神经系统等器官,系统的 形成.同时,维甲酸缺乏和过量都可导致胚胎畸形.尽管国内 外用高浓度维甲酸成功制作大鼠CCF模型,并进行各种机制研 究的报道较多『3],但在胚胎早期从病理和基因水平研究其发病 机制尚未见报道.Delgado给孕鼠维甲酸120mg/kg体重, CCF发生率为86.5,神经管畸形率75.7,并发现胚胎期后 肢的旋转异常『4].Santos—Alvarez采用同样的方法和剂量,CCF 发生率为9O,并对dpc15胚胎后肢进行了抗索蛋白(desmin) 的免疫组化检测,有丝分裂活性与核仁硝酸银染色测定__5].Yu 等以125mg/kg剂量维甲酸引发的CCF与神经管畸形发生率 分别为9O和55,同时,还观察到许多其他系统的畸形__6]. 在本实验中,实验组胎鼠CCF发生率为6l_8,可能与认定标 准差异有关.胚胎早期的后肢芽发育过程显示,后肢芽明显发 育不良,早期即出现组织细胞凋亡.在CCF胎鼠脊髓中发现, 前角神经元减少,胶质细胞增多,有较多前角细胞凋亡.换言 之,在胚胎发育早期,通过维甲酸干预后,胚胎的脊髓及胚芽均 已出现病变. 肢体发育是一个极其复杂的多基因调控过程,涉及不同时 间和不同空间的若干基因先后表达,因而研究肢芽发育的意义 中国康复理论与实践2007年8月第13卷第8期ChinJRehabilTheoryPract,Aug.2007,Vo1.13,No.8 在于,肢芽的正常发育应是许多相关基因受到维甲酸精密调控 的结果.哺乳动物孕期维甲酸缺失或摄人过多都可引发畸形, 在不同发育阶段投入过量的维甲酸可引发不同的畸形.给怀 孕10d的正常大鼠经胃灌注1.0,140mg/kg维甲酸能建立较 为典型的CCF模型L7].考虑到外源性维甲酸在大鼠胚胎体内 的半衰期(12h)和完全清除期(72h)_8],胚胎10.5,13.5d期 间是维甲酸主要作用时期,而且此期间正是后肢芽细胞分化刚 刚定型并有后肢芽出现.因此,对这一发育阶段的分析研究至 关重要.维甲酸在胚胎发育中具有重要作用,是肢芽,颅面部 骨骼,中枢神经系统等器官,系统正常发育的内源性形态原_g]. 在肢芽尖外胚层嵴(apicalectodermalridge,AER)的整个形成 过程,极化活性区(zoneofpolarizingactivity,zPA)形成早期都 有维甲酸信号传导系统发挥作用.维甲酸作为内源性形态原, 其主要作用是通过调控Hox基因家族的表达来实现的L1.对 肢芽中HoxD和HoxA的时空顺序表达,维甲酸起直接或间接 主导作用_1.而Hox基因调控区域(retinoicacidresponseele— ments,RARE)的细微不同,可能是导致不同Hox基因对维甲 酸反应不同的根本所在_1.在出现CCF的胎鼠脊髓中,发现 了一系列病理改变_1,CCF及其伴发的神经管发育异常均位于 胚胎期尾芽发育的部位.而在临床上,CCF患儿大多存在不同 程度的神经电生理异常,且多数病变位点源于腰骶部脊髓,部 分来源于腰骶部以上脊髓节段_1.最近,孙开来研究小组用蛋 白质组学的方法检测大鼠CCF模型中已发育成型的踝关节骨 与组织和脊索的变化,发现了3种蛋白:x连锁凋亡蛋白抑制因 子(X-linkedinhitor-of-apoptosisprotein,XIAP),骨骼肌肌钙 蛋白T(troponinTisoforms,sTnT),Co12alpha1的差异表 达_1,这可能是一个后期的结果.由于腰骶段脊髓与肢芽的发 育时间接近,又有共同的Hox基因家族参与,因此发生脊髓病 变也属正常现象.单从动物模型腰骶椎脊柱裂畸形与CCF的 发生率来看,不能说腰骶椎脊柱裂畸形与CCF有因果关系. CCF是由遗传因素和环境中的致畸因素共同导致的.用 正常大鼠建立的CCF模型,利用了过量维甲酸的致畸作用.那 么,维甲酸致畸的机制是什么?尽管大量实验证明,维甲酸调 控上述许多与发育成形有关的基因,但在复杂的胚胎发育内环 境中,过量(而且异位,因维甲酸在体内的合成有时空特性,有 浓度梯度)的维甲酸对相关基因的综合调控的细节尚不得而 知.由于与人类新生儿CCF有较好的一致性,若能够利用模型 发现某(些)相关靶基因上下调是CCF表现型的成因,则对遗传 因素的阐明大有裨益. [参考文献] [1]杜世新,吉士俊,孙开来.实验性先天性马蹄内翻足的病因病理研究 EJ].中华骨科杂志,2003,22(7):44O一442. r2]DeLaurierA,SchweitzerR,LoganM.Pitx1determinesthemor一 ? 735? phologyofmuscle,tendon,andbonesofthehindlimb[J].DevBiol, 2006,299(1):2234. [3]ReijntjesS,BlenticA,GaleE,eta1.Thecontrolofmorphogensig— nalling:regulationofthesynthesisandcatabolismofretinoicacidin thedevelopingembryo[J].DevBiol,2005,285(1):224237. [4]Delgado—BaezaE,Santos—AlvarezI,Martos—RodriguezA.Retinoic acid—inducedclubfoot—likedeformity:pathoanatomyinratfetuses [J].JPediatrOrthopB,1999,8(1):1218. [5]Santos—AlvarezI,Martos—RodriguezA,Delgado—BaezaE.Embryon— icblastemicchangesinretinoicacid—inducedhindlimbdeformity[J]. CellsTissuesOrgans.2003,173:217,226. 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