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不同条件延缓未受精卵激活对鱼类细胞电融合的影响_cropped

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不同条件延缓未受精卵激活对鱼类细胞电融合的影响_cropped不同条件延缓未受精卵激活对鱼类细胞电融合的影响_cropped Vol1 26 No1 6 第 26 卷 第 6 期湛江海洋大学学报 Dec 2006 2006 年 12 月 J o u r nal of Zha njia ng Ocea n U nive r sit y 不同条件延缓未受精卵激活对鱼类 细胞电融合的影响 吴滟 ,傅洪拓 ,龚永生 ,何新龙 ,熊贻伟 ( )中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 ,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室 ,江苏 无锡 214081 摘 要 :泥鳅未受精卵先在合成...
不同条件延缓未受精卵激活对鱼类细胞电融合的影响_cropped
不同条件延缓未受精卵激活对鱼类细胞电融合的影响_cropped Vol1 26 No1 6 第 26 卷 第 6 期湛江海洋大学学报 Dec 2006 2006 年 12 月 J o u r nal of Zha njia ng Ocea n U nive r sit y 不同条件延缓未受精卵激活对鱼类 细胞电融合的影响 吴滟 ,傅洪拓 ,龚永生 ,何新龙 ,熊贻伟 ( )中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 ,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室 ,江苏 无锡 214081 摘 要 :泥鳅未受精卵先在合成卵巢液 、郝氏液中分别浸泡 15 、20 、30 min ,然后再受精孵化 ,统计发育情况 ,结果表 明 ,合成卵巢液可有效延缓未受精卵遇水后被激活的时间 ,郝氏液对延缓未受精卵被激活也有一定作用 ,但效果比 合成卵巢液差 。用合成卵巢液配制不同浓度胰酶处理受体卵进行细胞电融合实验 ,胰酶质量浓度为 5 mg/ mL 时 , () ( ) 融合卵发育至囊胚期的比例比对照组 郝氏液高 2 % ,统计分析表明该差异是显著的 P < 0 . 05;但发育至原肠期 及孵出期的比例则与对照组无显著差异 。胰酶质量浓度为 2 和 1 mg/ mL 时 ,融合卵发育到各阶段的比例均低于 ( ) 对照组 ,统计分析表明两者的差异是显著的 P < 0 . 05。研究表明 ,溶液种类 、胰酶浓度等对电融合卵的发育有明 显的影响 ,但延缓受体卵的激活时间并不能提高电融合卵的出苗率 。用郝氏液配制的 2 mg/ mL 的胰酶溶液处理 受体卵 ,可获得较高比例的融合鱼 。 关键词 :细胞电融合 ;鱼类未受精卵 ;激活 ;胰酶 ;泥鳅 () 文章编号 :1007 - 7995 200606 - 0001 - 04 中图分类号 : Q831 + S961 文献标志码 : A Ef f ect on Fish Cell Electrof usion by Dela yed Act ivat ion Time f or Unf ert il ized Oocytes un der Diff erent Condit ions WU Ya n , FU Ho ng2t uo , GO N G Yo ng2she ng , H E Xi n2lo ng , XION G Yi2wei ( Ke y O p e n L abo r at o r y o f t he M i nis t r y o f A g ri c u l t u re A q u at i c A ni m al Ge net i cs a n d R e p ro d uc2 t i on a n d A q u ac u l t u re B i ol o g y , F res h w at e r Fis he ri es R ese a rc h Ce nt e r o f t he C h i nese A c a de m y o f )Fis he r y S ci e nces , W u x i 214081 , C h i n a Abstract : U nf e rtilize d oocyt e s of loach P r a r a m is g u r n us d ab r y a n us we re soc ked i n synt hetic o va r2 ( ) ia n f l ui d SO Fa nd Holf ret e r ’s sol utio n fo r 15 , 20 o r 30 mi n ut e s re sp ectivel y befo re f er tiliza2 tio n . The re sult s sho wed t hat SO F eff ective dela yed activatio n ti me of oocyt e s af t er bei ng i n wa2 t e r ; a nd Holf ret er’s sol utio n al so ha d so me eff ect s , but no t so efficie nt a s SO F . The oocyt e s , w hich were di ge st ed by diff ere nt co nce nt ratio n s of Tr yp si n , u sed a s recipie nt1 Fu sio n e xp eri me nt s i ndicat e d t hat Tr yp si n w ho se ma ss co nce nt ratio n i s 5 mg/ mL i n SO F , i n co mp a ri so n wit h t he ( ) co nt rol gro up Holf ret e r ’s sol utio n , no ticea bl y rai sed t he develop me nt rat e of f u sed e ggs to ( ) bla st ula st a ge . The st ati stical a nal ysi s sho wed t he diff ere nce i s o bvio u s P < 0 . 05. The ratio s of f u se d oocyt e s develop ed to ga st r ula a nd hatc hi ng st a ge s , ho weve r , were no t so diff e re nt wit h t he co nt rol gro up . In a dditio n , w he n t he ma ss co nce nt ratio n of Tr yp si n were 2 a nd 1 mg/ mL , t he ra2 tio s of f u sed oocyt e s develop ed to va rio u s st a ge s we re all lo wer t ha n t ho se of t he co nt rol gro up , ( ) t he st ati stical a nal y si s i ndicat ed t he diff e re nce s were si gnifica nt P < 0 . 05. Thi s p ap e r de mo n2 st rat e d t hat t he t yp e s of sol utio n s a nd co nce nt ratio n s of Tr yp si n have o bvio u s eff ect s o n t he de2 velop me nt of elect rof u sio n oocyt e s , b ut t he delayed activatio n ti me of recipie nt oocyt e s wo ul d no t 收稿日期 :2006202227 ( ) ( ( ) ) 基金项目 :瑞典国际自然科学基金 I FS资助 A/ 264621;973 协作 G2000016109。 ( ) 第一作者 :吴滟 1977 - ,女 ,助理研究员 ,主要从事鱼类遗传育种研究 。E2mail : wuy @ff rc1 cn 。 ( ) 通讯作者 :傅洪拓 1964 - ,男 ,博士 ,研究员 ,主要从事鱼类遗传育种研究 。E2mail :f u ht @ff rc1 cn 。 rai se t he hat c hi ng rat e . The recipie nt oocyt e s t reat e d wit h 2 mg/ mL Tr yp si n a dmi ni st rat ed by Holf ret e r’s sol utio n mi ght achieve hi ghe r rat e of f u se d fi sh . Key words : cell elect ro2f u sio n ; unf er tilized oocyt e s of fi she s ;activatio n ; Tr yp si n ;loach P a r m is g u r2 n us d abr y a n us 细胞融合技术是 20 世纪 60 年代发展起来的一L2酪氨酸 、苷氨酸 ,均为分析纯 ,上海化学试 氯化镁 、 [ 1 ] 门崭新的细胞工程技术 。Se nda 等首次利用显微 剂公司生产 ; 胰蛋白酶 ,Difico 产品 ,进口分装 ;B SA ?、?,进口分装 ,上海生化所西巴斯公司产品 。操作器使植物原生质体在电刺激下融合 ,后经 Zi m2 [ 2 ,3 ] 11 3 主要溶液配方me r ma nn 等改 进 , 建 立了 细胞 电融 合 方法 。由 [ 7 ] 合成卵巢液参照 A1 B1J1 Bo nger s等研制的配 于电融合技术具有操作简便 、对细胞无毒 、高效 、同 ( ) 方 ,略有改进 ;郝氏液 Holf ret e r ’s sol utio n为用氯 步性好 、易于控制以及整个融合过程可以在显微镜 [ 3 ,4 ] 化钠 1 g 、氯化钾 1 g 、无水氯化钙 1 g 及双蒸水配成下观察等优点, 已被 广泛 应 用于 动植 物及 微 生 1 000 mL 的原液 ,工作液为稀释 10 倍的原液 ,再加物的细胞杂交研究 。 [ 6 ] 2 g 碳 酸 氢 钠 。催 产 液 取 脑 垂 体 41 5 mg 、H C G 1988 年 ,刘沛霖等首先报道了利用自制电融 μ4 950 U 、L H2R H2A51 2g 混合 ,加 7 mg/ mL 的生 合装置诱导鱼类细胞融合 ,其融合率和细胞存活率 2 ( ) 理盐水配制成终体积 12 mL 。 均明显高于聚乙二醇 P E G介导的融合 。后来易泳 [ 5 ] 兰等对影响供体细胞和受体卵融合的有关因子进 行了比较 ,并且以囊胚细胞为供体 ,获得了较高比例 2 方法 的融合鱼 。 21 1 泥鳅催产 尽管我国在鱼类细胞电融合上已取得了较大的 [ 6 ] 每次催产选用 12 条泥鳅 ,为确保实验时雌性泥进展,但电融合的成功率仍相当低 。影响电融合 鳅能产出足够量的成熟未受精卵 ,取雌雄比 1 ?1 ,成功率的因素很多 ,包括供体细胞和受体卵的质量 、 于每晚 22 : 30 注射催产液 ,雌性泥鳅注射 01 6 mL , 供体和受体细胞周期的配合 、二者的遗传背景等 ,低 雄性泥鳅注射剂量减半 。水温为 25,28 ?,效应时 成功率限制了该技术在鱼类育种中的应用 。研究表 (间为 10,16 h 。 明 ,鱼类未受精卵遇水后瞬间即自发激活 即自发启 ) 动发育进程 ,卵具有受精发育的能力,遇水时间越 21 2 延缓未受精卵被激活时间的浸泡实验 [ 7 ] 从成熟的雌泥鳅中挤出约 900 颗未受精卵 ,平 长 ,其受精发育的能力越低,但有关受体卵被激活 均分成 9 盘 ,再分成 3 组 ,每组分别用合成卵巢液 、程度对电融合卵发育的影响则迄今未见报道 。笔者 ( ) 郝氏液和曝气水浸泡 ,时间各为 15 、20 、30 mi n 后再研究大鳞副泥鳅 P a r a m is g u r n us d abr y a n us 未受 湿法受精 ,置于曝气水中培养 ,以曝气水为对照组观 精卵被激活条件对电融合的影响 ,为鱼类细胞电融 察 、统计其发育情况 。每次实验前用干法受精检查 合参数的优化提供参考资料 。 卵的质量 ,卵的为发育率在 60 %以上 。 21 3 不同胰酶浓度的电融合实验1 材料 21 31 1 实验仪器 极化注射仪2 ?型 ,中国科学院 武汉分院计算机 技术 开 发公 司制 造 。电 融 合槽 是 11 1 实验鱼 ( ) 大鳞副 泥 鳅 P.28 mm ×7 mm ×21 5 mm 的长方形有机玻璃小槽 ,d abr y a n us, 发 育 成 熟 , 体 长 电极为直径 01 5 mm 、长 28 mm 的铂金丝 ,平行嵌入 12,15 c m ,240 尾 ,雌雄各半 ,实验前在水泥池中驯 养 1 周 。小槽两侧 。 [ 6 ] 11 2 化学试剂21 31 2 电融合方法 参照刘沛霖等的方法进行 。 脑垂 体 , 采 自 鲤 鱼 , 自 制 ; 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素将催产 16 h 后的成熟雌 、雄泥鳅进行人工体外 ( ) H C G,上海丽珠东风生物技术有限公司产品 ; 促 干法受精 ,所得的受精卵置于 14 ?培养箱内发育至 () 黄体素释放激素 AL H2R H2A,宁波市激素制品囊胚期作为供体细胞的来源 。 2 2 30 颗脱 膜 洗净 的卵 进行 离 心处 理 , 分散 成 单 个 细30 mi n 时 ,其发育到各阶段的比例分当时间增加到 ) ) 胞 ;4分别用郝氏液 、电极液清洗细胞各 1 次 ; 54别比对照组高 341 7 % 、221 5 % 、51 6 % 。尤其是发育 ?下保存备用 。至囊胚的比例 ,随时间延长还逐渐增加 。研究表明 用合成卵巢液浸泡 15 mi n 效果较佳 。 受体卵为成熟的未受精卵 ,用郝氏液和合成卵 未受精卵在郝氏液中浸泡 15 mi n 后再受精 ,其 巢液分别配制质量浓度 5 、2 和 1 mg/ mL 的胰酶在 到囊胚期 、原肠期 、孵出期的平均发育率分别比对照 25 ?的恒温培养箱中脱膜 ,待用 。 组高 161 6 % 、201 7 % 、31 6 % ; 当浸泡时间增加到 20 21 31 3 实验结果分析 采用二项资料的百分数假 mi n 时 ,其到囊胚期 、原肠期 、孵出期的平均发育率 设测验来进行统计分析 。若实验组百分数假设检测 分别比对照组高 201 0 % 、161 7 % 、21 8 % 。当时间增 U 大于 U , 则 P 值小于 01 05 , 表示 值的绝对值 01 05 加到 30 mi n 时 ,其发育到各阶段的比例分别比对照 实验组于对照组差异显著 ; 若实验组百分数假设检 组高 141 9 % 、131 3 % 、11 2 % 。表明用郝氏液浸泡尽 测值的绝对值 U 小于 U , 则 P 值大于 01 05 , 表 01 05 管对延缓未受精卵被激活有一定作用 ,但效果比合 示实验组于对照组差异不显著 。 成卵巢液差 。 可见 ,未受精卵随着在溶液中浸泡时间的延长 , 3 结果 其受精后发育到各发育阶段的比例逐步下降 。与对 照组比较 ,合成卵巢液延缓未受精卵遇水被激活的 311 3 种浸泡液对延缓未受精卵遇水被激活的效果 效果较好 ,郝氏液作用不明显 。 未受精卵在 3 种溶液中浸泡 15 mi n 、20 mi n 、30 31 2 不同浓度胰酶脱膜对电融合的影响mi n 后再受精的结果见表 1 。由表 1 可见 ,未受精卵 选择对未受精卵有延缓激活时间的合成卵巢液 在曝气水中浸泡后再受精 ,其发育率随浸泡时间增 来配制不同浓度的胰酶作为脱膜液 ,以郝氏液作为 加而下降的幅度较大 ,且没有孵出小鱼 。 对照进行电融合实验 ,每种浓度的实验均重复 5 次 。 结果发现 ,与对照组相比 ,合成卵巢液仅能提高经 5 表 1 种浸泡液对延缓未受精卵遇水被激活的效果比较 3 mg/ mL 胰酶液处理的融合卵到囊胚期的平均发育 Eff ect of the unf ertil ized eggs activated by contacting Ta b1 1 with diff erent solutions % 率 ,而发育至原肠期 、孵出期以及经 2 和 1 mg/ mL 胰酶液处理的融合卵到各阶段的平均发育率 ,都比 曝气水 浸泡 合成卵巢液郝氏液 ()发育对照组 对照组低 。从提高出苗率来看 ,经对照组配制的经 时间平均平均对比平均对比 阶段 2 mg/ mL 胰酶溶液处理的受体卵电融合效果较好/ min 发育率 发育率 值 发育率 值 () 表 2。囊胚期381 4 1 7 1 7 55 1 6 642616 原肠期 261 2 541 6 281 4 201 7 15 461 9 表 2 不同浓度胰酶脱膜对电融合的影响 孵出期 01 0 391 5 391 5 31 6 31 6 1 2 Eff ect of removing egg envelopes in diff erent Trypsin Tab 囊胚期301 0 1 5 1 5 1 0 1 0 on the electro2f usion 62325020 原肠期 平均发育率/ %231 3 501 6 271 3 401 0 161 7 20 胰酶浓度/ 孵出期 发育阶段对照组合成 21 01 0 121 6 121 6 21 8 21 8 ( )mg 〃mL () 郝氏液卵巢液 201 6 1 3 1 7 1 5 1 9 55343514囊胚期 91 00 1 00 11囊胚期 原肠期 161 7 391 2 221 5 301 0 131 3 30 5 41 10 31 30 原肠期 孵出期 孵出期 01 31 01 30 01 0 51 6 51 6 11 2 11 2 51 00 1 00 2囊胚期 - 注 :对比值 = 实验组 对照组 41 10 21 10 2 原肠期 孵出期 21 01 01 07 囊胚期61 60 1 60 3 未受精卵在合成卵巢液中浸泡 15 mi n 后再受 1 51 80 31 00 原肠期 孵出期 11 63 01 75 精 ,其到囊胚期 、原肠期 、孵出期的平均发育率分别 比对照组 高 261 7 % 、281 4 % 、391 5 % 。当 浸 泡 时 间 增加到 20 mi n 时 ,其到囊胚期 、原肠期 、孵出期的平 由表 2 可见 ,用合成卵巢液配制经 5 mg/ mL 胰 酶液处理的融合卵发育至囊胚期阶段的平均比例为 均发育率分别比对照组高 321 5 % 、271 3 % 、121 6 % 。 ,发现两者基本成分相近 ,均为无机盐液的主要成分 111 0 % ,比对照组高 21 0 % 。发育至原肠期 、孵出期 的平均比例分别比对照 组低 01 8 % 、01 01 % 。统 计离子 。但合成卵巢液还多了 ED TA 和氨基酸 ,而这 两个成分都可络合拮抗水中的金属阳离子 。从这角 , 发 育 到 囊 胚 期 的 U = 21 11 > U = 分析表 明 01 05 度推断 ,水中金属阳离子的减少可延缓未受精卵被 11 96 , P 值小于 01 05 , 显示合成卵巢液处理电融合 卵发育至囊胚期的比例显著高于对照组 。发育到原激活的时间 。但具体机理还有待进一步研究 。 21 用合成卵巢液配制的 5 mg 〃mL的胰酶液消 肠期的 U = 11 34 < U 01 05 , 孵出期的 U = 01 057 < U 01 05 , 在这两个发育阶段的 P 值均大于 01 05 , 表明 化卵膜 ,然后进行融合 ,融合卵发育至囊胚期的比例 在这两个阶段合成卵巢液处理的作用不明显 。 用高于郝氏液对照组 ,但发育至原肠期及孵出期的比 合成卵巢液配制经 2 mg/ mL 胰酶液处理的 例则与对照组无显著差异 。当胰酶质量浓度为 2 或 21 融合卵发育至囊胚期 、原肠期和孵出期的比例分别1 mg 〃mL时 ,对照组各阶段的发育率均高于实验 为 21 0 % 、21 1 %和 01 07 % ,分别比对照组低 31 0 % 、组 。囊胚期之前的发育主要是进行细胞分裂 ,适当 21 0 %和 11 94 % 。统计分析表明 , 发 育到 囊胚 期 的浓度的胰酶对细胞分裂具有一定的作用 ,而原肠期 U = 31 65 U 及孵出期的发育以细胞分裂为主 ,故胰酶的作用不 = 51 16 > U = 11 96 , 到原肠期的 01 05 大 。至于胰酶的用量和作用效能则有待深入探讨 。> U , 孵出期的 U = 61 05 > U , 3 个发育阶段 01 05 01 05 () ,溶液种类 、胰酶浓度等对电融合卵的发本研究表明 的 P 值均小于 01 05 , 表明对照组 郝氏液处理的融 合卵在这些发育阶段的比例都比合成卵巢液处理的 育有影响 ,但延缓受体卵的激活时间并不能提高电 融合卵高 ,且差异显著 。同样的结果也出现在经 1 融合卵的孵出率 。 mg/ mL 胰酶液处理的电融合试验中 ,对照组效果较 细胞电融合技术在鱼类中的应用还刚刚开始 , 好 ,且差异显著 。 是鱼类遗传育种的一条潜在的新途径 。但由于很低 的成功率 ,离实用阶段尚有较大距离 ,需要优化融合 条件和相关技术参数 ,进一步提供融合率和出苗率 ,4 讨论 为通过细胞电融合进行细胞工程育种提供条件 。 鱼类繁殖季 节 长 , 产卵 量多 , 同 时 鱼 类 体 外 受 参 考 文 献 精 ,便于观察发育过程 ,尤其是泥鳅 ,它四季均可进 [ 1 ] Senda M , Ta keda J , A be S , et al1 Inductio n of cell f u sio n of 行人工催产 ,给胚胎细胞与卵的融合研究带来了很 pla nt p ro topla st s by elect rical sti mulatio n [ J ]1 Pla nt a nd cell 大便利 。因此 ,鱼类是理想的细胞融合研究材料 。 p hysiolo gy ,1979 , 20 : 1441214431 自 1988 年首次将电融合法应用于鱼类细胞的 [ 2 ] Zi mmer ma nn U1 Elect rical brea kdo w n elect rop er mea bilizatio n 融合 ,经过不断的研究 ,电融合方法得到了更新 ,融 a nd elect rof u sio n [J ] 1 Rev Physiol Bioche m Phar macol , 1986 , 合率也在逐步的提高 。但鱼类细胞电融合的成功率 105 : 17522561 [ 3 ] Zi mmer ma nn U , Vien ken J1 Elect ric fiel d2i nduced cell2to2cell 目前还是较低 ,限制了该项技术的实际应用 。石连 [ 8 ] f u sio n [J ]1 J o ur nal of me mbrane boplo gy , 1982 , 67 :16521821 玉等进行了草鱼未受精卵的细胞电融合 , 在 673 [ 4 ] 刘沛霖 ,易泳兰 ,刘汉勤 ,等 1 鱼类细胞电融合的初步研究[ J ]1 粒草鱼实验卵中发育至囊胚期 、孵出期的比例分别 ( ) 水生生物学报 ,1988 , 12 1: 942961 为 61 69 %和 11 19 % 。笔者通过延缓未受精卵的激 [ 5 ] 易泳兰 ,刘沛霖 ,刘汉勤 ,等 1 鱼类囊胚细胞与卵的电融合[ J ]1活时间 ,在最优化条件下融合卵发育至囊胚期 、孵出 ( ) 水生生物学报 ,1988 ,12 2:18921921 ( [ 6 ] Fu Ho ngt uo , Wu Chi ngjia ng1 N uclea r t ra n sf er i n loach Pa2 期的比例分别为 91 00 % 、21 01 % , 在 一定 程度 上 提 ) ra m is g u rn us d abr y an us Sauvage by ceil2to2cell elect rof u sio n 高了融合卵的发育率 。 通过泥鳅未受精卵浸泡受[J ]1 Aquacult ure resea rch , 2001 , 32 : 26722751 精实验 ,发现在合成 [ 7 ] Bo nger s A B J , Ki ng T J1 A ndro genesi s i n co mmo n ca rp u si ng 卵巢液中浸泡后再受精的卵 ,其出苗率明显高于对 U V i r radiatio n i n synt hetic o va rian fl uid a nd heat shock s [J ]1 () 照组 浸泡于曝气水中,表明合成卵巢液可有效地 Aquacult ure , 1994 ,122 :11921321 [ 8 ] 石连玉 ,尹洪滨 ,范兆廷 ,等 1 鱼类培养的体细胞与成熟卵的电 延缓未受精卵遇水后被激活的时间 。郝氏液对延缓 ( ) 融合技术研究[J ]1 水产学杂志 , 1993 ,6 1:372401 未受精卵遇水后被激活的时间也有一定的作用 ,但 效果明显弱于合成卵巢液 。比较合成卵巢液和郝氏
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